白三烯B4在蛛網(wǎng)膜下腔出血后血管痙攣中作用的實(shí)驗(yàn)研究

熊平 張濤 李崢

隨著蛛網(wǎng)膜下腔出血治療的不斷進(jìn)步，致死率和致殘率有所下降，但其導(dǎo)致?lián)p傷的具體機(jī)制目前仍不十分清楚[1-3]。白三烯是一類具有高度生物活性的炎性介質(zhì)，其合成主要有中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性及嗜堿性粒細(xì)胞等。其中白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）被證實(shí)為具有高度活性的中性粒細(xì)胞趨化因子，通過(guò)與白三烯B4受體1（BLT1）結(jié)合發(fā)揮趨化作用[4-6]。研究表明LTB4及BLT1可能參與了蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的發(fā)生發(fā)展[7-8]，具體機(jī)制不十分清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)探討LTB4在蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣中的作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其分組SD大鼠由川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。先將60只SD大鼠隨機(jī)分為正常組（NM組，6只），蛛網(wǎng)膜下腔出血組（SAH組，18只），蛛網(wǎng)膜下腔出血+LTB4抑制劑組（SAH+U75302 組，18 只），假手術(shù)組（Sham 組，18 只），其中SAH組、Sham組及SAH+U75302組依據(jù)時(shí)間節(jié)點(diǎn)又分為出血后1 d、3 d及5 d三個(gè)亞組，每組6只。采用枕大池二次注血法建立SAH模型，正常組不予任何處理，標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，SAH組建模成功后予以標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，SAH+U75302組建模成功后每天腹腔注射U75302（20 ng/d），Sham組建模成功后每天腹腔注射0.9%生理鹽水。本次造模中SD大鼠死亡8只，用SD大鼠進(jìn)行補(bǔ)充。

1.2 標(biāo)本采集各組分別于造模成功后1 d、3 d及5 d采集標(biāo)本。先抽取血液標(biāo)本，后采用4%多聚甲醛灌注，留取大鼠腦橋段（包含基底動(dòng)脈）腦組織標(biāo)本固定，后期行HE染色、免疫組化及血液中LTB4含量的測(cè)定。

1.3 HE染色常規(guī)行HE染色，并測(cè)量基底動(dòng)脈管壁厚度及直徑。為減少誤差，采用校正直徑及校正血管壁厚度。校正直徑=（最長(zhǎng)內(nèi)徑×最短內(nèi)徑）1/2，校正血管壁厚度=[（最長(zhǎng)外徑-最長(zhǎng)內(nèi)徑）+（最短外徑-最短內(nèi)徑）]/4[9-10]。

1.4 免疫組化染色采用二步法進(jìn)行免疫組化染色，抗體選用Abcam公司的鼠抗單克隆NF-κB抗體，以核內(nèi)棕黃色為染色陽(yáng)性，在高倍鏡下選取5個(gè)視野，分別計(jì)算染色陽(yáng)性細(xì)胞占所有細(xì)胞的陽(yáng)性百分率，后取平均值作為NF-κB的表達(dá)情況。

1.5 大鼠血液中LTB4含量檢測(cè)采用ELISA法，按照試劑盒操作說(shuō)明書檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0進(jìn)行分析。定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，多組均數(shù)間的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 腦組織的大體觀察NM組及Sham組大鼠蛛網(wǎng)膜下腔未見(jiàn)血液，SAH組（圖1）及SAH+U75302組大鼠的腦溝、腦干腹側(cè)、基底池均可見(jiàn)有血液或血凝塊。

圖1 各組各時(shí)間點(diǎn)大腦組織的大體觀察 A.正常組，蛛網(wǎng)膜下腔未見(jiàn)明顯血液；B、C、D.分別為蛛網(wǎng)膜下腔出血組1 d、3 d及5 d腦溝、腦干腹側(cè)、基底池均可見(jiàn)有血液或血凝塊，且隨時(shí)間逐漸減少。

2.2 血管壁的病理學(xué)改變Sham組與NM組基底動(dòng)脈內(nèi)膜及外膜管壁平整，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)彈力膜未見(jiàn)明顯皺褶、斷裂。平滑肌細(xì)胞排列規(guī)整。SAH組及SAH+U75302組內(nèi)膜出現(xiàn)皺褶呈現(xiàn)波浪狀改變，局部可有斷裂，中膜平滑肌細(xì)胞增生，平滑肌層增厚，可見(jiàn)粒細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2）。

圖2 各組各時(shí)間點(diǎn)基底動(dòng)脈HE染色結(jié)果 A、H.NM組及Sham組 HE染色內(nèi)膜及外膜管壁平整，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)彈力膜未見(jiàn)明顯皺褶、斷裂。平滑肌細(xì)胞排列規(guī)整。B、C、D.SAH組1 d、3 d、5 d 內(nèi)膜出現(xiàn)皺褶呈現(xiàn)波浪狀改變，局部可有斷裂，中膜平滑肌細(xì)胞增生，平滑肌層增厚，可見(jiàn)粒細(xì)胞浸潤(rùn)。E、F、G.SAH+U75302組1 d、3 d、5 d,血管壁的改變程度較SAH組輕。

2.3 基底動(dòng)脈直徑見(jiàn)表1。各時(shí)間點(diǎn)Sham組與NM組比較，基底動(dòng)脈直徑無(wú)明顯差異 （P均＞0.05）。各時(shí)間點(diǎn)Sham組、SAH組及SAH+U75302組基底動(dòng)脈直徑有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=58.63、189.63、159.53，P均＜0.05），Sham 組基底動(dòng)脈直徑均大于SAH組和SAH+U75302組，SAH組基底動(dòng)脈直徑均小于SAH+U75302組。

2.4 基底動(dòng)脈管壁厚度見(jiàn)表1。各時(shí)間點(diǎn)Sham組與NM組基底動(dòng)脈管壁厚度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）。各時(shí)間點(diǎn) Sham組、SAH組及 SAH+U75302組基底動(dòng)脈管壁厚度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=22.93、314.01、490.94，P 均＜0.05），Sham 組基底動(dòng)脈管壁厚度均小于SAH組、SAH+U75302組，SAH組基底動(dòng)脈直徑均大于SAH+U75302組。

表1 各時(shí)間點(diǎn)大鼠基底動(dòng)脈校正直徑及血管壁厚度（n=6）

2.5 大鼠血液中LTB4含量見(jiàn)表2。各時(shí)間點(diǎn)Sham組與NM組血液中LTB4含量無(wú)明顯差異（P均＞0.05）；各時(shí)間點(diǎn) Sham組、SAH組及 SAH+U75302組血液中LTB4的含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=59.86、259.17、280.79，P 均＜0.05），SAH 組、SAH+U75302組大鼠血液中LTB4的含量較Sham組增高，SAH+U75302組LTB4的含量較SAH組減少。

2.6 基底動(dòng)脈血管壁中NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況見(jiàn)表2。各時(shí)間點(diǎn)Sham組與NM組基底動(dòng)脈血管壁中NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞百分率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）。各時(shí)間點(diǎn)Sham組、SAH組及SAH+U75302組NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞百分率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=198.32、854.57、1024.27，P 均 ＜0.05），SAH 組及 SAH+U75302組 NF-κB的表達(dá)較 Sham組增高，SAH+U75302組 NF-κB的表達(dá)較 SAH組減少。

表2 各時(shí)間點(diǎn)大鼠血液中LTB4含量及血管壁NF-kB陽(yáng)性細(xì)胞百分率（n=6）

3 討論

目前越來(lái)越注重蛛網(wǎng)膜下腔出血患者早期腦損傷及血管痙攣機(jī)制的研究。其中蛛網(wǎng)膜下腔出血后血管痙攣的作用機(jī)制十分復(fù)雜。導(dǎo)致其出現(xiàn)血管痙攣的主要機(jī)制[11-13]目前公認(rèn)的有：①免疫炎癥反應(yīng)；②血管壁的結(jié)構(gòu)和功能障礙；③血管舒張因子調(diào)節(jié)失衡；④血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；⑤血管活性物質(zhì)的釋放，如血管緊張素、5-羥色胺、兒茶酚胺等；⑥自由基大量的生成，打破了自由基產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡。其中蛛網(wǎng)膜下腔出血后炎癥反應(yīng)可能發(fā)揮主導(dǎo)作用[14-16]。近年來(lái)研究表明蛛網(wǎng)膜下腔出血后血液及腦脊液中LTB4含量明顯升高，BLT1在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)有明顯表達(dá)，提示LTB4可能參與了蛛網(wǎng)膜下腔出血后的血管反應(yīng)，但具體的作用機(jī)制不清楚[17]。

圖3 各組各時(shí)間點(diǎn)基底動(dòng)脈 NF-κB 免疫組化染色結(jié)果 A、H.NM 組及 Sham；B、C、D.SAH 組 1 d、3 d、5 d；E、F、G.SAH+U75302組 1 d、3 d、5 d組血管壁NF-κB的表達(dá)情況。NM組表達(dá)較少，SAH組隨時(shí)間增加表達(dá)逐漸增加，SAH+U75302各組也隨時(shí)間表達(dá)逐漸增加，在內(nèi)皮細(xì)胞，平滑肌層及外膜均有表達(dá)，SAH組與SAH+U75302組各時(shí)間點(diǎn)相比較，SAH+U7530組表達(dá)明顯減少（P<0.05）。

本實(shí)驗(yàn)表明，各時(shí)間點(diǎn)SAH組基底動(dòng)脈管壁厚度比NM組及Sham組厚（P<0.05），血管直徑均較NM組及Sham組?。≒<0.05），表明蛛網(wǎng)膜下腔出血后大鼠基底動(dòng)脈出現(xiàn)了血管痙攣，Sham組血管痙攣程度較SAH組明顯減輕，抑制LTB4能夠明顯改善血管痙攣程度。同時(shí)也在SAH組大鼠基底動(dòng)脈壁中發(fā)現(xiàn)有大量粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，表明粒細(xì)胞可能參與了蛛網(wǎng)膜下腔出血后血管痙攣的發(fā)生。研究[18-19]表明粒細(xì)胞激活后會(huì)釋放大量的炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），白介素-1β（Interleukin-1β，IL-β），髓過(guò)氧 化 物 酶 （myeloperoxidase，MPO）以及核因-κB（nuclear-transcription factor-Kappa B，NF-κB）等。因而我們推測(cè)血管壁中大量存在的粒細(xì)胞可能是受到了LTB4的誘導(dǎo)趨化，使其血管內(nèi)的粒細(xì)胞大量浸潤(rùn)血管壁，粒細(xì)胞釋放大量的炎癥介質(zhì)，促使多種炎癥通路激活，從而導(dǎo)致血管痙攣的發(fā)生。抑制LTB4，減少粒細(xì)胞的誘導(dǎo)趨化，從而改善血管痙攣。

LTB4作為一種具有高度活性的粒細(xì)胞趨化因子，而NF-κB在神經(jīng)炎癥中處于中心地位，那么LTB4及NF-κB是否參與了血管痙攣的發(fā)生？在SAH組與SAH+U75302組各時(shí)間點(diǎn)中，血液中LTB4的含量及NF-κB的表達(dá)均比NM組及Sham組增加（P<0.05），SAH+U75302組與 SAH組相比LTB4的含量及NF-κB的表達(dá)減少（P<0.05）。我們推測(cè)蛛網(wǎng)膜下腔出血后，血液中的LTB4大量表達(dá)，趨化大量粒細(xì)胞通過(guò)某種途徑進(jìn)入血管壁，具體途徑需進(jìn)一步研究，同時(shí)粒細(xì)胞釋放大量NF-κB，激活NF-κB信號(hào)通路，導(dǎo)致血管痙攣的發(fā)生。炎癥介質(zhì)導(dǎo)致血管痙攣機(jī)制不明確，有研究表明炎癥介質(zhì)可導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化和血管重塑，從而導(dǎo)致血管痙攣[20-24]，但具體機(jī)制也需進(jìn)一步研究。本研究表明，SAH+U75302組血管痙攣程度減輕可能是通過(guò)使用LTB4抑制劑，阻斷LTB4與BLT1結(jié)合，導(dǎo)致LTB4的趨化作用減弱，粒細(xì)胞進(jìn)入血管壁減少，從而NF-κB釋放減少，抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)信號(hào)通路，從而減輕血管痙攣。

蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣目前還沒(méi)有特異的治療方案，抑制BLT4能夠改善血管痙攣程度，從而為臨床提供一種新的治療方式，與此同時(shí)BLT1特異性拮抗劑也具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。