人羊膜間充質(zhì)干細胞改善高齡小鼠睪丸功能的實驗研究

張月鑫，劉菡文，施陳楠，寧松，周靜，李楚玉，楊曉玉，覃蓮菊，劉嘉茵，胡艷秋，崔毓桂

中老年男性雄激素水平降低，發(fā)生類似女性圍絕經(jīng)期的臨床表現(xiàn)，尤其以性功能下降顯著，生育力也隨年齡而減退[1]。對于女性，生育力隨年齡增大而衰退，以圍絕經(jīng)期閉經(jīng)結(jié)束；而對于男性，生育力減退是一個漸進的過程，生育力不會完全喪失[2]。中老年男性生育力減退主要表現(xiàn)為睪丸組織形態(tài)學(xué)改變、雄激素合成功能降低、精子參數(shù)異常和精子DNA碎片化增多等[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，中老年男性生育力減退與其配偶的低妊娠率和高流產(chǎn)率有關(guān)[6]。顯然，延緩睪丸老化并非補充外源性雄激素那樣簡單，如何修復(fù)中老年睪丸的精子發(fā)生和雄激素合成的功能，是當前男性生殖內(nèi)分泌領(lǐng)域的難題，干細胞治療已然成為研究熱點之一。人羊膜間充質(zhì)干細胞（human amnion mesenchymal stem cells，hAMSC）是一類具有自我更新和多能性的特殊細胞，具有免疫原性低，易于獲得，能分泌大量細胞因子等特點[7]。已有研究證實，間充質(zhì)干細胞能夠治療細胞損傷，修復(fù)老化細胞；骨髓、臍帶、脂肪、胎盤等多種來源的間充質(zhì)干細胞移植，能夠改善男性不育[8]。有關(guān)羊膜間充質(zhì)干細胞能否延緩中老年男性睪丸功能減退的研究非常少，特別需要更多實驗研究結(jié)果的支持。本研究使用hAMSC治療自然高齡的雄性小鼠，觀察治療前后血清睪酮水平變化、精子質(zhì)量、睪丸組織學(xué)改變以及雄激素合成功能的變化，為hAMSC后期應(yīng)用于中老年男性睪丸功能減退治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑迪夫快速染色液購于珠海貝索生物公司，蛋白裂解液及SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、封閉用山羊血清購于碧云天公司，蛋白酶抑制劑購于賽默飛公司，特超敏ECL顯影液購自UE公司，含DAPI封片液購自SBA公司，鼠抗人STEM121單克隆抗體購自寶日醫(yī)公司，兔抗人CD105單克隆抗體、鼠抗鼠類固醇激素生成急性調(diào)節(jié)蛋白（StAR）多克隆抗體購自艾博抗公司，鼠抗鼠17β-羥基類固醇脫氫酶（17β-HSD）單克隆抗體購自圣克魯斯公司。

1.2 實驗動物10周齡體質(zhì)量25 g左右和32周齡體質(zhì)量35 g左右C57BL/6J雄鼠購于維通利華公司，飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)SPF級動物房中，光照12 h，自由飲食。10周齡小鼠，相當于人20歲左右，作為年輕對照組。購買動物中心育種淘汰的雄性種鼠，年齡為32周齡雄性小鼠，經(jīng)歷1周適應(yīng)性飼養(yǎng)和3周延長期培養(yǎng)達到36周齡（9個月，生育力顯著降低），相當于人男性50歲以上，作為雄鼠生育年齡“高齡”的模型。

1.3 hAMSC的鑒定和質(zhì)量控制hAMSC細胞的制備參考本中心之前的研究[9]。流式細胞術(shù)進行細胞表面分子標志物的鑒定。檢測基因包括血管細胞相關(guān)標志物（CD11b、CD19、CD34、CD45）、間充質(zhì)干細胞表面標志物（CD44、CD73、CD90、CD105）和免疫排斥相關(guān)的表面標志（HLA-DP/DQ/DR）。臺盼藍染色法進行細胞活力鑒定。

1.4 hAMSC細胞運輸和治療過程31只36周齡雄鼠隨機分為5組，分別為生理鹽水對照組、1%人血清白蛋白對照組、3.4×106hAMSC細胞/kg治療組（低劑量組）、6.7×106hAMSC細胞/kg治療組（中劑量組）、1.4×107hAMSC細胞/kg治療組（高劑量組），其中生理鹽水對照組3只，其余各組每組7只。hAMSC細胞以1%人血清白蛋白的生理鹽水制成混懸液，細胞濃度分別為4.2×105/mL、8×105/mL和17×105/mL，分裝于1.5 mL的EP管中，使用37℃恒溫手提式溫箱運輸至南京醫(yī)科大學(xué)動物房進行細胞注射。注射體積300μL；細胞注射結(jié)束，再用15μL生理鹽水沖洗注射管，使細胞全部進入小鼠體內(nèi)。每周注射1次，共注射4次。治療結(jié)束后，繼續(xù)飼養(yǎng)5周（相當于1個生精周期）后處死，此時小鼠為44周齡。稱量小鼠體質(zhì)量，眥內(nèi)采血1 mL。處死小鼠，雙側(cè)睪丸稱重，一側(cè)固定于布氏液中，另一側(cè)液氮中凍存；睪丸周圍脂肪組織稱重。

1.5 血清睪酮水平測定血液樣本1 500×g離心15 min，吸取上層血清，-80℃保存。使用Unicel Dxl 800 Access免疫分析儀檢測血清睪酮水平。

1.6 精子活動率評估鑒于目前本研究實驗室尚沒有小鼠精子分析的專用CASA儀，為避免人為因素干擾，采取2人相互盲法評估小鼠精子活率。小鼠處死后立即取一側(cè)附睪，置于預(yù)熱的1 mL M2培養(yǎng)液中，體視鏡下用注射器劃開附睪，37℃孵育30 min使精子充分游離，收集精子懸液。充分混勻精子懸液，吸取10μL于計數(shù)板上，覆蓋蓋玻片，用×400倍的相差顯微鏡觀察精子運動。

1.7 精子計數(shù)精子懸液于4℃冰箱中過夜，待精子活動度降低后進行精子計數(shù)。充分混勻精子懸液，吸取10μL于紅寶石精子計數(shù)板上，覆蓋蓋玻片，用×200倍的相差顯微鏡計數(shù)100個小方格中的精子總數(shù)，再計算1 mL精子懸液中的精子數(shù)目。

1.8 精子形態(tài)學(xué)評估充分混勻精子懸液，吸取10μL于干凈載玻片上，采用迪夫快速染色液進行染色，×1 000倍油鏡下觀察。在每張重復(fù)涂片至少評估200個精子，記錄正常和異常的精子數(shù)目。

1.9 睪丸組織免疫熒光睪丸組織經(jīng)脫水，透明，浸蠟后常規(guī)包埋，4μm切片。常規(guī)脫蠟后，經(jīng)檸檬酸抗原修復(fù)液進行抗原修復(fù)。切片經(jīng)山羊血清封閉后孵育一抗STEM121（1∶100），CD105（1∶100），將切片置于濕盒中于4℃冰箱中過夜孵育。磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3遍，室溫孵育熒光標記的二抗2 h，PBS清洗3遍后使用含DAPI的封片液封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.10 睪丸組織病理學(xué)觀察睪丸組織經(jīng)脫水，透明，浸蠟后常規(guī)包埋，4μm切片。常規(guī)脫蠟后，HE染色，顯微鏡下觀察。每張切片隨機選擇30個生精小管，使用ImageJ軟件進行生精小管直徑及生精小管細胞層數(shù)的測量和計數(shù)。

1.11 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）法檢測StAR和17β-HSD蛋白表達水平取小鼠睪丸組織20 mg左右，加入200 μL蛋白裂解液，液氮研磨提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度。蛋白經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，孵育抗StAR、抗17β-HSD抗體（1∶1 000）并于4℃過夜，二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h，ECL法顯色，ImageJ軟件分析目的條帶的相對表達。

1.12 統(tǒng)計學(xué)方法每個實驗至少3個樣本、3次重復(fù)。使用GraphPad Prism7.04統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示。多組之間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較（與對照組）采用Dunnett-t檢驗。兩組之間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hAMSC的鑒定、質(zhì)量干細胞表面分子標志物流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，CD44、CD73、CD90、CD105陽性率均超過95%。血管細胞相關(guān)標志物（CD11b、CD19、CD34、CD45） 以及免疫排斥相關(guān)的表面標志物（HLA-DP/DQ/DR）的陽性率均小于2%，見圖1?；罴毎嫈?shù)顯示活細胞率為98.07%。細胞倍增時間為32.02 h。

圖1 流式細胞術(shù)檢測hAMSC表面分子標志物

2.2 高齡組雄鼠雄激素水平下降與10周齡年輕雄鼠相比，36周高齡雄鼠體質(zhì)量增加，睪丸體質(zhì)比下降（P＜0.01），睪周脂肪質(zhì)量增加（P＜0.01）。高齡雄鼠血清睪酮水平較年輕雄鼠顯著下降（P＜0.05）。與年輕對照組比較，治療前高齡組雄鼠睪丸組織StAR和17β-HSD蛋白表達水平?jīng)]有顯著差異（均P＞0.05）；但是，組內(nèi)樣本小（n=7）、個體差異較大[StAR的標準差/均數(shù)（s/x）：高齡組0.48 vs.年輕組0.39；17β-HSD的s/x：高齡組0.39 vs.年輕組0.16]。附睪精子分析顯示，高齡雄鼠的精子計數(shù)與年輕雄鼠差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；高齡雄鼠精子活動率降低（P＜0.05），正常形態(tài)精子率下降（P＜0.01）。hAMSC治療前高齡雄鼠與年輕雄鼠的睪丸組織結(jié)構(gòu)完整，生精小管排列整齊，可見不同階段的生精細胞，但高齡雄鼠生精小管直徑增大，細胞層數(shù)減少（均P＜0.01），見表1、圖2（見封三）。

表1 hAMSC治療前高齡組與年輕對照組比較 （±s）

表1 hAMSC治療前高齡組與年輕對照組比較 （±s）

StAR/β-actin年輕對照組 7 24.33±0.33 0.74±0.02 0.33±0.00 46.44±9.05 0.61±0.24治療前高齡組 7 37.67±0.88 0.57±0.02 2.42±0.27 12.91±2.25 0.65±0.31 t 14.14 4.86 7.61 3.60 0.23 P 0.00 0.01 0.00 0.01 0.82組別 n 體質(zhì)量（g）睪丸體質(zhì)比睪周脂肪質(zhì)量（g）血清睪酮（nmol/L）17β-HSD/GAPDH 0.49±0.08 0.44±0.18 0.51 0.63精子計數(shù)（個/mL，×106）生精小管細胞層數(shù)5.80±0.59 72.93±8.07 95.00±1.73 146.90±55.48 8.20±1.40 5.88±1.58 52.57±9.25 85.43±2.76 190.90±27.07 5.80±1.22 0.08 2.87 5.09 3.92 7.09 0.94 0.04 0.01 0.00 0.00精子活動率（%）正常形態(tài)精子率（%）生精小管直徑（μm）

2.3 hAMSC治療后高齡小鼠睪丸間質(zhì)區(qū)中有STEM 121和CD105表達高齡小鼠hAMSC治療后檢測STEM121、CD105在睪丸組織中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生理鹽水對照組和人血清白蛋白對照組的小鼠睪丸組織均無STEM121、CD105陽性表達，而在hAMSC治療3個劑量組中均有表達，陽性表達細胞都位于睪丸間質(zhì)區(qū)，且高劑量治療組的陽性細胞數(shù)較低劑量組更多，見圖3（見封三）。

2.4 高齡雄鼠各組間體質(zhì)量、睪丸體質(zhì)比及睪周脂肪無改變hAMSC治療結(jié)束后，各組小鼠體質(zhì)量、睪丸體質(zhì)比、睪周脂肪質(zhì)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見圖4。

圖4 高齡雄鼠hAMSC治療結(jié)束繼續(xù)飼養(yǎng)5周后各組間體質(zhì)量、睪丸體質(zhì)比及睪周脂肪質(zhì)量比較

2.5 hAMSC提高高齡雄鼠雄激素水平和睪丸組織17β-HSD蛋白表達hAMSC治療前，生理鹽水對照組高齡小鼠的血清睪酮水平較年輕對照組低（P＜0.05），與治療前高齡組的血清睪酮水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。生理鹽水對照組、年輕對照組及治療前高齡組的小鼠睪丸組織內(nèi)StAR、17β-HSD的蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

表2 生理鹽水組和年輕對照及治療前高齡組血清睪酮和睪酮合成相關(guān)酶比較 （±s）

表2 生理鹽水組和年輕對照及治療前高齡組血清睪酮和睪酮合成相關(guān)酶比較 （±s）

注：與年輕對照組比較，*P＜0.05。

組別 n 血清睪酮 StAR/β-actin 17β-HSD/GAPDH年輕對照組 7 46.44±9.05 0.61±0.10 0.49±0.04治療前高齡組 7 12.91±2.25 0.65±0.13 0.44±0.09生理鹽水對照組 3 16.87±3.31* 0.70±0.21 0.51±0.11 F 9.79 0.13 0.27 P 0.01 0.88 0.77

hAMSC治療后，高劑量組小鼠的血清睪酮水平較人血清白蛋白對照組升高（P＜0.05）。高齡組間睪丸組織StAR蛋白表達無顯著差異（P＞0.05）。但是，組內(nèi)樣本?。╪=7），個體差異較大（s/x：生理鹽水組0.30 vs.人血清白蛋白對照組0.33 vs.低劑量組0.39 vs.中劑量組0.31 vs.高劑量組0.39）。與人血清白蛋白對照組相比，高劑量組睪丸組織17β-HSD蛋白表達上調(diào)（P＜0.05），見表3、圖5。

表3 hAMSC治療后各組間血清睪酮和睪酮合成相關(guān)酶比較 （±s）

表3 hAMSC治療后各組間血清睪酮和睪酮合成相關(guān)酶比較 （±s）

注：與人血清白蛋白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 n 血清睪酮 StAR/β-actin 17β-HSD/GAPDH生理鹽水對照組 3 16.87±3.31 0.70±0.21 0.51±0.11人血清白蛋白7 14.85±2.72 0.54±0.18 0.49±0.11對照組低劑量組 7 18.36±3.41 0.49±0.19 0.48±0.19中劑量組 7 15.24±1.92 0.55±0.17 0.71±0.10高劑量組 7 28.51±9.40** 0.84±0.33 0.82±0.09*F 5.56 1.63 4.53 P 0.01 0.40 0.02

圖5 hAMSC提高高齡雄鼠睪丸組織17β-HSD蛋白表達

2.6 精子參數(shù)和睪丸組織病理學(xué)hAMSC治療前，生理鹽水對照組高齡雄鼠的精子計數(shù)、精子活動率與年輕對照組和治療前高齡組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；生理鹽水對照組高齡雄鼠的精子正常形態(tài)率較年輕對照組和治療前高齡組下降（均P＜0.05）。生理鹽水對照組高齡雄鼠的生精小管直徑較年輕對照組及治療前高齡組均增大（均P＜0.05）。生理鹽水對照組高齡雄鼠的生精小管細胞層數(shù)較年輕對照組減少（P＜0.05），但與治療前高齡組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表4 生理鹽水對照組、年輕對照組及治療前高齡組精子參數(shù)及睪丸組織病理學(xué)比較 （±s）

表4 生理鹽水對照組、年輕對照組及治療前高齡組精子參數(shù)及睪丸組織病理學(xué)比較 （±s）

注：與年輕對照組比較，**P＜0.01；與治療前高齡組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 n 精子計數(shù)（個/mL，×106） 精子活動率（%） 正常形態(tài)精子率（%） 生精小管直徑（μm） 生精小管細胞層數(shù)年輕對照組 7 5.80±0.59 72.93±8.07 95.00±1.73 146.92±55.48 8.20±1.40治療前高齡組 7 5.88±1.58 52.57±9.25 85.43±2.76 190.93±27.07 5.80±1.21生理鹽水對照組 3 7.04±1.14 54.87±19.09 78.60±0.66**# 240.20±53.74**## 7.00±1.74**F 0.97 2.17 55.31 29.59 20.03 P 0.43 0.20 0.00 0.00 0.00

hAMSC治療后，高齡雄鼠各治療組的精子計數(shù)、精子活動率、精子正常形態(tài)率與人血清白蛋白對照組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。hAMSC治療后高齡小鼠各組間的睪丸組織結(jié)構(gòu)完整，生精小管整齊排列，其中可見各階段生精細胞整齊排列，但生理鹽水對照組和人血清白蛋白對照組小鼠的生精小管直徑較治療組增大，偶見有空泡的生精小管，部分小管不完整。中劑量組和高劑量組與人血清白蛋白對照組相比生精小管細胞層數(shù)增多（均P＜0.05），見表5、圖6（見封三）。

表5 hAMSC治療后各組間精子參數(shù)及睪丸組織病理學(xué)比較 （±s）

表5 hAMSC治療后各組間精子參數(shù)及睪丸組織病理學(xué)比較 （±s）

注：與人血清白蛋白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 n 精子計數(shù)（個/mL，×106） 精子活動率（%） 正常形態(tài)精子率（%） 生精小管直徑（μm） 生精小管細胞層數(shù)生理鹽水對照組 3 7.04±1.14 54.87±19.09 78.60±0.66 240.20±53.74 7.02±1.74人血清白蛋白對照組 7 6.56±1.50 73.25±0.64 83.87±3.11 228.60±52.17 6.97±1.73低劑量組 7 6.62±1.49 80.51±8.93 83.43±2.54 155.22±21.60** 7.63±2.11中劑量組 7 5.48±1.42 72.66±10.51 85.80±0.50 122.52±28.53** 8.20±1.75**高劑量組 7 7.49±2.25 78.07±7.31 84.03±3.24 139.62±21.74** 7.90±1.09*F 1.27 3.53 4.00 58.55 3.04 P 0.32 0.02 0.03 0.00 0.02

3 討論

干細胞在移植治療中能夠發(fā)揮多種功能。hAMSC具有免疫原性低，炎癥活性低，獲取較為容易等特點[10]，有研究表明，hAMSC移植入高齡雌鼠體內(nèi)通過分泌細胞生長因子能夠改善卵巢功能[11]。本研究建立的羊膜間充質(zhì)干細胞株具有典型的間充質(zhì)干細胞形態(tài)，呈旋渦狀貼壁生長，體外擴增能力強，檢測其細胞表面分子標志物符合間充質(zhì)干細胞質(zhì)量鑒定標準，且體外培養(yǎng)過程中可穩(wěn)定分泌大量細胞因子。筆者所在課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)hAMSC分泌的細胞因子可改善高齡雌鼠卵巢微環(huán)境，促進細胞增殖并延緩細胞凋亡，從而修復(fù)卵巢功能[12]，這表明hAMSC對于改善高齡女性卵巢功能和提高其生育力具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

中老年男性更年期綜合征臨床表現(xiàn)為睪丸老化、雄激素下降[13]。深入研究中老年男性性腺功能減退機制，可以應(yīng)用高齡小鼠模型。本研究發(fā)現(xiàn)，與10周齡雄鼠相比，36周齡雄鼠血清睪酮水平降低，提示睪丸雄激素合成功能顯著下降；睪丸體質(zhì)比下降、睪周脂肪增加、生精小管直徑變大和細胞層數(shù)減少。在本研究中，高齡雄鼠睪丸中StAR和17β-HSD的表達并無顯著性降低。StAR蛋白能將膽固醇轉(zhuǎn)運至線粒體內(nèi)膜，是膽固醇轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮的限速步驟；17β-HSD蛋白能將脫氫表雄酮轉(zhuǎn)化為睪酮，是雄激素合成的限速酶[14]。本研究僅評估了StAR和17β-HSD蛋白表達水平，沒有對其他雄激素合成的關(guān)鍵酶進行研究，推測高齡組雄激素水平下降可能與其他雄激素合成相關(guān)酶有關(guān)。同時，雄性小鼠與人類男性一樣，存在較大的個體差異；睪酮可在芳香化酶（CYP19）的作用下轉(zhuǎn)化為雌二醇，高齡雄鼠睪酮水平下降同時存在雌二醇水平升高，提示睪酮向雌二醇轉(zhuǎn)化增多。高齡雄鼠還存在精子質(zhì)量下降，表現(xiàn)為正常形態(tài)精子率下降，畸形精子增多；精子活動率降低，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，可能與個體差異性較大和樣本量較小有關(guān)。所以，36周齡雄性小鼠可作為中老年男性性腺功能減退病理機制和治療實驗的研究模型。

不同來源的間充質(zhì)干細胞被應(yīng)用于改善男性睪丸功能[8]。本研究從小鼠尾靜脈注射hAMSC，發(fā)現(xiàn)hAMSC能夠改善高齡雄鼠睪丸功能、提高血清睪酮水平，初步實驗表明hAMSC對于睪丸衰老具有良性保護作用并促進雄激素合成。STEM121作為一種只在人類細胞胞質(zhì)中表達的蛋白，常用于干細胞在動物體內(nèi)的示蹤[15]。CD105是間充質(zhì)干細胞表面標志分子[16]。hAMSC治療后，通過免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)各劑量組高齡小鼠的睪丸間質(zhì)區(qū)內(nèi)有STEM121和CD105的表達，表明hAMSC已成功進入到小鼠睪丸的間質(zhì)區(qū)。有研究發(fā)現(xiàn)hAMSC能夠改善白消安誘導(dǎo)的睪丸生精功能損傷，表現(xiàn)為精子質(zhì)量提高[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，hAMSC治療后高齡雄鼠的睪丸組織形態(tài)趨于修復(fù)，主要表現(xiàn)為生精細胞層數(shù)增多，生精小管直徑趨于正常，這與另一項研究的結(jié)果一致，該研究發(fā)現(xiàn)人臍帶間充質(zhì)干細胞能夠明顯修復(fù)白消安介導(dǎo)的生精小管組織結(jié)構(gòu)損傷[18]。這提示高齡小鼠體內(nèi)移植hAMSC后，能夠改善生精微環(huán)境，延緩高齡雄鼠的睪丸功能減退。

睪丸間質(zhì)細胞是雄激素合成的細胞[19]。36周齡雄鼠生育力顯著降低，相對于人類男性50歲左右；治療4周并恢復(fù)1個生精周期（5周）后，此時小鼠已達44周齡，相對于人類男性60歲左右。本研究發(fā)現(xiàn)44周齡生理鹽水組雄鼠的血清睪酮水平較年輕小鼠顯著下降，但是44周齡雄鼠睪丸組織中StAR和17β-HSD的表達與年輕小鼠和36周齡小鼠相比均無顯著差異，這提示44周齡雄鼠雄激素水平下降可能與其他睪酮合成代謝相關(guān)酶有關(guān)。有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)hAMSC治療后，高齡雄鼠血清睪酮水平升高，高劑量組睪丸17β-HSD的表達顯著升高，表明hAMSC能夠通過提高睪酮合成相關(guān)酶17β-HSD的表達，促進高齡雄鼠睪酮合成。筆者所在課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，hAMSC可分泌多種細胞因子，其中包括血管生成因子，細胞生長和營養(yǎng)因子，促炎、抑炎因子，趨化因子，抗凋亡因子等，且通過靜脈注射hAMSC細胞培養(yǎng)上清能夠改善高齡小鼠的卵巢功能，這表明hAMSC可能通過旁分泌作用參與組織損傷修復(fù)，細胞上清中的某些因子參與細胞內(nèi)信號通路調(diào)控，改善受損組織微環(huán)境[20]。因此，推測hAMSC改善高齡雄鼠睪丸雄激素合成功能，可能通過細胞旁分泌作用，改善睪丸間質(zhì)細胞的功能，促進睪酮合成。當然，筆者所在課題組的前期研究也發(fā)現(xiàn)給高齡雌鼠尾靜脈注射hAMSC細胞培養(yǎng)上清能夠降低其血清黃體生成激素的水平[20]。有研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞能夠促進雄性糖尿病大鼠的下丘腦-垂體-性腺（HPG）軸，提高血清卵泡刺激素和黃體生成激素水平并促進雄激素合成[21]，這表明間充質(zhì)干細胞促進雄激素合成作用可能不只局限于間質(zhì)細胞，其對HPG軸可能也有調(diào)控作用。

綜上所述，hAMSC對高齡小鼠睪丸具有保護性作用，包括修復(fù)生精小管組織結(jié)構(gòu)損傷、促進雄激素合成，表明hAMSC在人類中老年男性具有延緩睪丸衰老和促進雄激素合成的作用，因此具有預(yù)防和治療中老年男性遲發(fā)性性腺功能減退癥的潛在應(yīng)用前景。