腹部推拿療法對慢性應(yīng)激所致慢性疲勞綜合征模型大鼠海馬神經(jīng)重塑及其海馬-HPA軸的負(fù)反饋機制

潘明柱,李 建,榮 兵,賈 峻,李華南

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院推拿科，天津300193）

慢性疲勞綜合征（chronic fatigue syndrome，CFS）是不明原因所致的嚴(yán)重疲勞，具有持續(xù)發(fā)作或反復(fù)發(fā)作特征，伴有記憶力下降、頭痛、睡眠障礙和免疫功能下降等癥狀［1］。CFS的發(fā)病機制尚未確定，但慢性應(yīng)激反應(yīng)是其病理基礎(chǔ)［2］。在應(yīng)激反應(yīng)下，容易導(dǎo)致機體神經(jīng)內(nèi)分泌功能異常，出現(xiàn)激素分泌增多等現(xiàn)象。下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)（hypothalamus-pituitary-adrenal，HPA）軸是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)中樞，研究［3］顯示：HPA軸是外界環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)的主要通道，并在應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用。海馬是HPA軸的高級調(diào)控中樞，研究［4］顯示：海馬-HPA軸負(fù)反饋失衡是CFS的致病基礎(chǔ)。腹部推拿作為中醫(yī)常用疾病治療手法，被認(rèn)為對海馬神經(jīng)具有重塑作用，但對其如何調(diào)控海馬-HPA軸負(fù)反饋機制尚不明確。本文作者采用腹部推拿的方式干預(yù)CFS模型大鼠，探討其對大鼠海馬-HPA軸的影響，以了解該治療方法對CFS大鼠海馬神經(jīng)重塑的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器成年健康Wistar雌性大鼠60只，體質(zhì)量190～260 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可 證 號：SCXK（京）2014-004。TRIzol（美國Invitrogen公司），鼠單克隆抗FK506結(jié)合蛋白4（FK506 binding protein 4，F(xiàn)KBP4）和抗FK506結(jié)合 蛋 白51（FK506 binding protein 51，F(xiàn)KBP51）抗體（美國Bethyl公司），鼠單克隆抗糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）抗體［圣克魯斯生物技術(shù)（上海）有限公司］，鼠單克隆抗N-甲基-D-天冬氨酸受體 （N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）抗體（美國Abcam公司）、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑（日本TaKaRa公司），蘇木素染液、伊紅染液和PBS緩沖液（上海未爾晟生物技術(shù)有限公司），DBA試劑盒（北京中杉金橋公司），鼠促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）試劑盒（上海西塘生物科技有限公司），鼠皮質(zhì)醇（cortisol，CORT）和促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）ELISA試劑盒（上海江萊生物科技有限公司），鼠糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）ELISA試劑盒（上海研生科技有限公司）。Super RX感光膠片（日本FUJIFILM公司），高速冷凍離心機（TGL 16M，廣州滬瑞明儀器有限公司），DYCP-31BM型水平和垂直電泳裝置（北京市六一儀器廠），Image-Pro-Plus圖像分析軟件（Media Cybernetics，美國元奧儀器有限公司），LabWorksTM凝膠成像及分析系統(tǒng)（美國UVP公司）。

1.2 實驗動物分組和CFS大鼠模型制備大鼠飼養(yǎng)1周后隨機分為正常組、模型組和實驗組，每組20只。實驗組和模型組大鼠制備CFS模型，正常組大鼠不進(jìn)行任何處理。造模方法：上午懸吊，每懸吊3 d，加量1次，延長懸吊時間0.5 h；下午負(fù)重游泳，前3 d進(jìn)行適應(yīng)性游泳，每天30 min，以后采取力竭性訓(xùn)練，增加3%負(fù)重。以上訓(xùn)練持續(xù)12 d，通過鼠尾懸掛實驗、力竭游泳實驗和鼠尾懸掛實驗確定動物模型出現(xiàn)與臨床相似表現(xiàn)（包括軀體和心理慢性疲勞、體力改變、記憶力下降及絕望狀態(tài)等）判斷為建模成功［5］。

1.3 腹部推拿方法實驗組大鼠給予腹部推拿治療。采用YF-3手法測定儀評測推拿手法力度和頻率，待其力度大小及頻率波形與手法模型一致，開始對實驗大鼠進(jìn)行操作。①選取關(guān)元穴和中脘穴，用右手食指、中指按關(guān)元穴，余指并攏，食、中二指向恥骨聯(lián)合脊柱方向按下，力量自輕至重，待大鼠腹部動脈輕微搏動，停止發(fā)力，該過程一般30 s完成，隨后維持當(dāng)前壓力，1 min后指部徐徐上提，此過程大約持續(xù)30 s，反復(fù)以上操作2次。②食指、中指并攏，指面著于術(shù)部，以腕關(guān)節(jié)為中心，作環(huán)形摩動，每分鐘20～28次，反復(fù)操作6 min。以上推拿治療每天1次，持續(xù)治療2周。

1.4 大鼠行為學(xué)效應(yīng)指標(biāo)檢測①鼠尾懸掛實驗：將距大鼠尾端1 cm部位穿過離地面1 m高的水平有機玻璃板中央孔，將其倒掛，大鼠掙扎活動時會出現(xiàn)間斷性停止掙扎狀態(tài)，記錄5 min內(nèi)停止掙扎時間即懸掛不動時間。②力竭游泳實驗：游泳池水溫（25±1）℃、水深50 cm，力竭時間是大鼠從入水游泳至頭部沉入水中10 s不能浮出水面的時間。③曠場實驗：將大鼠放入長寬高均為80 cm的木質(zhì)曠場箱，內(nèi)壁涂黑，將大鼠放置于箱底中心位置，觀察5 min內(nèi)大鼠行為，計算水平運動速度。

1.5 電鏡觀察大鼠海馬神經(jīng)元超微形態(tài)表現(xiàn)實驗結(jié)束后，從3組大鼠中各抽取3只，取腦組織，分離海馬，并包埋切片，使用OPTONEM 10C透射電鏡觀察大鼠海馬神經(jīng)元超微形態(tài)表現(xiàn)。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測大鼠海馬組織中FKBPs、GR和NMDAR陽性表達(dá)率取大鼠海馬腦段切片，常規(guī)脫蠟、水化，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)分析并計算FKBPs（包括FKBP4和FKBP51）、GR和NMDAR陽性表達(dá)率。陽性表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)：光鏡下，每100個細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)≥30個即為陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞數(shù)超過60個表示強陽性，采用系統(tǒng)軟件觀察陽性細(xì)胞平均表達(dá)強度并計算陽性表達(dá)率［6］。

1.7 ELISA法檢測大鼠血清中ACTH、CORT、CRH和GC水平取大鼠腹腔靜脈血5 mL，于4℃條件靜止0.5 h后，3 000 r·min－1、離 心 半 徑2 cm條件下離心處理10 min，分離血清，于－70℃冰箱保存?zhèn)溆?；采用ELISA試劑盒檢測大鼠血清中ACTH、CORT、CRH和GC水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。大鼠懸掛不動時間、力竭游泳時間和水平運動時間，血清中ACTH、CORT、CRH和GC水平，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q檢驗；大鼠海馬組織中FKBPs、GR和NMDAR陽性表達(dá)率以百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠行為學(xué)效應(yīng)指標(biāo)模型組和干預(yù)前實驗組大鼠行為學(xué)效應(yīng)指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與正常組比較，模型組和干預(yù)前實驗組大鼠懸掛不動時間明顯延長（P＜0.05），力竭游泳時間明顯縮短（P＜0.05），水平運動速度明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，干預(yù)后實驗組大鼠懸掛不動時間明顯縮短（P＜0.05），力竭游泳時間明顯延長（P＜0.05），水平運動速度明顯增加（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠行為學(xué)效應(yīng)指標(biāo)Tab.1Behavioral effect indicators of rats in various groups (n=20,±s)

表1 各組大鼠行為學(xué)效應(yīng)指標(biāo)Tab.1Behavioral effect indicators of rats in various groups (n=20,±s)

*P＜0.05 vs normal group；△P＜0.05 vs model group.

Group Normal Model Experiment Before intervention After intervention T ime for immobility（t/s）132.43±34.06 186.59±46.07*189.61±45.06*148.24±25.05△Exhaustive swimming time（t/min）15.04±3.38 9.57±2.43*9.65±2.42*13.61±3.32△Horizontal movement speed[v/（cm·s－1）]19.19±2.43 9.85±2.02*10.91±1.03*16.07±3.37△

表1 各組大鼠行為學(xué)效應(yīng)指標(biāo)Tab.1Behavioral effect indicators of rats in various groups (n=20,±s)

表1 各組大鼠行為學(xué)效應(yīng)指標(biāo)Tab.1Behavioral effect indicators of rats in various groups (n=20,±s)

*P＜0.05 vs normal group；△P＜0.05 vs model group.

Group Normal Model Experiment Before intervention After intervention T ime for immobility（t/s）132.43±34.06 186.59±46.07*189.61±45.06*148.24±25.05△Exhaustive swimming time（t/min）15.04±3.38 9.57±2.43*9.65±2.42*13.61±3.32△Horizontal movement speed[v/（cm·s－1）]19.19±2.43 9.85±2.02*10.91±1.03*16.07±3.37△

2.2 各組大鼠海馬神經(jīng)元超微形態(tài)表現(xiàn)透射電鏡下觀察，正常組大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)、大小正常，細(xì)胞核、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞膜完整。模型組大鼠海馬神經(jīng)元胞體縮小，細(xì)胞胞膜出現(xiàn)皺褶，細(xì)胞核不規(guī)則，核異染色質(zhì)增多，部分核膜破裂，核周間隙變大；部分神經(jīng)元細(xì)胞膜內(nèi)陷，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)空亮區(qū)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，有凋亡小體形成。實驗組大鼠海馬神經(jīng)元胞體相對正常，可見到異染色質(zhì)聚集，核周間隙輕度增大，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，少數(shù)線粒體輕度擴(kuò)張。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬神經(jīng)元超微形態(tài)表現(xiàn)（TEM，×1 000）Fig.1Ultramicromorphology of hippocampal neurons of rats in various groups（TEM，×1 000）

2.3 各組大鼠海馬組織中FKBPs、GR和NMDAR陽性表達(dá)率與正常組比較，模型組大鼠海馬組織中FKBP4、FKBP51、GR和NMDAR陽性表達(dá)率明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，實驗組大鼠海馬組織中FKBP4、FKBP51、GR和NMDAR陽性表達(dá)率明顯升高（P＜0.05）。見表2和圖2。

表2 各組大鼠海馬組織中FKBPs、GR和NMDAR陽性表達(dá)率Tab.2Positive expression rates of FKBPs,GR and NMDAR in hippocampus tissue of rats in various groups[n=20,n(η/%)]

圖2 各組大鼠海馬組織中FKBPs、GR和NMDAR免疫組織化學(xué)染色情況Fig.2Positive expression rates of FKBPs,GR and NMDAR in hippocampus tissue of rats in various groups

2.4各組大鼠血清中ACTH、CORT、CRH和GC水平與正常組比較，模型組大鼠血清中ACTH、CORT、CRH和GC水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，實驗組大鼠血清中ACTH、CORT、CRH和GC水平明顯降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清中ACTH、CORT、CRH和GC水平Tab.3Levels of serum ACTH,CORT,CRH and GC of rats in various groups [n=20,±s，ρB/(μg?L-1)]

表3 各組大鼠血清中ACTH、CORT、CRH和GC水平Tab.3Levels of serum ACTH,CORT,CRH and GC of rats in various groups [n=20,±s，ρB/(μg?L-1)]

*P＜0.05 vs normal group；ΔP＜0.05 vs model group.

Group Normal Model Experiment F P ACTH 31.39±4.35 56.90±5.65*36.88±3.78△166.070＜0.01 CORT 270.64±36.26 401.99±60.46*312.04±45.34△38.510＜0.01 CRH 10.68±2.32 21.19±3.51*4.23±1.08△233.030＜0.01 GC 38.26±4.57 53.15±3.74*43.28±4.65△60.950＜0.01

3 討 論

CFS歸屬中醫(yī)“虛勞”范疇，脾胃升降失調(diào)是其主要發(fā)病原因，脾胃受損在先，繼而導(dǎo)致其運化升降失司，經(jīng)絡(luò)和氣機阻滯，最終使氣血運行受阻所致［7-8］。腹部是人體氣機升降樞紐，中醫(yī)認(rèn)為，腹部推拿能夠調(diào)節(jié)脾胃升降功能，增強脾胃運化，促進(jìn)氣血暢行［9-10］。有研究［11-12］顯示：腹部推拿可以影響海馬神經(jīng)重塑，但對其如何調(diào)控海馬-HPA軸負(fù)反饋機制尚不明確。

本研究模擬人體生理和精神應(yīng)激狀態(tài)，復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)下的CFS大鼠模型，采用行為學(xué)效應(yīng)指標(biāo)驗證模型，結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組和干預(yù)前實驗組大鼠懸掛不動時間明顯延長，力竭游泳時間明顯縮短，水平運動速度明顯降低，說明大鼠體力下降，自發(fā)活動減少，出現(xiàn)心理和軀體疲勞狀態(tài)；經(jīng)腹部推拿干預(yù)后，實驗組大鼠懸掛不動時間明顯縮短，力竭游泳時間明顯延長，水平運動速度明顯增加，說明腹部推拿能改善CFS大鼠的體力及心理狀態(tài)，增強對新環(huán)境的學(xué)習(xí)及適應(yīng)能力。海馬具有調(diào)控單胺類神經(jīng)遞質(zhì)釋放功能，研究［13-14］表明：慢性應(yīng)激狀態(tài)下海馬體積縮小，海馬神經(jīng)元出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象，進(jìn)而影響對HPA軸的調(diào)控。本研究通過電鏡觀察各組大鼠海馬神經(jīng)元超微形態(tài)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示：模型組大鼠海馬神經(jīng)元胞體縮小，部分神經(jīng)元胞膜內(nèi)陷，有凋亡小體形成，而實驗組大鼠海馬神經(jīng)元胞體相對正常，形態(tài)結(jié)構(gòu)接近正常組，有輕度異染色質(zhì)聚集、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張現(xiàn)象，說明腹部推拿對海馬萎縮及其損傷的神經(jīng)元起到修復(fù)作用。HPA軸過度的應(yīng)激反應(yīng)會使HPA軸亢進(jìn)，海馬是調(diào)節(jié)HPA軸功能的高級中樞［15］。研究［16］表明：GC在腦的老化過程起重要作用，海馬結(jié)構(gòu)功能對GC的水平變化很敏感，高水平GC會對海馬結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損害，對學(xué)習(xí)和記憶造成影響，降低GC水平可以修復(fù)空間記憶障礙。海馬中富含的一種腎上腺激素受體GR參與HPA軸調(diào)解，能夠抑制應(yīng)激條件所致的HPA軸過度反應(yīng)［17］，而NMDAR介導(dǎo)的突觸傳遞與GR對HPA軸的調(diào)節(jié)作用有緊密聯(lián)系［18］。NMDAR受體通道活性增強會增強各種應(yīng)激反應(yīng)所致的GR水平降低程度［19-20］。GR敏感性受FKBPs蛋白分子調(diào)控，F(xiàn)KBPs能降低GR與配體的結(jié)合力，減少其核轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠海馬組織中FKBPs、GR和NMDAR陽性表達(dá)率明顯降低，血清中GC水平明顯升高，而干預(yù)后實驗組CFS大鼠海馬組織中FKBPs、GR、NMDAR陽性表達(dá)率明顯升高且血清中GC水平明顯降低，表明提高海馬神經(jīng)中GR和NMDAR的表達(dá)水平，可借助FKBPs-GRNMDAR通路抑制應(yīng)激反應(yīng)所致的HPA軸過度反應(yīng)。當(dāng)機體受到應(yīng)激刺激時，會將刺激信息匯聚于下丘腦CRH神經(jīng)元，提高HPA軸的興奮性，進(jìn)而引起垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)反應(yīng)［21-22］。本研究結(jié)果顯示：模型組大鼠血清中ACTH、CORT和CRH較正常組明顯升高，說明CFS模型大鼠處于HPA軸亢進(jìn)狀態(tài)；經(jīng)腹部推拿干預(yù)后，實驗組大鼠血清中ACTH、CORT和CRH水平與模型組比較明顯下降，并趨于正常水平，提示腹部推拿對HPA軸亢奮有一定調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而改善HPA軸功能，促進(jìn)病情恢復(fù)。

綜上所述，腹部推拿療法可以促進(jìn)應(yīng)激反應(yīng)所致的CFS大鼠損傷性海馬神經(jīng)重塑，降低ACTH、CORT和CRH激素水平，通過FKBPs-GR-NMDAR通路維持海馬-HPA軸負(fù)反饋平衡，進(jìn)而達(dá)到治療CFS的目的。