MicroRNA-16及Let-7a在支氣管哮喘患者中表達水平及與嚴重程度的關系

于欣 孟曉皓 張春玲

支氣管哮喘是一種常見的呼吸道疾病，其特征是伴有可逆的氣道阻塞及支氣管高反應性，近年來隨著空氣污染的加重，支氣管哮喘發(fā)病率逐年上升[1-2]。支氣管哮喘臨床表現(xiàn)多種多樣，包括反復發(fā)作的喘息、咳嗽和呼吸困難等[3-4]。支氣管哮喘對患者的正常生活造成極大影響，且重度哮喘需住院治療。目前，支氣管哮喘病情嚴重程度的評估主要依據(jù)患者的臨床癥狀及體征等主觀指標，然而此類方法重復性差，難以在臨床推廣應用[5]。探尋客觀準確的指標，評估支氣管哮喘的病情嚴重程度，對制定合理干預措施改善患者生活質量有重要意義。氣道炎癥細胞浸潤及氣管痙攣與支氣管哮喘的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關[6-7]。Let-7a是微RNA(micro RNA，miRNA)的一員，已被證實可通過調節(jié)白介素-13(interleukin-13，IL-13)的分泌，影響小鼠哮喘的發(fā)生[8]。β2腎上腺素能受體在支氣管哮喘的發(fā)病中具有重要作用，微RNA-16(micro RNA-16，miR-16)可調節(jié)β2腎上腺素能受體表達[9]。miR-16及Let-7a可能與支氣管哮喘存在聯(lián)系，但關于二者與支氣管哮喘病情嚴重程度的關系未見報道。因此筆者開展本研究，分析miR-16和Let-7a與支氣管哮喘病情嚴重程度的關系，以期為臨床評估支氣管哮喘患者病情提供幫助。

資料與方法

一、一般資料

前瞻性選取2017年7月至2019年7月我院收治的128例支氣管哮喘患者作為研究對象。參照《中國支氣管哮喘防治指南(基層版)》[10]中標準進行診斷。并按照指南將患者分為輕、中度組(n=85)和重度組(n=43)。輕度為第1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1)≥80%或最大呼氣流量(peak expiratory flow，PEF)≥80%個人最佳值；中度為60%≤FEV1≤79%或為60%≤PEF≤79%；重度為FEV1<60%或PEF<60%。納入標準：(1)符合支氣管哮喘診斷標準；(2)年齡高于18歲；(3)入組前未服用皮質激素類、免疫抑制劑及炎癥遞質拮抗劑類藥物；(4)簽署知情同意書。排除標準：(1)合并惡性腫瘤；(2)合并肺炎、慢阻肺、肺纖維化等疾??；(3)合并其他過敏性疾病；(4)合并嚴重心、腦血管疾病。選取同期120例體檢健康者作為對照組，均無免疫系統(tǒng)或其他炎癥性疾病，肝腎功能正常。輕、中度組男性38例，女性47例，年齡20～49歲，平均年齡(37.14±4.18)歲；重度組男性16例，女性27例，年齡22～50歲，平均年齡(37.02±4.20)歲；對照組男性55例，女性65例，年齡19～48歲，平均年齡(36.68±4.27)歲。三組其余基線資料(見表1)。本研究獲得本院醫(yī)學倫理委員會批準。

表1 基因序列

二、方法

抽取受試者入組次日清晨空腹外周靜脈血10 mL，室溫下4000 r/min離心15 min，離心半徑8 cm，分離上層血清，置于-20 ℃冰箱，待測。采用LH 755全自動血常規(guī)細胞分析儀(美國貝克曼庫爾特)檢測外周嗜酸細胞計數(shù)(eosinophils，EOS)及外周中性粒細胞計數(shù)；采用E 601電化學發(fā)光免疫分析儀(瑞士羅氏公司)檢測血清免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)水平；采用電化學法，測定呼出氣一氧化氮(fractional exhaled nitric oxide，F(xiàn)eNO)水平；采用酶聯(lián)法檢測血清IL-13水平(試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。采用實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，RT-PCR)法[9]檢測支氣管哮喘患者血清miR-16和Let-7a相對表達量。用TRIzol試劑(美國Thermo公司)提取總RNA，用TaqMan MicroRNA反轉錄試劑盒(美國Thermo公司)合成cDNA，PCR擴增。反應條件為：95 ℃ 5 min初始變形，94 ℃ 15 s，40個循環(huán)，退火，最后72 ℃ 10 s延伸。以GAPDH作為內參，采用2-ΔΔCt表示miR-16和Let-7a相對表達量。

三、統(tǒng)計學方法

結 果

一、三組基線資料比較

三組在年齡、性別、BMI方面比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在FEV1、FVC、IL-13、IgE、FeNO、EOS計數(shù)、外周中性粒細胞計數(shù)方面比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表2)。

表2 三組基線資料比較

組別nIL-13(pg/mL)IgE(IU/mL)FeNO(ppb)EOS計數(shù)(×109/L)外周中性粒細胞計數(shù)(×109/L)對照組1204.33±1.2895.30±20.1532.84±5.630.20±0.072.04±0.11輕、中度組857.62±2.55a402.63±78.03a67.14±13.06a0.33±0.08a2.59±0.14a重度組4310.72±2.88ab469.33±85.92ab53.11±12.54ab0.45±0.12ab2.80±0.18abF/χ2161.500966.271296.722156.734691.662P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

二、三組血清miR-16和Let-7a相對表達量比較

三組血清miR-16和Let-7a相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，其中，對照組血清miR-16和Let-7a相對表達量高于輕、中度組及重度組，輕、中度組血清miR-16和Let-7a相對表達量高于重度組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表3)。

表3 三組血清miR-16和Let-7a相對表達量比較

三、miR-16和Let-7a評估重度支氣管哮喘的效能

miR-16評估重度支氣管哮喘的AUC、敏感度、特異性、最佳截斷點分別為0.802(95%CI：0.722～0.867)、69.77%、76.47%、0.39。Let-7a評估重度支氣管哮喘的AUC、敏感度、特異性、最佳截斷點分別為0.808(95%CI：0.728～0.872)、93.02%、70.59%、0.57。miR-16和Let-7a評估重度支氣管哮喘的AUC比較，差異無統(tǒng)計學意義(Z=0.098，P=0.922)(見圖1)。

圖1 miR-16和Let-7a評估重度支氣管哮喘的ROC曲線

四、支氣管哮喘病情加重的相關性因素

根據(jù)FEV1、FVC、IL-13、IgE、FeNO、EOS計數(shù)、外周中性粒細胞計數(shù)、miR-16和Let-7a評估重度支氣管哮喘的最佳截斷點，將其分為二分類變量。將FEV1(≥80.42%=0，<80.42%=1)、FVC(≥88.04%=0，<88.04%=1)、IL-13(<8.75 pg/mL=0，≥8.75 pg/mL=1)、IgE(<433.07 IU/mL=0，≥433.07 IU/mL=1)、FeNO(≥59.52 ppb=0，<59.52 ppb=1)、EOS計數(shù)(<0.36×109/L=0，≥0.36×109/L=1)、外周中性粒細胞計數(shù)(<2.65×109/L=0，≥2.65×109/L=1)、miR-16(≥2.75=0，<2.75=1)和Let-7a(≥1.72=0，<1.72=1)作為自變量，將支氣管哮喘嚴重程度(輕、中度=0，重度=1)作為因變量，結果顯示IL-13、IgE、EOS計數(shù)、miR-16、Let-7a與支氣管哮喘病情加重密切相關(見表4)。

表4 影響支氣管哮喘病情加重的多因素分析

五、三種模型評估重度支氣管哮喘的效能分析

采用二元Logistic回歸分析建立miR-16+Let-7a評估重度支氣管哮喘的模型：F=-4.042+6.212×miR-16+2.174×Let-7a，并將其命名為模型A；年齡+性別+IL-13+IgE+EOS計數(shù)評估重度支氣管哮喘的模型：F=-14.297+0.065×年齡+0.098×性別0.290×IL-13+0.014×IgE+14.071×EOS計數(shù)，并將其命名為模型B；miR-16+Let-7a+年齡+性別+IL-13+IgE+EOS計數(shù)評估重度支氣管哮喘的模型：F=-26.233+10.495×miR-16+2.447×Let-7a+0.088×年齡+0.119×性別+0.389×IL-13+0.023×IgE+17.220×EOS計數(shù)，并將其命名為模型C。模型B評估重度支氣管哮喘的AUC高于模型A，差異無統(tǒng)計學意義(Z=2.323，P=0.020)，模型C評估重度支氣管哮喘的AUC高于模型A及模型B(Z=4.101，P<0.001；Z=2.455，P=0.007)(見表5，圖2)。

表5 三種模型評估重度支氣管哮喘的效能分析

圖2 三種模型評估重度支氣管哮喘的ROC曲線

討 論

支氣管哮喘是一種慢性炎癥性疾病，以氣道高反應為特征[11]。劇烈運動、冷空氣刺激及空氣污染等可誘導哮喘的發(fā)生[12]。支氣管哮喘臨床分為輕度、中度及重度，其中重度支氣管哮喘對患者的危害較大[13]。因此早期明確患者病情對采取有效措施抑制病情進展具有重要作用。目前臨床常用的指標如白介素-37，評估支氣管哮喘炎癥準狀態(tài)的敏感性較低[14]。氣道炎癥反應及支氣管平滑肌收縮異常為引起支氣管哮喘的主要因素。miR-16可調節(jié)β2腎上腺素能受體的表達引起支氣管平滑肌異常收縮，而Let-7a可通過調節(jié)炎癥細胞因子參與氣道炎癥性疾病[8-9]。然而未有關于miR-16及Let-7a與支氣管哮喘病情之間關系的報道，因此本研究就二者與支氣管哮喘病情的關系進行探討。

本研究結果顯示三組受試者血清miR-16及Let-7a相對表達量差異顯著，重度組、輕、中度組血清miR-16及Let-7a相對表達量均高于對照組，表明血清miR-16及Let-7a可能與支氣管哮喘的發(fā)生存在聯(lián)系。而重度組血清miR-16及Let-7a相對表達量高于輕、中度組，表明二者可能與支氣管哮喘的病情存在聯(lián)系，提示檢測血清miR-16及Let-7a有助于評估支氣管哮喘病情。因此筆者構建了miR-16及Let-7a評估支氣管哮喘的ROC曲線，結果顯示二者評估重度支氣管哮喘的AUC均高于0.8，表明二者評估支氣管哮喘病情的效能較高。為進一步分析血清miR-16及Let-7a與支氣管哮喘病情的關系，本研究采用Logistic回歸分析影響支氣管哮喘病情的因素，結果顯示IL-13、IgE、EOS計數(shù)與支氣管哮喘病情密切相關，結果與既往研究[15-16]相符。此外本研究結果顯示miR-16、Let-7a與支氣管哮喘病情密切相關。

氣道炎性細胞因子的大量合成、釋放誘導嗜酸性粒細胞遷移至炎癥部位，引起呼吸道炎癥細胞浸潤，加重呼吸道高反應性[17]。且氣道炎性細胞可誘導IgE的大量釋放致使機體處于致敏狀態(tài)，引起組胺、白三烯等的釋放，導致氣道痙攣[18]。動物實驗[8]表明，Let-7a可調節(jié)IL-13等炎性細胞因子的表達參與氣道炎癥反應，炎癥因子濃度升高后，放大氣道炎癥反應促使哮喘的進展。β2腎上腺素能受體是G蛋白偶聯(lián)受體家族一員，在支氣管平滑肌細胞中高表達，與腎上腺素特異性結合后可導致小氣道擴張，緩解哮喘[19]。細胞實驗[9]表明，miR-16具有調節(jié)β2腎上腺素能受體表達的作用，且miR-16呈濃度依賴型抑制β2腎上腺素能受體的蛋白和基因表達。因此，筆者推測miR-16可能通過抑制β2腎上腺素能受體的表達，Let-7a通過誘導IL-13的表達參與支氣管哮喘病情進展。但關于miR-16及Let-7a影響支氣管哮喘疾病進展的病理生理機制仍需進一步探索。

本研究同時構建模型A、B、C評估重度支氣管哮喘的ROC曲線，結果發(fā)現(xiàn)模型C評估重度支氣管哮喘的效能高于模型A及模型B，表明增加miR-16及Let-7a更有利于重度支氣管哮喘的診斷。

綜上所述，支氣管哮喘患者血清miR-16及Let-7a與病情關系密切，檢測血清miR-16及Let-7a相對表達量有助于評估患者病情。本研究下一步將動態(tài)檢測支氣管哮喘患者血清miR-16及Let-7a相對表達量，并進行動物實驗，分析miR-16及Let-7a影響支氣管哮喘疾病進展的病理生理機制。