維生素D通過(guò)JAK/STAT信號(hào)通路影響毛細(xì)支氣管炎患兒免疫應(yīng)答的研究

唐川婷 馮琴

毛細(xì)支氣管炎為嬰幼兒常見(jiàn)下呼吸道感染性疾病，多由呼吸道合胞病毒感染引起，引發(fā)患兒咳嗽、低熱、呼吸困難等癥狀，病情遷延可發(fā)展為哮喘。國(guó)外研究證實(shí)[1]，維生素D具有免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)呼吸道黏膜上皮細(xì)胞的變性、角化和增生等有較大影響，可影響毛細(xì)支氣管炎病情。國(guó)內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)[2]，毛細(xì)支氣管炎患兒普遍存在維生素D缺乏，補(bǔ)充維生素D有利于患兒癥狀的緩解和病程的縮短，可使患兒獲益，但有關(guān)維生素D用于該類(lèi)患兒臨床治療的效果及相關(guān)機(jī)制的研究仍較為缺乏。最新研究發(fā)現(xiàn)[3]，維生素D受體在機(jī)體免疫細(xì)胞中也有分布，維生素D與其受體結(jié)合后可發(fā)揮免疫細(xì)胞分化、增殖及細(xì)胞因子分泌。體外研究發(fā)現(xiàn)[4]，維生素D可通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄激活因子(Janus kinase-signal transducers and activators of transcription，JAK-STAT)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響機(jī)體的免疫應(yīng)答，從而影響疾病康復(fù)。轉(zhuǎn)錄激活因子1(Singal transducers and activators of transcription1，STAT1)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子2(STAT2)、干擾素調(diào)節(jié)因子9(IFN Regulatory Factor9，IRF9)是JAK-STAT通路中產(chǎn)生的特異性分子。而外周單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs)包含淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞，是參與機(jī)體免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞[5]。因此本研究通過(guò)檢測(cè)PBMCs的STAT1、STAT2、IRF9表達(dá)情況，探討維生素D如何通過(guò)JAK/STAT信號(hào)通路影響毛細(xì)支氣管炎患兒的免疫應(yīng)答，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

一、臨床資料

選取2017年4月至2019年11月本院收治的96例住院毛細(xì)支氣管炎患兒作為研究對(duì)象，按隨機(jī)數(shù)表法分為觀察組和對(duì)照組，各48例。參照呼吸危重評(píng)定表評(píng)分評(píng)估患兒的病情嚴(yán)重程度，≤8分為輕中度、≥9分為重度。觀察組中，男25例、女23例；年齡6個(gè)月～3歲，平均(1.24±0.35)歲；輕中度31例、重度17例。對(duì)照組中，男28例、女20例；年齡8個(gè)月～3歲，平均(1.35±0.32)歲；輕中度34例、重度14例。兩組患兒性別、年齡、病情嚴(yán)重程度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 兩組基線(xiàn)資料的比較

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患兒因出現(xiàn)咳嗽、喘憋等癥狀就診，經(jīng)查有肺部哮鳴音，符合《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》(第7版)[6]中毛細(xì)支氣管炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，且為首次診斷。(2)病程5 d以?xún)?nèi)。(3)經(jīng)查呼吸道合胞病毒抗原陽(yáng)性。(4)入組前2周內(nèi)無(wú)維生素D、類(lèi)固醇激素藥物、白三烯受體拮抗劑使用史。(5)患兒監(jiān)護(hù)人知情并簽署知情同意書(shū)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴支氣管異物、支氣管-肺發(fā)育不良者。(2)伴呼吸道畸形、肺結(jié)核者。(3)伴先天性腦發(fā)育不良、先天性心臟病者。(4)伴原發(fā)性免疫缺陷者。(5)伴肝腎功能障礙者。(6)對(duì)治療藥物過(guò)敏者。

二、治療方法

1 對(duì)照組 采取常規(guī)治療，包括吸氧、抗感染、抗病毒、霧化吸入復(fù)方異丙托溴銨、氨溴索祛痰等。重度患兒在上述基礎(chǔ)上加用小劑量甲潑尼龍琥珀酸鈉：靜脈滴注，1 mg/kg、2次/d。療程3～7 d。

2 觀察組 在對(duì)照組基礎(chǔ)上聯(lián)合維生素D滴劑(廈門(mén)國(guó)藥控股星鯊制藥有限公司；國(guó)藥準(zhǔn)字：H35021450，規(guī)格：400 IU*24 s)：100 IU/kg、1次/d。療程3～7 d。

三、觀察指標(biāo)

1 癥狀緩解時(shí)間 記錄兩組患兒的憋喘消失時(shí)間、肺部哮鳴音消失時(shí)間、呼吸困難消失時(shí)間、住院時(shí)間。

2 免疫應(yīng)答指標(biāo) 兩組患兒均于入院時(shí)、治療后采集晨起空腹靜脈血4 mL，離心后(2 000×g、10 min)置于-20 ℃下保存待測(cè)。采用免疫透射比濁法測(cè)定血清IgA、IgG、IgM及IgE，檢測(cè)儀器為美國(guó)Beckman Coulter公司的Array 360型散射比。

3 PBMCs中STAT1、STAT2、IRF9的檢測(cè) 分別于兩組患兒入院時(shí)、治療后采集晨起空腹靜脈血約5 mL，置于肝素抗凝管中，后移至(含5 mlHank’s稀釋液)無(wú)菌離心管中吹打混合，加入4 mL的淋巴細(xì)胞分離液，2 000 r/min速度下離心30 min，紅細(xì)胞層與上清液中間形成的稀薄白色云霧狀分層即為所需PBMCs層，吸出后加入5 mL的RPMI-1640液并吹打混勻，離心(1 000 r/min、10 min)后棄去上清液，重復(fù)2次以純化PBMCs。加入含胎牛血清(10%)的RPMI-1640液吹打懸浮，用培養(yǎng)液調(diào)整至適宜細(xì)胞濃度，將懸浮液置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，然后接種于6孔培養(yǎng)板，每孔1 mL。6孔培養(yǎng)板中分別放置對(duì)照組和觀察組入院時(shí)、治療后4個(gè)樣本，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。采用Western blot技術(shù)分析JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的STAT1、STAT2、IRF9表達(dá)：將6孔板取出，PBS液清洗處理孔，2 mL每次共3次。每孔加入200 μl蛋白裂解液并置于冰上，將板壁上的蛋白刮下，移至已標(biāo)記的離心管中，離心(12 000 r/min、30 min)后上清液移至另一個(gè)已標(biāo)記的離心管中，所得上清液即為PBMCs總蛋白。取10 μl樣品液并加PBS液稀釋至100 μl，使終濃度為0.5 mg/mL。向酶標(biāo)孔中加BCA工作液200 μl，搖勻、靜置30 min。在酶標(biāo)儀上562 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，推算各組蛋白濃度。凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉過(guò)夜，用TBST漂洗3次(×15 min)。吸干膜表面液體，用鑷子將膜移至配制好的一抗中，4 ℃下孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次(×15 min)，后加入二抗，室溫下孵育1 h。用TBST洗膜3次(×15 min)。吸干膜表面，將膜平鋪于顯影板上，膜表面涂滿(mǎn)顯影液進(jìn)行顯影。拍照保存顯影的蛋白條，以β-actin為內(nèi)參，用Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、癥狀緩解時(shí)間

觀察組各項(xiàng)癥狀緩解時(shí)間均顯著短于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 兩組癥狀緩解時(shí)間的比較

二、免疫應(yīng)答指標(biāo)

兩組患兒入院時(shí)的血清IgA、IgG、IgM、IgE水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后，對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯變化(P>0.05)，觀察組血清IgA、IgG較治療前升高、IgE較治療前降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。觀察組治療后的IgA、IgG高于對(duì)照組，IgE低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 兩組患兒治療前后免疫應(yīng)答指標(biāo)的比較

三、PBMCs中STAT1、STAT2、IRF9表達(dá)量

兩組患兒入院時(shí)的PBMCs中STAT1、STAT2、IRF9表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后，對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯變化(P>0.05)，觀察組PBMCs中STAT1、STAT2、IRF9表達(dá)均較治療前上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。觀察組治療后的PBMCs中STAT1、STAT2、IRF9表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表4)。

表4 兩組患兒治療前后PBMCs中STAT1、STAT2、IRF9表達(dá)

討 論

有研究發(fā)現(xiàn)[7]，毛細(xì)支氣管炎在每年的11月至次年3月期間發(fā)病率最高，而這段時(shí)間的紫外線(xiàn)照射最少，無(wú)法產(chǎn)生足夠的維生素D，因此認(rèn)識(shí)到該病與維生素D缺乏有一定關(guān)聯(lián)。袁林的研究認(rèn)為[8]，維生素D對(duì)機(jī)體的免疫應(yīng)答有較大作用，可激活機(jī)體固有免疫，因此維生素D缺乏時(shí)，機(jī)體抵抗力差，積極補(bǔ)充維生素D有利于增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答，從而促進(jìn)病情盡早好轉(zhuǎn)。

本研究中觀察組患兒在對(duì)照組常規(guī)治療基礎(chǔ)上聯(lián)合維生素D，結(jié)果顯示，患兒的憋喘、肺部哮鳴音、呼吸困難等癥狀的消失時(shí)間和住院時(shí)間均較對(duì)照組明顯縮短，患兒治療后的血清IgA、IgG升高幅度與IgE下降幅度均較對(duì)照組更大，提示維生素D的應(yīng)用在改善患兒免疫應(yīng)答、緩解癥狀方面發(fā)揮了積極作用，為患兒的康復(fù)創(chuàng)造了有利條件。呼吸道合胞病毒是毛細(xì)支氣管炎的主要病原體，而呼吸道上皮是呼吸道病毒的第一道防線(xiàn)[4]。目前認(rèn)為[9-10]，病原體侵入機(jī)體時(shí)，呼吸道上皮的單核-巨噬細(xì)胞表面的識(shí)別模式受體會(huì)立即對(duì)其進(jìn)行識(shí)別，并立即啟動(dòng)宿主免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)維生素D受體和25-羥維生素D1α-羥化酶在單核-巨噬細(xì)胞中的表達(dá)升高。25-羥維生素D1α-羥化酶表達(dá)水平的升高會(huì)不斷催化維生素D轉(zhuǎn)化為活性更高的1, 25-(OH)2D3，并與維生素D受體結(jié)合形成復(fù)合物，增強(qiáng)細(xì)胞免疫，最終強(qiáng)化機(jī)體的免疫應(yīng)答[9]。有研究發(fā)現(xiàn)[11]，1, 25(OH)2D3是一種免疫調(diào)節(jié)劑，具有抑制炎性細(xì)胞因子表達(dá)的作用，還可刺激自然殺傷細(xì)胞、呼吸道上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞中的抗菌多肽表達(dá)的增強(qiáng)，預(yù)防肺部感染。專(zhuān)家認(rèn)為[12]，兒童免疫系統(tǒng)尚不成熟，而參與機(jī)體免疫功能的細(xì)胞大多都含維生素D受體。而其活性成分1, 25(OH)2D3可抑制Th2細(xì)胞增殖及各種炎癥因子以及IgE的分泌，上調(diào)IgA、IgG。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)[13-14]，呼吸道合胞病毒可激活呼吸道上皮細(xì)胞核因子κB并產(chǎn)生趨化因子，而維生素D對(duì)核因子κB信號(hào)通路有抑制作用，反饋性促進(jìn)β型干擾素和抗菌肽的釋放，從而減輕炎性反應(yīng)，抑制病毒復(fù)制，促進(jìn)病情康復(fù)，與本研究結(jié)果相符。

PBMCs是人體免疫活性細(xì)胞的集合，對(duì)機(jī)體的免疫應(yīng)答起到關(guān)鍵作用[15]。而STAT1、STAT2、IRF9是JAK-STAT通路中產(chǎn)生的特異性分子，因此本研究通過(guò)檢測(cè)PBMCs中STAT1、STAT2、IRF9表達(dá)來(lái)探討維生素D如何通過(guò)JAK-STAT信號(hào)通路對(duì)毛細(xì)支氣管炎患兒免疫應(yīng)答的影響。結(jié)果顯示，兩組患兒治療前的PBMCs中STAT1、STAT2、IRF9表達(dá)水平相當(dāng)，而治療后對(duì)照組患兒的PBMCs中STAT1、STAT2、IRF9表達(dá)未見(jiàn)明顯變化，而觀察組患兒PBMCs中STAT1、STAT2、IRF9表達(dá)則出現(xiàn)明顯上調(diào)，顯著高于治療前，這一結(jié)果提示維生素D的補(bǔ)充可激活毛細(xì)支氣管炎患兒PBMCs中JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促使該通路中STAT1、STAT2、IRF9等的表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答[16]。Fink等的研究發(fā)現(xiàn)[17]，STAT2、IRF9等均參與機(jī)體的特定轉(zhuǎn)錄程序調(diào)控，對(duì)機(jī)體的免疫應(yīng)答有較大影響。也有國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)[18-19]，JAK-STAT信號(hào)通路中，轉(zhuǎn)導(dǎo)分子STAT1、STAT2、IRF-9等可減弱單核-巨噬細(xì)胞的抗原呈遞作用。也有研究認(rèn)為[20-21]，并影響單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，最終抑制相關(guān)炎癥細(xì)胞因子的分泌，調(diào)控相關(guān)抗生物肽基因的表達(dá)，這可能是維生素D通JAK/STAT信號(hào)通路影響毛細(xì)支氣管炎患兒免疫應(yīng)答的機(jī)制之一，但維生素D到底如何激活JAK/STAT信號(hào)通路從而影響機(jī)體免疫應(yīng)答的詳細(xì)機(jī)制尚不明確，將會(huì)是后續(xù)的主要研究方向。

綜上所述，維生素D可激活毛細(xì)支氣管炎患兒PBMCs中JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)STAT1、STAT2、IRF-9等特異性分子表達(dá)的上調(diào)，加強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答，促進(jìn)患兒病情好轉(zhuǎn)。