金銀花提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性前部葡萄膜炎小鼠的抗炎作用及其機(jī)制

李康寧,宋志領(lǐng),賈利龍,楚 妙,熊朝暉

（河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院眼科，河北 石家莊050031）

急性前部葡萄膜炎（acute anterior uveitis，AAU）是眼科臨床比較常見(jiàn)的葡萄膜炎癥性疾病，損傷葡萄膜和鄰近組織如視網(wǎng)膜、玻璃體，臨床主要表現(xiàn)為眼痛、羞明和視力減退。目前AAU的發(fā)病機(jī)制仍未完全明確，大部分研究者［1-2］認(rèn)為：炎癥反應(yīng)是促進(jìn)AAU發(fā)生發(fā)展的主要因素。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素6（interleukin6，IL-6）等促炎因子釋放，導(dǎo)致小鼠玻璃體內(nèi)發(fā)生急性炎癥反應(yīng)，廣泛應(yīng)用于AAU動(dòng)物模型的建立［3］。金銀花來(lái)源于忍冬科植物金銀花的花蕾及初開(kāi)的花，具有清熱解毒的功效，主治外感風(fēng)熱、熱毒血痢和癰腫疔瘡［4］。金銀花提取物含有綠原酸、異綠原酸、木犀草素、揮發(fā)油、總黃酮和三萜皂苷等生物活性物質(zhì)［5-7］，具有抗病毒、抗腫瘤和抗氧化等藥理作用［8-10］。研究［11］表明：金銀花提取物能夠明顯抑制單核-巨噬細(xì)胞的吞噬功能起抗炎作用。但金銀花提取物對(duì)AAU的抗炎作用在國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。本研究通過(guò)LPS誘導(dǎo)建立小鼠AAU模型，觀察金銀花提取物對(duì)AAU小鼠的抗炎作用，并探討其作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器BALB/c小鼠50只，SPF級(jí)，雄性，4周齡，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（冀）2018-008。飼養(yǎng)條件：室溫22℃～25℃，相對(duì)濕度55%～65%，自由飲水和攝食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。金銀花提取物（北京三友匯智生物技術(shù)有限公司，純度98%，固體粉末，使用時(shí)采用純水配制成50 g·L－1），LPS和HE染色試劑盒（美國(guó)Sigma公司），兔抗大鼠Toll樣受體4（Tolllike receptor 4，TLR4）和兔抗大鼠核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）多 克 隆 抗 體（美 國(guó)Abcam公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒（上海鈺博生物科技有限公司），引物由上海生物工程公司設(shè)計(jì)并合成，TNF-α、IL-6和白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（武漢博士德生物工程公司）。KD-2508型石蠟切片機(jī)（上海珂淮儀器有限公司），CX21型顯微鏡［奧林巴斯（中國(guó)）有限公司］，蛋白電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、T 100型梯度PCR儀和680型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和給藥［12］雄性BALB/c小 鼠50只隨機(jī)分為對(duì)照組，模型組，低、中和高劑量金銀花提取物組，每組10只。低、中和高劑量金銀花提取物組小鼠按照250、500和750 mg·kg－1金銀花提取物灌胃，對(duì)照組和模型組小鼠均給予等體積生理鹽水，連續(xù)給藥15 d。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制備參照參考文獻(xiàn)［13］方法。小鼠連續(xù)給藥15 d后，模型組及低、中和高劑量金銀花提取物組小鼠于玻璃體腔內(nèi)注射2μL LPS（125 mg·L－1）建立AAU小鼠模型，24 h后進(jìn)行臨床裂隙燈顯微鏡眼前段檢查，以小鼠出現(xiàn)角膜水腫、睫狀充血和前房炎癥為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 HE染色觀察小鼠眼組織病理形態(tài)表現(xiàn)每組各取5只小鼠，取右側(cè)眼球于多聚甲醛液中固定，梯度脫水，采用二甲苯透明，石蠟包埋，切片（厚度為4μm），HE染色，洗滌后采用乙醇脫水，中性樹(shù)膠封片，置于顯微鏡下觀察小鼠眼組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.5 RT-qPCR法檢測(cè)小鼠眼組織中TLR4和NF-KB mRNA表達(dá)水平取5只小鼠左側(cè)眼組織勻漿，采用TRIzol試劑盒一步法分離提取總RNA，取部分提取的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：25℃、10 min，42℃、60 min，85℃、5 min，終止反應(yīng)，冰浴5 min。引物序列：TLR4，上游5'-CTTCTAACCTCAACGACCTCAC-3'，下游5'-GCCTTAGCCTCCTCTCCTTA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度158 bp；NF-κB，上游5'-CGTGAGGCTGTTTGGTTTG-3'，下游5'-CTGTCTTATGGCTGAGGTCTG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度111 bp；GAPDH，上游5'-GGTATGACAATGAATATGGCTACAG-3'，下游5'-TCTCTTGCTCTCAGTATCCTTG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度117 bp。擴(kuò)增條件：94℃、4 min；94℃、20 s，60℃、30 s，72℃、30 s，循環(huán)35次。采用2－ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA表達(dá)水平。

1.6 Western blotting法檢測(cè)小鼠眼組織中TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)水平取5只小鼠左側(cè)眼組織勻漿，加入組織裂解液處理30 min，勻漿處理，12 000 r·min－1離心10 min，收集上清液，采用蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取60μg蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸銨（SDSPAGE）凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF），室溫封閉1 h。加入TLR4、NF-κB一抗（1∶1 000）和β-actin一抗（1∶500），于4℃孵育過(guò)夜，加入HRP標(biāo)記的Ig G孵育2 h，加ECL進(jìn)行顯色。使用圖像軟件ImageJ進(jìn)行定量分析，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

1.7 ELISA法檢測(cè)小鼠眼組織中TNF-α、IL-6和IL-10水平取5只小鼠右側(cè)眼組織，勻漿處理，4℃、12 000 r·min－1離心20 min，取上清液。采用ELISA法檢測(cè)小鼠眼組織中TNF-α、IL-6和IL-10水平，所有操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，單位為μg·L－1。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。小鼠眼組織中TLR4和NF-κB mRNA及蛋白表達(dá)水平以及IL-10、IL-6和TNF-α水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠眼組織病理形態(tài)表現(xiàn)對(duì)照組小鼠眼組織結(jié)構(gòu)完整，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組小鼠眼組織結(jié)構(gòu)紊亂，視網(wǎng)膜出現(xiàn)水腫，葡萄膜組織中有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組比較，低、中和高劑量金銀花提取物組小鼠葡萄膜組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)不同程度減輕，高劑量金銀花提取物組小鼠眼組織結(jié)構(gòu)較低和中劑量金銀花提取物組改善更明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠眼組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE,×200）Fig.1Pathomorphology of eye tissue of mice in various groups（HE,×200）

2.2 各組小鼠眼組織中TLR4和NF-κB mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組比較，模型組小鼠眼組織中TLR4和NF-κB mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低、中和高劑量金銀花提取物組小鼠眼組織中TLR4和NF-κB mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與低劑量金銀花提取物組比較，中和高劑量金銀花提取物組小鼠眼組織中TLR4和NF-κB mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與中劑量金銀花提取物組比較，高劑量金銀花提取物組小鼠眼組織中TLR4和NF-κB mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 各組小鼠眼組織中TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，模型組小鼠眼組織中TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低、中和高劑量金銀花提取物組小鼠眼組織中TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與低劑量金銀花提取物組比較，中和高劑量金銀花提取物組小鼠眼組織中TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與中劑量金銀花提取物組比較，高劑量金銀花提取物組小鼠眼組織中TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1和圖2。

表1 各組小鼠眼組織中TLR4和NF-κB mRNA及蛋白表達(dá)水平Tab.1Expression levels of TLR4 and NF-κB mRNA and proteins in eye tissue of mice in various groupsn=5,±s)

表1 各組小鼠眼組織中TLR4和NF-κB mRNA及蛋白表達(dá)水平Tab.1Expression levels of TLR4 and NF-κB mRNA and proteins in eye tissue of mice in various groupsn=5,±s)

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low dose of honeysuckle group；○P＜0.05 compared with medium dose of honeysuckle group.

Group Control Model Honeysuckle Low dose Medium dose High dose TLR4 mRNA 1.00±0.02 1.74±0.07*1.59±0.08△1.26±0.09△#1.20±0.07△#○Protein 0.12±0.02 0.54±0.03*0.39±0.04△0.22±0.02△#0.16±0.02△#○NF-κB mRNA 1.00±0.03 2.17±0.09*1.68±0.05△1.60±0.07△#1.31±0.05△#○Protein 0.31±0.01 0.78±0.04*0.60±0.04△0.41±0.03△#0.33±0.03△#○

圖2 各組小鼠眼組織中TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)電泳圖Fig.2Electrophoregram of expressions of TLR4 and NF-κB proteins in eye tissue of mice in various groups

2.4 各組小鼠眼組織中TNF-α、IL-6和IL-10水平與對(duì)照組比較，模型組小鼠眼組織中TNF-α、IL-6和IL-10水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低、中和高劑量金銀花提取物組小鼠眼組織中TNF-α、IL-6和IL-10水平明顯降低（P＜0.05）；與低劑量金銀花提取物組比較，中和高劑量金銀花提取物組小鼠眼組織中TNF-α、IL-6和IL-10水平明顯降低（P＜0.05）；與中劑量金銀花提取物組比較，高劑量金銀花提取物組小鼠眼組織中TNF-α、IL-6和IL-10水平明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠眼組織中TNF-α、IL-6和IL-10水平Tab.2Levels of TNF-α,IL-6,and IL-10 in eye tissue of mice in various groups [n=5,±s,ρβ/(μg·L－1)]

表2 各組小鼠眼組織中TNF-α、IL-6和IL-10水平Tab.2Levels of TNF-α,IL-6,and IL-10 in eye tissue of mice in various groups [n=5,±s,ρβ/(μg·L－1)]

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low dose of honeysuckle group；○P＜0.05 compared with medium dose of honeysuckle group.

Group Control Model Honeysuckle Low dose Medium dose High dose TNF-α 45.33±6.72 168.24±12.35*102.31±10.20△76.41±8.99△#59.70±8.02△#○IL-6 26.32±3.21 230.23±12.41*130.50±10.25△67.09±5.49△#39.21±4.84△#○IL-10 55.60±6.41 138.45±10.21*96.31±8.74△79.54±8.20△#62.11±7.66△#○

3 討 論

葡萄膜炎是發(fā)生于眼內(nèi)組織的炎癥反應(yīng)，采用LPS誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性葡萄膜炎小鼠模型是目前較成熟的葡萄膜炎動(dòng)物模型。本研究通過(guò)小鼠玻璃體腔內(nèi)注射LPS誘發(fā)AAU，HE染色結(jié)果表明：模型組小鼠角膜、睫狀體和玻璃體均出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，與文獻(xiàn)［14］報(bào)道的AAU模型特點(diǎn)相符，說(shuō)明該方法成功建立AAU小鼠模型。TLRs是一類廣泛存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的與跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的受體，其中TLR4亞型是重要的信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，與眼部免疫和炎癥反應(yīng)有密切關(guān)聯(lián)，參與AAU的發(fā)生發(fā)展［15-16］。由TLRs介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過(guò)誘導(dǎo)機(jī)體反應(yīng)，產(chǎn)生細(xì)胞炎性因子和趨化因子，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)。研究［17］顯示：TLR4 mRNA和蛋白在睫狀體不含色素的上皮細(xì)胞及虹膜內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，通過(guò)內(nèi)毒素刺激后促進(jìn)其高度表達(dá)，產(chǎn)生一系列信號(hào)通路的激活，參與炎癥反應(yīng)。NF-κB是一類具有多向性調(diào)節(jié)作用的誘導(dǎo)性核轉(zhuǎn)錄因子，與炎癥因子產(chǎn)生、細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)交聯(lián)和細(xì)胞凋亡有密切關(guān)聯(lián)，參與調(diào)控機(jī)體免疫反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)［18］。本研究采用RT-qPCR法檢測(cè)小鼠眼組織中TLR4和NF-κB mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，模型組小鼠眼組織中TLR4和NF-κB mRNA表達(dá)水平明顯升高，給予不同劑量金銀花提取物干預(yù)后，小鼠眼組織中TLR4和NF-κB mRNA表達(dá)水平明顯降低；進(jìn)一步采用Western blotting法檢測(cè)眼組織中TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示：不同劑量金銀花提取物對(duì)TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)水平的影響與對(duì)mRNA表達(dá)的影響一致，說(shuō)明外界因素刺激促使TLRs和NF-κB高表達(dá)可能是AAU發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，與張曉龍等［19］研究結(jié)果一致，金銀花提取物可有效抑制TLRs和NF-κB表達(dá)。

當(dāng)細(xì)胞受到促炎因子的刺激，激活NF-κB抑制因子激酶，使抑制性的κB蛋白磷酸化，釋放NF-κB，進(jìn)一步調(diào)控NF-κB依賴的基因表達(dá)如TNF-α、IL-6和IL-10等，促進(jìn)炎癥反應(yīng)［20］。與此同時(shí)，TLR4高表達(dá)可促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB釋放，從而刺激TNF-α、IL-6和IL-10等細(xì)胞因子的表達(dá)［21］。本研究結(jié)果表明：與模型組比較，低、中和高劑量金銀花提取物組小鼠眼組織中TNF-α、IL-6和IL-10水平明顯降低，與鄧珍等［22］研究結(jié)果相符。由此可見(jiàn)，金銀花提取物可能是通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號(hào)通路，調(diào)節(jié)TNF-α、IL-6和IL-10水平，呈劑量依賴關(guān)系減輕AAU小鼠的眼部組織炎癥反應(yīng)，但其是否只通過(guò)TLR4/NF-κB信號(hào)通路起作用尚有待進(jìn)一步驗(yàn)證。