人漿液性卵巢癌細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的建立及其在化療藥物敏感性檢測(cè)中的應(yīng)用

葛京京,徐紅霞,2,謝麗霞,杜凱麗,桑 明,2,3,孫曉東,2,3

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，湖北 襄陽(yáng)441000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院 湖北省帕金森病臨床研究中心，湖北 襄陽(yáng)441000；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院 武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 十堰442000）

手術(shù)結(jié)合化療是卵巢癌治療的重要手段之一，但是個(gè)體腫瘤對(duì)藥物的敏感性存在較大差異。有研究［1-2］顯示：卵巢癌患者對(duì)藥物的敏感性與臨床預(yù)后有明顯關(guān)聯(lián)。如何預(yù)測(cè)不同個(gè)體腫瘤對(duì)藥物的敏感性并指導(dǎo)臨床治療已成為癌癥個(gè)體化精準(zhǔn)治療的重要內(nèi)容。因此，以抗癌藥物個(gè)體化治療為目的的化療藥物敏感性試驗(yàn)愈來(lái)愈受到重視。目前，大部分研究采取從腫瘤組織中消化分離出細(xì)胞后直接進(jìn)行藥敏檢測(cè)［2-3］，不對(duì)所分離的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，該類(lèi)細(xì)胞中可能包括了除癌細(xì)胞以外的大量成纖維細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等。也有研究［4］采取從腫瘤組織中提取培養(yǎng)卵巢癌干細(xì)胞球進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，但干細(xì)胞球的培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng)，而且需要額外添加生長(zhǎng)因子，增加了檢測(cè)成本。本研究采用酶消化和差速離心分離后反復(fù)貼壁的方法從人卵巢癌組織中分離純化出原代卵巢癌細(xì)胞，該方法獲取的原代細(xì)胞活性高、增殖速度快，可為后續(xù)藥敏試驗(yàn)提供鑒定正確的漿液性卵巢癌細(xì)胞。

1 資料與方法

1.1 主要試劑和儀器DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基和PBS緩沖液（美國(guó)Gibco公司），Ⅱ型膠原酶（北京索萊寶科技有限公司），胎牛血清（美國(guó)HyClone公司），臺(tái)盼藍(lán)、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）、紫 杉 醇 （paclitaxel，PTX）、替莫唑胺（temozolomide，TMZ）、卡鉑（carboplatin，CBP）、阿霉素（doxorubicin，DOX）和褪黑素（melatonin，MLT）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，人癌抗原125（cancer antigen 125，CA-125）、配對(duì)盒基因8（paired box gene 8，PAX 8）、人附睪蛋白4（epididymis protein 4，HE4）、胚胎干細(xì)胞同源轉(zhuǎn)錄因子Nanog（14295-1-AP）和八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（octamer-binding transcription factor4，Oct-4）（60242-1-Ig）購(gòu)自中國(guó)武漢Proteintech公司，DyLigh488綠色山羊抗兔二抗和DyLigh594橙紅色山羊抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Abbkine公司。倒置相差顯微鏡和熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司），低溫臺(tái)式離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），生物安全柜（中國(guó)Heal Force公司）。

1.2 臨床卵巢癌組織收集經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審查并批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2018-TH-040），在患者及其家屬知情同意的情況下，采集1例卵巢癌患者手術(shù)切除的活體組織，立即置于含有雙倍濃度雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于4℃恒溫轉(zhuǎn)運(yùn)盒，30 min內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。

1.3 卵巢癌組織病理檢查卵巢癌組織蘇木精-伊紅（HE）染色病理切片由湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院病理科制作完成，在光鏡下觀察卵巢癌組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.4 原代卵巢癌細(xì)胞分離、培養(yǎng)和傳代在生物安全柜中，用PBS緩沖液清洗卵巢癌組織塊數(shù)次，剔除結(jié)締組織和血管等，剪成大小約1mm×1 mm×1 mm。以PBS緩沖液洗2～3次，視組織的量加入適量體積的2%Ⅱ型膠原酶，37℃恒溫消化20 min，每5 min搖勻1次。用等量含血清培養(yǎng)液終止消化，200 g離心3 min，將懸液吸出后經(jīng)200目濾網(wǎng)過(guò)濾，收集單細(xì)胞懸液。底部組織塊加入適量消化液繼續(xù)消化，重復(fù)后續(xù)步驟；取濾液300 g離心5 min，棄上清，細(xì)胞用完全培養(yǎng)基吹打混勻。合并細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度，取5×104個(gè)細(xì)胞進(jìn)行藥敏檢測(cè)，其余細(xì)胞以1×10?cm－2密度接種至T 25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。靜置培養(yǎng)4 h待大部分成纖維樣細(xì)胞貼壁后，將未貼壁細(xì)胞輕輕轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)瓶中，再靜置培養(yǎng)4 h后轉(zhuǎn)移未貼壁細(xì)胞，重復(fù)此過(guò)程2～3次，即可獲得貼壁生長(zhǎng)的卵巢癌細(xì)胞。因腫瘤細(xì)胞具有自泌性，產(chǎn)生促生物質(zhì)，故隔日半量或者1/4量更換培養(yǎng)液，將pH值維持在7.2～7.4。倒置顯微鏡觀察并拍照記錄。待細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶60%～80%后進(jìn)行傳代。傳代時(shí)先用PBS緩沖液洗滌2次，加入0.05%胰蛋白酶1 mL，濕潤(rùn)細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱37℃消化2～3 min，完全培養(yǎng)基終止消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1×10?cm－2密度進(jìn)行接種。

1.5 倒置相差顯微鏡下觀察卵巢癌細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)細(xì)胞接種后用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)并拍照，同時(shí)記錄細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.6 繪制卵巢癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)曲線(xiàn)將P1代及P5代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的卵巢癌細(xì)胞消化后采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為2×104mL－1，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，即為P2和P6代細(xì)胞，每孔接種1 mL，24孔板置于CO2養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔24 h收集3孔細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取平均值，連續(xù)計(jì)數(shù)8 d后繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.7 免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞中卵巢癌細(xì)胞標(biāo)記蛋白和干性相關(guān)蛋白表達(dá)情況棄除培養(yǎng)基，細(xì)胞用預(yù)冷的1×PBS緩沖液洗滌3次，每次5 min，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，預(yù)冷的1×PBS緩沖液洗3次，每次5 min，0.2%Triton X-100透化15 min，1×PBS緩沖液洗滌3次，每次5 min，5%BSA室溫封閉30 min后加一抗（CA 125、PAX8、HE4、Nanog和Oct-4，用1%BSA稀釋?zhuān)┲糜跐窈欣铮?℃過(guò)夜，1×PBS緩沖液洗滌3次，每次5 min，加二抗（用1%BSA稀釋?zhuān)┍芄夥跤?0 min，1×PBS緩沖液洗滌3次，每次5 min，Hochest復(fù)染細(xì)胞核5 min，1×PBS緩 沖 液 洗滌3次，每次5 min，防熒光猝滅劑封片，觀察目的蛋白熒光表達(dá)強(qiáng)度并拍照。

1.8 卵巢癌細(xì)胞藥物敏感性檢測(cè)將卵巢癌細(xì)胞懸液調(diào)至密度為5×104mL－1，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μL，培養(yǎng)24 h，更換含有不同濃度化療藥物的完全培養(yǎng)基（體積分?jǐn)?shù)＜1∶1 000），每種藥物按照其血漿峰值（plasma peak concentration，PPC）［5-9］，設(shè) 立5個(gè) 藥 物 測(cè) 試 濃 度（test drug concentration，TDC）：0×PPC、0.012 5×PPC、0.025 0×PPC、0.050 0×PPC、0.100 0×PPC，以0×PPC為對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入10μL CCK-8液，振蕩器上輕輕振蕩混勻2 min，繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h后用免疫酶聯(lián)檢測(cè)儀于450 nm處測(cè)定各孔吸光度（A）值，按照公式計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組A值－空白組A值）/（對(duì)照組A值－空白組A值）×100%。實(shí)驗(yàn)組藥物為5-FU、PTX、TMZ、CBP、DOX和MLT，藥 物 的0.1×PPC分 別 為5.0、0.5、1.0、5.0、1.0和5.0 mg·L－1。藥物敏感性檢測(cè)分為不同濃度5-FU（0、0.625、1.250、2.500和5.000 mg·L－1）組、PTX （0、0.062 5、0.125 0、0.250 0和0.500 0 mg·L－1）組、TMZ（0、0.125、0.250、0.500和1.000 mg·L－1）組、CBP（0、0.625、1.250、2.500和5.000 mg·L－1）組、DOX（0、0.125、0.250、0.500和1.000 mg·L－1）組及MLT（0、0.625、1.250、2.500和5.000 mg·L－1）組，其中0 mg·L－1組為對(duì)照組，

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 7統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析學(xué)。各組細(xì)胞存活率以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 卵巢癌患者腫瘤組織病理形態(tài)表現(xiàn)卵巢癌患者病理結(jié)果顯示：左右側(cè)卵巢手術(shù)切除的病灶組織均可見(jiàn)卵巢交界性漿液性乳頭狀囊性腫瘤細(xì)胞，病灶區(qū)為微乳頭狀型，臨床病理診斷為非浸潤(rùn)性漿液性卵巢癌。見(jiàn)圖1。

圖1 卵巢癌患者腫瘤組織病理形態(tài)表現(xiàn)(Bar=200μm)Fig.1Pathomorphology of tumor tissue in ovarian cancer patient(Bar=200μm)

2.2 卵巢癌細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)所提取的原代卵巢癌細(xì)胞具有貼壁生長(zhǎng)特性，培養(yǎng)4 h后即有細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)4 d后貼壁細(xì)胞分裂增殖，逐漸增多，培養(yǎng)至第12天，可觀察到原代卵巢癌細(xì)胞克隆布滿(mǎn)一個(gè)10×10倍的視野，細(xì)胞形態(tài)呈三角形、鱗片形和長(zhǎng)梭且有數(shù)個(gè)細(xì)胞突起。傳代后細(xì)胞貼壁且增殖加快，平均4～6 d能夠長(zhǎng)滿(mǎn)1瓶，形態(tài)較均一，以長(zhǎng)梭形和三角形為主。見(jiàn)圖2。

2.3 卵巢癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)曲線(xiàn)接種后第1天，細(xì)胞數(shù)目較接種時(shí)略少，為細(xì)胞潛伏適應(yīng)期；接種后第2～7天，細(xì)胞數(shù)目呈指數(shù)型增長(zhǎng)。生長(zhǎng)曲線(xiàn)基本為線(xiàn)性曲線(xiàn)，表明該段時(shí)間是細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第7天后曲線(xiàn)變得平緩，細(xì)胞增殖進(jìn)入平臺(tái)期，P2和P6代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)基本一致。見(jiàn)圖3。

2.4 免疫熒光法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞標(biāo)記蛋白細(xì)胞干性相關(guān)蛋白表達(dá)情況體外培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞至P3代，免疫熒光鑒定結(jié)果顯示：原代培養(yǎng)的細(xì)胞高表達(dá)漿液性卵巢癌細(xì)胞標(biāo)志蛋白PAX8、HE4和CA 125，CA 125和HE4于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，PAX8定位于胞核中，表明所培養(yǎng)的細(xì)胞具有漿液性卵巢癌細(xì)胞特性。見(jiàn)圖4。

體外培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞至P3代，免疫熒光鑒定結(jié)果顯示：卵巢癌細(xì)胞高表達(dá)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志蛋白Nanog和Oct-4，且定位于胞質(zhì)中，表明所培養(yǎng)的細(xì)胞具有癌細(xì)胞特性。見(jiàn)圖5。

2.5 卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥和褪黑素的敏感性本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)6種藥物在不同濃度下對(duì)卵巢癌細(xì)胞存活率的影響。藥物作用24 h后，CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示：TMZ、5FU、MLT和CBP對(duì)該患者卵巢癌細(xì)胞的活性均有明顯抑制作用。與相對(duì)應(yīng)對(duì)照組比較，不同濃度TMZ組、5-FU組、MLT組、CBP組及0.062 5和0.125 0 mg·L－1PTX組細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），且細(xì)胞存活率隨藥物濃度升高逐漸降低。以存活率＜50%為敏感，其中TMZ在0.1×PPC（0.5 mg·L－1）、5-FU在0.1×PPC（5 mg·L－1）、MLT在0.1×PPC（5 mg·L－1）和CBP在0.1×PPC（5 mg·L－1）時(shí)存活率均小于50%。檢測(cè)的化療藥物中DOX對(duì)該腫瘤細(xì)胞無(wú)抑制作用，PTX較低濃度對(duì)該患者腫瘤細(xì)胞的活性有抑制作用，但當(dāng)濃度升高到0.250 0 mg·L－1及以上時(shí)對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響。見(jiàn)圖6。

圖2 體外培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)Fig.2Morphology of ovarian cancer cells cultured in vitro

圖3 第2代(A)和第6代(B)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.3Growth curves of second-generation(A)and sixth-generation(B)ovarian cancer cells

3 討 論

卵巢癌是病理類(lèi)型復(fù)雜、腫瘤與非腫瘤組織混雜生長(zhǎng)的實(shí)體癌，根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型可分為上皮性腫瘤、性索-間質(zhì)腫瘤和生殖細(xì)胞腫瘤［10］。其中，占絕大比例的上皮性腫瘤確診時(shí)往往已經(jīng)為晚期，且與不良預(yù)后有關(guān)聯(lián)。漿液性上皮性卵巢癌是最常見(jiàn)的上皮性腫瘤亞型。本研究中漿液性卵巢癌組織樣本來(lái)自臨床發(fā)生復(fù)發(fā)的年輕的卵巢癌患者，首次手術(shù)考慮年齡因素及生育要求未進(jìn)行卵巢切除，術(shù)后進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)放化療，但是患者復(fù)發(fā)后瘤體生長(zhǎng)迅速。因此，本研究從手術(shù)切除的卵巢癌組織中分離原代卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，為其病理機(jī)制研究和化療藥物敏感性檢測(cè)提供方便的實(shí)驗(yàn)材料［11-12］，也為該患者的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖4 免疫熒光法檢測(cè)漿液性卵巢癌細(xì)胞標(biāo)志蛋白PAX8、HE4和CA125的表達(dá)情況及亞細(xì)胞定位（Bar=20μm）Fig.4Expressions and subcellular localization of PAX8，HE4 and CA125 in serous ovarian cancer cells identified by immunofluorescence assay(Bar=20μm)

圖5 免疫熒光法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞中Nanog和Oct-4蛋白表達(dá)情況及亞細(xì)胞定位（Bar=50μm）Fig.5ExpressionsandsubcellularlocalizationofNanogandOct-4inovariancancercellsdetectedby immunofluorescence assay(Bar=50μm)

圖6 不同濃度藥物作用后各組卵巢癌細(xì)胞的存活率Fig.6 Survival rates of ovarian cancer cells after treated with different concentrations of drugs

本研究采用酶消化和差速離心分離后反復(fù)貼壁的方法從人卵巢癌組織中提取和純化原代卵巢癌細(xì)胞，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，該技術(shù)較成熟而穩(wěn)定，且對(duì)細(xì)胞的損傷較少，從而使原代細(xì)胞的表型得以保留。通過(guò)免疫熒光法檢測(cè)漿液性卵巢癌細(xì)胞的標(biāo)志性 蛋 白CA 125［13-14］、PAX8［15-16］和HE4［14，17-18］的表達(dá)，證實(shí)所獲取和培養(yǎng)的原代卵巢癌細(xì)胞是漿液性卵巢癌細(xì)胞。同時(shí)，本文作者檢測(cè)了原代培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞“干性”標(biāo)志物的表達(dá)情況，結(jié)果顯示細(xì)胞中Nanog和Oct-4表達(dá)增強(qiáng)，可能與患者術(shù)后快速?gòu)?fù)發(fā)有關(guān)。

近年來(lái)，體外腫瘤細(xì)胞化療藥物敏感性檢測(cè)指導(dǎo)的個(gè)體化治療越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外腫瘤臨床醫(yī)學(xué)界的重視［19-21］。體外化療藥物敏感性試驗(yàn)的臨床價(jià)值主要體現(xiàn)在與患者療效有明顯一致性并與患者的預(yù)后有明顯相關(guān)性［20-22］。體外藥物敏感性檢測(cè)能夠較好地指導(dǎo)臨床用藥、提高臨床療效以及延長(zhǎng)患者的生存期，在腫瘤的臨床個(gè)體化治療中具有廣闊的應(yīng)用前景，是臨床腫瘤醫(yī)師化療前對(duì)藥物進(jìn)行前瞻性研究的有效工具。本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法進(jìn)行體外藥物敏感性檢測(cè)，根據(jù)不同濃度化療藥物作用下體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的存活率，比較各化療藥物對(duì)體外腫瘤細(xì)胞的敏感性，選擇相對(duì)最敏感的方案用于指導(dǎo)臨床化療，是指導(dǎo)卵巢癌化療的有效手段。

已有報(bào)道［23-25］顯示：MLT有化療藥增敏和抑癌作用。本文作者也發(fā)現(xiàn)MLT對(duì)該例患者的腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制效果。另外，有研究［26］顯示：MLT對(duì)卵巢癌細(xì)胞干性基因具有明顯的抑制效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示：TMZ、5FU、MLT和CBP在所檢測(cè)的藥物濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴(lài)性地抑制卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)，PTX在低濃度時(shí)對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用，但高濃度的PTX對(duì)細(xì)胞活性無(wú)影響；而DOX在最高濃度時(shí)對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)顯示出微弱的抑制效應(yīng)；提示本研究所檢測(cè)的卵巢癌細(xì)胞來(lái)源患者其化療如采用TMZ、5FU、MLT和CBP，可能有較好的臨床效果。

本研究建立了體外分離培養(yǎng)漿液性卵巢癌細(xì)胞的方法體系，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞干性標(biāo)記物表達(dá)強(qiáng)，體外化療藥物敏感性檢測(cè)表明該細(xì)胞對(duì)TMZ、5FU、MLT和CBP較為敏感。本研究可為卵巢癌病理機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為臨床化療提供用藥依據(jù)。