小麥單位面積穗數(shù)和粒長主效QTL緊密連鎖KASP標(biāo)記的開發(fā)及其效應(yīng)評(píng)價(jià)

范濤，李治，蔣慶，陳姝霖，歐霞，陳永艷，任天恒

小麥單位面積穗數(shù)和粒長主效QTL緊密連鎖KASP標(biāo)記的開發(fā)及其效應(yīng)評(píng)價(jià)

范濤，李治，蔣慶，陳姝霖，歐霞，陳永艷，任天恒

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/四川省植物遺傳和育種省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130

【】小麥單位面積穗數(shù)和籽粒粒長是小麥產(chǎn)量相關(guān)的重要農(nóng)藝性狀，對(duì)其進(jìn)行遺傳改良有利于提高小麥的產(chǎn)量。通過對(duì)前期QTL定位鑒定到的提高單位面積穗數(shù)的主效QTL位點(diǎn)和提高籽粒粒長的主效QTL位點(diǎn)開發(fā)相應(yīng)的KASP分子標(biāo)記，并在川農(nóng)18和T1208構(gòu)建的RILs群體中進(jìn)行驗(yàn)證及評(píng)價(jià)，為更好地利用這兩個(gè)QTL以及分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。利用前期在川農(nóng)18和T1208構(gòu)建的高代自交群體中鑒定到的控制小麥單位面積穗數(shù)主效QTL位點(diǎn)和控制籽粒粒長主效QTL位點(diǎn)，結(jié)合在這兩個(gè)QTL區(qū)間內(nèi)的55K SNP分子標(biāo)記序列，開發(fā)設(shè)計(jì)KASP分子標(biāo)記，并在親本間篩選具有多態(tài)性的KASP分子標(biāo)記。將篩選到的KASP分子標(biāo)記在川農(nóng)18×T1208的RILs群體中分別進(jìn)行基因分型和鑒定相應(yīng)表型性狀的高低，并分析這兩個(gè)主效QTL對(duì)于其他農(nóng)藝性狀的影響。和在親本中具有多態(tài)性，和在群體中的驗(yàn)證表明這兩個(gè)分子標(biāo)記分別與和連鎖。和能將群體材料的基因型分為2類，按照表型劃分，在3年試驗(yàn)中，對(duì)多穗材料的平均選擇率均達(dá)到72.58%，對(duì)少穗材料的平均選擇率達(dá)到71.68%；對(duì)長粒材料的平均選擇率達(dá)到69.86%，對(duì)短?；蛐偷钠骄x擇率可達(dá)61.52%，表明這兩個(gè)標(biāo)記的可靠性。基于KASP分子標(biāo)記的基因分型結(jié)果表明，這兩個(gè)QTL對(duì)于株高、千粒重、粒長、粒寬、粒徑比、單位面積穗數(shù)、穗粒重均具有顯著性影響。在川農(nóng)17×川農(nóng)11的RILs群體中進(jìn)行驗(yàn)證也表明這兩個(gè)分子標(biāo)記對(duì)相應(yīng)性狀的選擇具有一定的作用。針對(duì)單位面積穗數(shù)主效QTL位點(diǎn)和籽粒粒長主效QTL位點(diǎn)分別開發(fā)了1對(duì)與之連鎖的KASP分子標(biāo)記，可用于相應(yīng)性狀的選擇，與KASP標(biāo)記連鎖的QTL分別能顯著提高單位面積穗數(shù)和籽粒粒長。對(duì)株高、千粒重、粒長、粒寬、粒徑比、穗粒重是負(fù)向影響，對(duì)株高、千粒重、粒寬、粒徑比和穗粒重是正向影響，但對(duì)單位面積穗數(shù)是負(fù)向影響，這兩個(gè)QTL及開發(fā)的KASP標(biāo)記可應(yīng)用于小麥高產(chǎn)育種中。

小麥；單位面積穗數(shù)；粒長；QTL；KASP；農(nóng)藝性狀

0 引言

【研究意義】普通小麥（L.）是世界上最重要的糧食作物之一，“養(yǎng)育”了世界范圍內(nèi)大約三分之一的人口。在所有的人類食物中，小麥提供的蛋白質(zhì)和卡路里約占20%[1]。但是，根據(jù)預(yù)測(cè)，到2050年糧食的產(chǎn)量至少每年保持2.4%的增長率才能滿足需求[2]。單位面積穗數(shù)、千粒重和每穗粒數(shù)是小麥主要的產(chǎn)量決定因素，因此，在育種中識(shí)別和引入相關(guān)的有利等位基因或QTL，對(duì)提高小麥產(chǎn)量具有重要意義。小麥的產(chǎn)量三要素單位面積穗數(shù)、穗粒數(shù)和粒重都是復(fù)雜的農(nóng)藝性狀，利用表型選擇進(jìn)行小麥的高產(chǎn)育種不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，育種周期長從而導(dǎo)致育種成本提高。然而，與小麥產(chǎn)量單位面積穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒重相關(guān)的有利等位基因（或QTL）緊密連鎖的分子標(biāo)記的開發(fā)可以快速鑒定、識(shí)別相應(yīng)的基因（或QTL），節(jié)約育種成本，提高育種效率。【前人研究進(jìn)展】小麥籽粒粒重主要由籽粒形態(tài)決定，包括2個(gè)主要因素，即粒長和粒寬。目前分布在小麥所有染色體上的小麥籽粒形態(tài)以及千粒重相關(guān)的QTL已有諸多報(bào)道[3]。并且，與粒重或籽粒形態(tài)相關(guān)的、、、等基因也已經(jīng)被克隆[4-7]。除此之外，還開發(fā)出許多與小麥粒重相關(guān)的功能基因的分子標(biāo)記，并應(yīng)用于育種上[8]。迄今為止，國內(nèi)外研究學(xué)者利用不同的研究群體，將小麥單位面積穗數(shù)的相關(guān)的QTL定位在1A、1B、1D、2A、2B、2D、3A、3B、4A、4B、5A、5B、5D、6A、7A、7B、7D等多條染色體上，并且開發(fā)了較多的分子標(biāo)記[3,9-12]。但是相應(yīng)的分子標(biāo)記大多具有品種特異性，因此，并未應(yīng)用到實(shí)際育種中。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，利用分子標(biāo)記輔助育種作為一種傳統(tǒng)育種方法的補(bǔ)充工具，越來越受到育種家們的廣泛關(guān)注。劉子會(huì)等[13]通過簡單關(guān)聯(lián)分析鑒定到一個(gè)與小麥耐熱相關(guān)的分子標(biāo)記。陳泠等[14]對(duì)2個(gè)抗穗發(fā)芽的分子標(biāo)記和進(jìn)行了有效性驗(yàn)證。LI等[15]針對(duì)小麥的穗頸長主效QTL開發(fā)了一個(gè)KASP分子標(biāo)記，能夠有效追蹤該性狀。MA等[16]開發(fā)了一個(gè)與粒長、粒寬和千粒重主效QTL緊密連鎖的KASP分子標(biāo)記，并且在重組自交群體中驗(yàn)證了它的有效性。胡洋山等[10]驗(yàn)證了2個(gè)分別位于3A和3B染色體上的SSR標(biāo)記與小麥分蘗成穗呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)性，并證明它們可用于小麥分蘗成穗數(shù)的篩選和育種?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】利用SNP開發(fā)出的KASP標(biāo)記篩選多穗和長粒小麥資源的研究仍鮮見報(bào)道。本文以分蘗成穗能力強(qiáng)的小麥品種川農(nóng)18和具有籽粒性狀優(yōu)良的新品系材料T1208構(gòu)建的371個(gè)RILs群體為材料，在前期研究中，通過QTL定位分析發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與提高單位面積穗數(shù)的主效且穩(wěn)定位于2D染色體上的QTL位點(diǎn)，在中國春參考基因組（IWGSC RefSeq v1.0）上的物理位置是82.19—95.90 Mb，此QTL在3個(gè)環(huán)境中被穩(wěn)定檢測(cè)到，平均LOD值為17.20，平均解釋表型變異率達(dá)到19.04%，遺傳效應(yīng)來源于川農(nóng)18；此外，3D染色體上定位到一個(gè)提高籽粒粒長的QTL位點(diǎn)，在中國春參考基因組（IWGSC RefSeq v1.0）上的物理位置是463.59—518.34 Mb，此QTL平均LOD值達(dá)到15.78，平均解釋表型變異率為9.40%，遺傳效應(yīng)來源于親本T1208，與以往研究對(duì)比，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)QTL都是控制相應(yīng)性狀的新QTL位點(diǎn)[17]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究依據(jù)QTL位點(diǎn)和區(qū)間內(nèi)55K SNP基因芯片中的SNP分子標(biāo)記設(shè)計(jì)KASP引物，并運(yùn)用川農(nóng)18×T1208雜交構(gòu)建的RIL群體進(jìn)行驗(yàn)證，評(píng)估這兩個(gè)QTL對(duì)產(chǎn)量相關(guān)農(nóng)藝性狀的效應(yīng)，以期為小麥分子標(biāo)記輔助育種和多性狀聚合育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 小麥田間材料及種植

供試材料一共445份，其中包括由川農(nóng)18×T1208雜交構(gòu)建的371個(gè)家系的重組自交系（RILs）用于KASP標(biāo)記的開發(fā)，由川農(nóng)17×川農(nóng)11雜交構(gòu)建的74個(gè)RILs群體為驗(yàn)證群體。川農(nóng)18×T1208雜交構(gòu)建的RILs群體于2015—2016、2016—2017、2017—2018、2018—2019、2019—2020年（以下簡稱2015、2016、2017、2018和2019）種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥育種基地（四川省邛崍市，30°25′N，103°28′E，海拔493.3 m），川農(nóng)17×川農(nóng)11構(gòu)建的RILs群體于2019—2020年（以下簡稱2019）種植于相同地點(diǎn)。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，小區(qū)行長2 m，每行10株，行距0.25 m，每個(gè)株系種植4行，3次重復(fù)，栽培管理同大田標(biāo)準(zhǔn)化管理方法，使用除草劑和殺菌劑，以保證生長過程中田間無蟲害和病害，避免對(duì)相應(yīng)農(nóng)藝性狀的影響。在以SNP基因分型和相應(yīng)性狀的表型匹配中，表型選擇以當(dāng)年群體材料中表型平均值為標(biāo)準(zhǔn)劃分，川農(nóng)18×T1208的RILs群體在2015、2016和2017單位面積穗數(shù)平均值分別是291.06、280.80和258.38穗/m2，當(dāng)年群體中高于此表型值的定義為多穗株系，粒長在2016、2018和2019年的平均值分別是7.27、7.22和6.82 mm，當(dāng)年群體中高于此表型值的定義為長粒株系。川農(nóng)17×川農(nóng)11雜交構(gòu)建的RILs群體中單位面積穗數(shù)和粒長平均值分別是238.50穗/m2和6.90 mm，高于此表型值的材料分別定義為多穗株系和長粒株系。

1.2 小麥各農(nóng)藝性狀的調(diào)查

在植株成熟后，調(diào)查株高，株高的調(diào)查是從土壤表面到植株的頂端（不包含麥芒）；單位面積穗數(shù)調(diào)查則是每行調(diào)查5株，每個(gè)株系3個(gè)重復(fù)，最后取平均值，再乘以4得到每平方米單位面積穗數(shù)；收獲時(shí)每個(gè)株系收獲10穗，脫粒稱取重量后，計(jì)算每穗粒重，公式為每穗粒重=十穗粒重/10。采用萬深SC-G自動(dòng)考種分析及千粒重分析儀（由杭州萬深檢測(cè)科技有限公司生產(chǎn)）測(cè)定千粒重、粒長和粒寬。

1.3 KASP引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜上的信息[18]，分別查找位于內(nèi)的SNP分子標(biāo)記、、、和，以及位于內(nèi)的SNP分子標(biāo)記和，這些SNP標(biāo)記的序列如表1所示，根據(jù)它們的SNP序列，使用在線網(wǎng)站平臺(tái)PolyMarker（http://www.polymarker.info/）針對(duì)上述SNP分子標(biāo)記分別進(jìn)行KASP引物設(shè)計(jì)（表2）。每對(duì)KASP引物由3條DNA序列組成，分別是正向引物1、正向引物2和反向引物。另外每條正向引物1的5′端加上FAM熒光基團(tuán)接頭序列，序列為5′-GAAGGTGACC AAGTTCATGCT-3′，正向引物2的5′端加上HEX熒光基團(tuán)接頭序列，序列為5′-GAAGGTCGGAGTCA ACGGATT-3′。引物的合成由北京擎科生物科技有限公司完成。

1.4 KASP引物多態(tài)性篩選及群體中驗(yàn)證

對(duì)親本川農(nóng)18和T1208隨機(jī)選取10粒種子，于培養(yǎng)皿中發(fā)芽培養(yǎng)至三葉期，根據(jù)李榮華等[19]方法并稍做改進(jìn)提取基因組DNA，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。利用上述設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為4.5 μL 1×KASP Master mixture（LGC Genomics, Hoddeston, UK）、2 μL（50 ng·μL-1）基因組DNA、2 μL KASP引物mix（正向引物1﹕正向引物2﹕反向引物﹕水=6﹕6﹕15﹕23）和1.5 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃10 min；95℃20 s，61℃40 s，循環(huán)10次，每次循環(huán)退火延伸溫度下降0.6℃；95℃20 s，55℃40 s，循環(huán)30次；25℃保溫，采集熒光信號(hào)。PCR反應(yīng)在熒光定量PCR儀進(jìn)行（BioRad，CFX-96）。利用篩選出來具有多態(tài)性的KASP標(biāo)記在川農(nóng)18×T1208構(gòu)建的371個(gè)株系的RILs群體進(jìn)行基因分型，以及在川農(nóng)17×川農(nóng)11雜交構(gòu)建的74個(gè)RILs群體進(jìn)行驗(yàn)證，PCR的反應(yīng)條件同上。

表1 試驗(yàn)中涉及的SNP標(biāo)記及序列

表2 試驗(yàn)中涉及的KASP分子標(biāo)記引物序列

下劃線部分代表熒光接頭序列 The underlined part represents the fluorescent junction sequence

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用軟件Microsoft Excel 2016和SPSS 22（IBM SPSS, Armonk，NY，USA）對(duì)農(nóng)藝性狀等數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、檢驗(yàn)、相關(guān)性分析和描述性統(tǒng)計(jì)分析。參照李聰?shù)萚20]方法計(jì)算各農(nóng)藝性狀最佳線性無偏預(yù)測(cè)（best linear ubiased prediction，BLUP）值。利用CFX96熒光定量PCR儀的配套軟件BioRad CFX Manager的基因分型模塊，讀取各樣品不同熒光信號(hào)值，并分析基因型?；蚍中徒Y(jié)果與川農(nóng)18相同的基因型定義為多穗基因型株系，與T1208相同的基因型定義為少穗基因型株系；基因分型結(jié)果與T1208相同的基因型定義為長?；蛐椭晗?，與川農(nóng)18相同的基因型定義為短?；蛐椭晗怠?/p>

2 結(jié)果

2.1 川農(nóng)18×T1208 RILs群體中單位面積穗數(shù)和粒長表型變異分析

在該群體中，單位面積穗數(shù)在2015、2016和2017年的平均值分別是291.06、280.80和258.38穗/m2，表型變異范圍分別是185.3—442.7、179.3—387.3和120.0—442.7穗/m2；粒長在2016、2018和2019年的平均值分別是7.27、7.22和6.82 mm，表型變異范圍是6.20—8.80、6.15—8.60和5.74—8.13 mm。單位面積穗數(shù)與粒長呈顯著性負(fù)相關(guān)（=-0.44，＜0.001）。

2.2 KASP引物篩選結(jié)果

篩選區(qū)間內(nèi)引物時(shí)發(fā)現(xiàn)，在親本中具有多態(tài)性，該引物對(duì)親本川農(nóng)18分型結(jié)果是等位基因1類型，發(fā)出FAM熒光類型，T1208則是等位基因2類型，發(fā)出HEX熒光類型。其余設(shè)計(jì)的KASP引物不能很好地同時(shí)將2個(gè)親本基因型識(shí)別出來（圖1-a）。

篩選區(qū)間內(nèi)引物時(shí)發(fā)現(xiàn)，在親本中具有多態(tài)性，此引物對(duì)親本川農(nóng)18分型結(jié)果是等位基因1類型，發(fā)出FAM熒光類型，T1208則是等位基因2類型，發(fā)出HEX熒光類型。其余設(shè)計(jì)的KASP引物不能很好地同時(shí)將2個(gè)親本基因型識(shí)別出來（圖1-b）。

a：KASP-AX-111151907對(duì)親本基因分型；b：KASP-AX-109962767對(duì)親本基因分型

2.3 分子標(biāo)記KASP-AX-111151907和KASP-AX- 109962767在RILs群體中分型結(jié)果

利用篩選到的多態(tài)性引物對(duì)上述371個(gè)川農(nóng)18×T1208的RILs群體進(jìn)行基因分型。該引物對(duì)群體中不同的材料能夠很好的進(jìn)行分型，各信號(hào)點(diǎn)熒光值較高，且不同基因型之間的夾角較大（圖2-a），因此，分型效果較好。與親本川農(nóng)18相同的多穗基因型信號(hào)聚合在X軸，親本T1208相同的少穗基因型信號(hào)聚合在Y軸。對(duì)371個(gè)株系的分型結(jié)果顯示，有2個(gè)株系是雜合基因型，因此，在后續(xù)的分析中也剔除掉它們進(jìn)行分析。引物鑒定到的369個(gè)株系中有158個(gè)株系是多穗基因型，這些多穗基因型中對(duì)應(yīng)的多穗表型株系在2015、2016和2017年分別有99、122和123株，對(duì)應(yīng)的多穗材料選擇率分別是62.66%、77.22%和77.85%；剩下的211個(gè)株系是少穗基因型，其對(duì)應(yīng)的少穗表型株系在2015、2016和2017年分別有148、151和155株，對(duì)應(yīng)的少穗材料選擇率分別是70.01%、71.56%和73.46%。在2015、2016和2017年分別有164、183和180株多穗表現(xiàn)型的材料，其中多穗基因型分別有100、183和180株，因此，這3年多穗材料中多穗基因型分別占60.98%、86.89%和88.33%。159個(gè)多穗基因型株系在2015、2016和2017年的表型平均值分別是311.60、303.41和290.50穗/m2，211個(gè)少穗基因型株系在2016、2018和2019年的平均值分別是275.56、263.75和234.36穗/m2。2種基因型材料在單位面積穗數(shù)上存在顯著性差異（＜0.001），表明與緊密連鎖（表3和圖3-a）。

利用篩選到的多態(tài)性引物對(duì)川農(nóng)18×T1208的RILs群體進(jìn)行基因分型，結(jié)果與類似，對(duì)不同基因型材料的分型結(jié)果較好（圖2-b）。該引物將與親本T1208相同的長粒基因型信號(hào)聚合在Y軸，與親本川農(nóng)18相同的短粒基因型聚合在X軸。對(duì)371個(gè)株系基因分型結(jié)果顯示，有8個(gè)株系是雜合基因型，因此，在后續(xù)的分析中剔除掉它們進(jìn)行分析。鑒定到的363個(gè)株系中，有188個(gè)株系是長粒基因型，這些長粒基因型對(duì)應(yīng)的長粒表型株系在2016、2018和2019年分別有127、132和135株，對(duì)應(yīng)的長粒材料選擇率分別是67.55%、70.21%和71.81%。剩下的175個(gè)株系是短?；蛐?，其對(duì)應(yīng)的短粒表型株系在2016、2018和2019年分別有104、114和105株，對(duì)應(yīng)的短粒材料的選擇率分別是59.43%、65.14%和60.00%。在2016、2018和2019年分別有199、194和206株長粒表型株系，而在這3年里長?；蛐头謩e有128、133和136株，因此，在這3年中長粒材料中長?；蛐头謩e占64.32%、68.56%和66.02%。188個(gè)長?；蛐椭晗翟?016、2018和2019年的平均值分別是7.43、7.45和7.64 mm，175個(gè)短?；蛐椭晗翟?016、2018和2019年的平均值分別是7.11、6.98和7.01 mm。2種基因型材料在粒長上存在顯著性差異（＜0.001），表明與緊密連鎖（表3和圖3-b）。

a：KASP-AX-111151907在RIL群體中部分基因分型結(jié)果；b：KASP-AX-109962767在RIL群體中部分基因分型結(jié)果

表3 基于KASP分子標(biāo)記驗(yàn)證QSn.sau-2D.2和QKl.sau-3D.2對(duì)相應(yīng)性狀的影響

括號(hào)中的“n”表示株系的數(shù)量；基因型A表示與川農(nóng)18相同，基因型B表示與T1208相同

“n” in brackets indicates the number of lines. Genotype A is the same as Chuannong18 and genotype B is the same as T1208

+：含有相應(yīng)QTL的株系，-：不含有相應(yīng)QTL的株系；***：在p＜0.001水平差異極顯著

另外，在這371個(gè)群體中，只有39個(gè)株系含有多穗基因型和長?；蛐?，有117個(gè)株系只含有多穗基因型而不含有長?；蛐?，有149株只含有長?；蛐投缓卸嗨牖蛐?，既不含有多穗基因型又不含有長?；蛐偷闹晗?8株。

2.4 基于KASP分子標(biāo)記基因分型評(píng)價(jià)這兩個(gè)主效QTL對(duì)其他產(chǎn)量相關(guān)性狀的影響

基于各農(nóng)藝性狀的BLUP值，針對(duì)上述2個(gè)分別連鎖的分子標(biāo)記和與連鎖的分子標(biāo)記分型結(jié)果，利用檢驗(yàn)分析這兩個(gè)QTL對(duì)于其他農(nóng)藝性狀的影響（表4）。結(jié)果表明，對(duì)于株高、千粒重、粒長、粒寬、粒徑比和每穗粒重都具有顯著性降低的影響（＜0.001），對(duì)于株高、千粒重、粒寬、粒徑比和每穗粒重有顯著性提高的作用，但是對(duì)于單位面積穗數(shù)是降低的作用（＜0.001）。

2.5 分子標(biāo)記KASP-AX-111151907和KASP-AX-109962767在其他群體中的檢驗(yàn)

為了驗(yàn)證本研究中在川農(nóng)18×T1208的RILs群體中開發(fā)的KASP標(biāo)記是否可用于其他材料中小麥單位面積穗數(shù)和粒長的篩選，利用川農(nóng)17×川農(nóng)11的74個(gè)RILs群體進(jìn)行基因分型（圖4），和能夠很好地將不同基因型的小麥材料進(jìn)行區(qū)分?；蚍中徒Y(jié)果顯示，有43個(gè)材料是多穗基因型，其中20個(gè)材料是多穗表現(xiàn)型，多穗材料選擇率是46.51%，有31個(gè)材料為少穗基因型，其中少穗表現(xiàn)型材料有14個(gè)，對(duì)于少穗材料的選擇率達(dá)到45.16%?；蚍中徒Y(jié)果顯示，長?；蛐陀?8個(gè)，其中17個(gè)為長粒表現(xiàn)型，長粒的選擇率達(dá)到44.74%，而短?；蛐陀?6個(gè)，其中短粒表現(xiàn)型有18個(gè)，對(duì)短?；蛐偷倪x擇率達(dá)到50.00%。表明這兩個(gè)分子標(biāo)記對(duì)川農(nóng)17×川農(nóng)11雜交群體中長粒和多穗的選擇具有一定的作用。

3 討論

3.1 協(xié)調(diào)型小麥

提高產(chǎn)量一直以來是眾多育種學(xué)家們的基本目標(biāo)。單位面積穗數(shù)、穗粒數(shù)和粒重作為小麥的產(chǎn)量三要素，與小麥的產(chǎn)量直接相關(guān)。四川盆地屬于中國的西南麥區(qū)，是典型的雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū)，陰天較多，光照少導(dǎo)致小麥的分蘗成穗能力弱，從而導(dǎo)致單位面積穗數(shù)減少，進(jìn)而造成產(chǎn)量下降[21-22]。在過去普遍的看法是四川盆地由于光照少和暖冬而存在“生態(tài)穗容量”，本課題組根據(jù)西南麥區(qū)的氣候特征、土壤類型、光照條件及栽培模式等選育的多穗?yún)f(xié)調(diào)型小麥，其代表品種有川農(nóng)12、川農(nóng)17和川農(nóng)18[23]。該類型的小麥品種能在保持較高穗重的前提下具有較高穗數(shù)，穗數(shù)及穗重相互補(bǔ)償能力較強(qiáng)，為打破中國西南小麥生態(tài)區(qū)“生態(tài)穗容量”的限制提供了新的思路[24]。在前期的研究中也發(fā)現(xiàn)川農(nóng)18控制單位面積穗數(shù)的主效QTL位于2D染色體上[17]，為闡明協(xié)調(diào)型小麥品種川農(nóng)18成穗能力機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。本研究中開發(fā)的與川農(nóng)18控制單位面積穗數(shù)的主效穩(wěn)定QTL位點(diǎn)緊密連鎖的KASP標(biāo)記將有助于育種人員開展多穗小麥品種的選育工作。

圖4 分子標(biāo)記KASP-AX-111151907（a）和KASP-AX-109962767（b）在川農(nóng)17×川農(nóng)11 RIL群體中驗(yàn)證的部分結(jié)果

表4 基于KASP分子標(biāo)記驗(yàn)證QSn.sau-2D.2和QKl.sau-3D.2對(duì)產(chǎn)量相關(guān)性狀的影響

***：在＜0.001水平差異極顯著，基因型A表示與親本川農(nóng)18相同的基因型，基因型B表示與親本T1208相同的基因型

***: significant at the level of<0.001, genotype A is the same genotype as parent Chuannong 18, and genotype B is the same genotype as parent T1208

3.2 多穗和長粒KASP標(biāo)記的利用

傳統(tǒng)的雜交育種可以將不同的優(yōu)良等位基因聚合在一起，獲得理想性狀，但是具有很大的局限性，對(duì)相應(yīng)性狀分子遺傳機(jī)制不了解，育種周期長，并且需要花費(fèi)大量時(shí)間和精力來鑒定表型，從而導(dǎo)致育種成本的提高，育種效率低下[25]。分子標(biāo)記輔助育種如SSR標(biāo)記、CAPS標(biāo)記等已經(jīng)廣泛應(yīng)用于小麥的育種工作中，張兆萍等[26]利用4個(gè)與穗發(fā)芽抗性相關(guān)的標(biāo)記在350份不同小麥種質(zhì)材料進(jìn)行驗(yàn)證，最終篩選出2個(gè)分子標(biāo)記可用于穗發(fā)芽抗性篩選，為篩選抗穗發(fā)芽小麥品種提供理論指導(dǎo)。Wang等[27]根據(jù)粒重相關(guān)基因的多態(tài)性序列開發(fā)了相應(yīng)的CAPS標(biāo)記，能夠有效區(qū)分不同等位基因從而達(dá)到篩選具有更高粒重的小麥品種。SNP分子標(biāo)記作為植物基因組中最豐富的一類分子標(biāo)記類型，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建，遺傳變異分析等[28]。但是其在分子標(biāo)記輔助育種應(yīng)用程度仍然不夠普遍化[29]。本研究中開發(fā)的2個(gè)KASP分子標(biāo)記，其中單位面積穗數(shù)相關(guān)的KASP分子標(biāo)記在川農(nóng)18×T1208雜交構(gòu)建的RILs群體中能有效地對(duì)多穗基因型材料進(jìn)行選擇，在多年試驗(yàn)條件下，對(duì)多穗基因型材料的平均選擇率可達(dá)到72.58%，對(duì)低穗基因型的材料平均選擇率可達(dá)71.68%，而在多穗材料中，3年試驗(yàn)條件下，多穗基因型分別占了60.98%、86.89%和88.33%，而在川農(nóng)17×川農(nóng)11雜交構(gòu)建的RIL群體中該標(biāo)記對(duì)于多穗基因型的選擇率可達(dá)46.51%，以上結(jié)果表明本研究開發(fā)的用于篩選多穗材料的KASP分子標(biāo)記可靠性較高。值得注意的是，在本研究中單位面積穗數(shù)KASP分子標(biāo)記對(duì)于多穗基因型材料的選擇率分析是建立在稀播的基礎(chǔ)上，以往的研究表明小麥品種川農(nóng)18在大田生產(chǎn)密度下相比于對(duì)照成穗數(shù)顯著性增加[23]，因此，在大田種植密度下該分子標(biāo)記對(duì)于多穗基因型材料的選擇率應(yīng)該會(huì)有所增加。另外，本研究中開發(fā)的與粒長相關(guān)的KASP分子標(biāo)記，在川農(nóng)18×T1208雜交構(gòu)建的RILs群體中對(duì)長?；蛐偷钠骄x擇率可達(dá)69.86%，對(duì)短?；蛐偷钠骄x擇率可達(dá)61.52%，在長粒材料中，3年試驗(yàn)條件下，長?；蛐头謩e占了64.32%、68.56%和66.02%，而在川農(nóng)17×川農(nóng)11雜交構(gòu)建的RIL群體中該標(biāo)記對(duì)于長?；蛐偷倪x擇率達(dá)44.74%，以上結(jié)果表明本研究開發(fā)的用于篩選長粒材料的KASP分子標(biāo)記可靠性較高。本研究中多穗表型材料中多穗基因型占比和長粒表型材料中長?；蛐驼急炔⑽催_(dá)到百分之百，可能的原因是因?yàn)檫@兩個(gè)性狀都屬于數(shù)量性狀由多基因控制，除了鑒定到的穩(wěn)定主效QTL控制以外，還有許多微效基因共同控制相應(yīng)的性狀，而在之前的研究中也表明了單位面積穗數(shù)和粒長還有諸多微效QTL控制[17]。

基因聚合育種與傳統(tǒng)聚合育種相結(jié)合已經(jīng)成為了已經(jīng)成為當(dāng)今作物育種的新思路，并且已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，如SALAMEH等[30]通過分子標(biāo)記輔助育種選擇將春小麥品系CM-82036的和這兩個(gè)抗性主效基因?qū)氲?個(gè)歐洲冬小麥品系中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)和聚合在一起時(shí)對(duì)赤霉病的抗性相比于單獨(dú)更強(qiáng)。眾所周知，由于營養(yǎng)競(jìng)爭的關(guān)系，小麥的穗數(shù)增加，往往伴隨著粒重的下降[31-33]。因此，如果將增加粒重的基因與增加穗數(shù)的基因聚合在一起，理論上小麥的產(chǎn)量將得到提高。在本研究中，川農(nóng)18×T1208的RILs群體中，有39個(gè)株系同時(shí)含有增加穗數(shù)和粒長的基因型，但是它們具體的產(chǎn)量表現(xiàn)如何，還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

3.3 多穗和長粒KASP分子標(biāo)記的其他用途

在小麥的產(chǎn)量相關(guān)性狀中，各農(nóng)藝性狀之間往往具有顯著的相關(guān)性，如小麥的千粒重與粒長、粒寬之間呈現(xiàn)顯著性正相關(guān)，而與單位面積穗數(shù)、小穗數(shù)呈現(xiàn)出顯著性負(fù)相關(guān)[34]。這往往歸功于基因的“一因多效”，基因的“一因多效”在植物中廣泛存在，如小麥的矮稈基因也多次被報(bào)道對(duì)于多個(gè)農(nóng)藝性狀具有影響，包括株高、千粒重、粒寬、單位面積穗數(shù)、旗葉大小等[17]。Lin等[35]定位到的2個(gè)控制小麥籽粒灌漿速度的QTL也同時(shí)對(duì)千粒重、粒長、粒寬、籽粒體積、籽粒面積、籽粒周長具有顯著性影響。在本研究中，具有多穗基因型的株系在株高、千粒重、粒長、粒寬、粒徑比和穗粒重方面都顯著性低于少穗基因型的株系；具有長?；蛐偷闹晗翟谥旮?、千粒重、粒寬、粒徑比和穗粒重方面顯著高于短?；蛐椭晗?，在單位面積穗數(shù)上顯著性低于短粒株系，這也表明本研究中開發(fā)的2個(gè)KASP分子標(biāo)記對(duì)于農(nóng)藝性狀株高、千粒重、粒長、粒寬、粒徑比、單位面積穗數(shù)和穗粒重的選擇上都具有一定的作用。

4 結(jié)論

開發(fā)的與單位面積穗數(shù)相關(guān)的KASP分子標(biāo)記和粒長相關(guān)的KASP分子標(biāo)記能夠分別區(qū)分川農(nóng)18×T1208構(gòu)建的RILs群體中的單位面積穗數(shù)和籽粒粒長的基因型，并有效鑒定單位面積穗數(shù)和粒長表型值的相對(duì)高低，可用于小麥高產(chǎn)育種。

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Development and Effect Evaluation of KASP Markers Closely Linked to Major QTLs of Spike Number Per Unit Area and Grain Length in Wheat

FAN Tao, LI Zhi, JIANG Qing, CHEN ShuLin, OU Xia, CHEN YongYan, REN TianHeng

College of Agronomy, Sichuan Agricultural University/Provincial Key Laboratory of Plant Genetics and Breeding of Sichuan Province, Chengdu 611130

】Spike numbers per unit area (SN) and kernel length (KL) are both important yield-related traits of wheat. Genetic improvement on SN and KL will help increase the yield of wheat. The corresponding KASP molecular markers were developed for theand the QTL, which were identified in previous study for increasing SN and KL, respectively. Both KASP markers were verified and evaluated in the RIL population crossed by Chuannong 18 and T1208, which laid a foundation for better utilization of these two QTLs.【】The major QTLfor SN and the major QTLfor KL were previously identified in the RIL population crossed by Chuannong 18 and T1208. The SNP molecular marker sequence of Wheat 55K SNP array within the two QTLs were used to develop and design the KASP molecular markers. The polymorphic KASP markers were screened with wheat parents and then verified in the RIL population. The selected KASP molecular markers were genotyped and used to identify the corresponding phenotypic traits in Chuannong 18×T1208 RILs population. The effects of the two major QTLs on other agronomic traits were analyzed.【】andhave polymorphic between the wheat parents. Subsequently, these two KASP markers were verified in the RIL population linkage withand, respectively.andcould divide the genotypes into two groups. According to the phenotype, the average selection rate offor multi spike lines was 72.58%, the average selection rate offor few spike lines was 71.68%, the average selection rate offor long kernel lines was 69.86%, and the average selection rate offor short kernel lines was 61.52%, indicating the reliability of the two KASP markers. Moreover, the genotyping results based on KASP molecular markers showed that the two QTLs had significant effects on plant height, 1000 kernel weight, kernel length, kernel width, kernel diameter ratio, spike numbers per unit area and kernel weight per spike, respectively. The validation in the RIL population of Chuannong17×Chuannong11 also indicated that these two KASP markers had a certain effect on the selection of the corresponding traits.【】This study developed two KASP markers for two major QTLand, respectively. Both KASP markers can be used for the selection of corresponding traits. These two QTLs which are tightly linked to these two KASP markers could significantly improve the SN and KL, respectively. In addition,had negative effects on plant height, 1000 kernel weight, kernel length, kernel width, kernel diameter ratio and kernel weight per spike. On the other hand,had positive effect on plant height, 1000 kernel weight, kernel width, kernel diameter ratio and kernel weight per spike, but had negative effects on SN. These two QTLs and the developed KASP markers can be used in the future high yield wheat breeding program.

wheat; spike numbers per unit area; kernel length; QTL; KASP; agronomic traits

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.14.002

2020-12-12；

2021-02-03

國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（31801357）、四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（2019YJ0510、2019YJ0509）、四川省科技創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)苗子工程項(xiàng)目（2021JDRC0127）

范濤，E-mail：18328080816@163.com。通信作者任天恒，E-mail：renth@sicau.edu.cn

（責(zé)任編輯 李莉）