消腫止痛巴布劑的制備工藝研究?

李智勇，陳玉興，趙自明，張建軍，陳雪婷，盧 泳，3

1 廣東省第二中醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東 廣州 510095；2 廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3 廣州中醫(yī)藥大學(xué)

消腫止痛巴布劑（Xiaozhong ZhitongCataplasm，XZC）方由《證治準(zhǔn)繩》所載“乳香散”加減化裁而來，主要由大黃、黃柏、姜黃、澤蘭等藥物組成，具有活血化瘀、清熱涼血、止痛消腫的功效［1-2］。主要用于治療跌打損傷，瘀血腫痛等急性軟組織損傷。本研究根據(jù)處方中藥物所含功效成分的化學(xué)性質(zhì)和藥理作用，以初步藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為指標(biāo)，優(yōu)選適宜的提取工藝，并對(duì)XZC 的制備工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化研究，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF 級(jí)SD 大鼠80 只，雌雄各半，體質(zhì)量范圍180～220 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2013-0002，質(zhì)量合格證號(hào)：44007200028037。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境：廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室［許可證號(hào)SYXK（粵）2015-0059］。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物中藥飲片（廣州康圣中藥飲片有限公司，批號(hào)：20150801），檢驗(yàn)結(jié)果顯示均符合《中華人民共和國藥典》2015年版一部各項(xiàng)下的規(guī)定。鹽酸小檗堿對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110713-201212）；雙氯芬酸二乙胺乳膏劑（商品名：扶他林，瑞士諾華有限責(zé)任公司，國藥準(zhǔn)字H19990291，批號(hào)：VP0098）；治傷軟膏（浙江普洛康天然藥物有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20027559，批號(hào)：150506）；乙腈（默克）為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器DC-NSG-30 型多功能提取濃縮機(jī)組（上海達(dá)程實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；METTLER XS-205DU 型電子分析天平（瑞士）；DHG-9070A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；BT-S-1 型小型試驗(yàn)巴布劑涂布機(jī)（溫州市皓豐機(jī)械有限公司）；BBV-T 型初黏力測(cè)試儀；持黏力測(cè)試儀（濟(jì)南格瑞特測(cè)試儀器有限公司）；-80℃超低溫冰箱；5424 型小型高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；數(shù)顯游標(biāo)卡尺。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣品制備 1）XZC樣品1：取全方飲片粉碎成細(xì)粉，加入基質(zhì)，混勻，制成每克含有0.19 g生藥。2）XZC樣品2：取全方飲片加8倍量水，提取3次，每次1 h，濾過，合并濾液，濃縮至相對(duì)密度1.20（60℃），加入基質(zhì)，混勻，制成每克含有1.05 g生藥。3）XZC樣品3：取大黃、姜黃粉碎成細(xì)粉，備用；其余飲片加8倍量水，提取3次，每次1 h，濾過，合并濾液，濃縮至相對(duì)密度1.20（60℃），加入細(xì)粉和基質(zhì)，混勻，使每克含有0.46 g生藥。4）XZC樣品4：取四分之一的飲片粉碎成細(xì)粉，備用；其余飲片加8倍量水，提取3次，每次1 h，濾過，合并濾液，濃縮至相對(duì)密度1.20（60℃），加入細(xì)粉，加入基質(zhì)，混勻，使每克含有0.64 g生藥。

1.4.2 動(dòng)物處理 所有SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng)3天后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、扶他林組、治傷軟膏組、XZC 樣品1 組、XZC 樣品2 組、XZC 樣品3組、XZC 樣品4 組，每組10 只。所有大鼠雙側(cè)后肢小腿部剃毛，定位測(cè)量各組大鼠右腳腳跖寬度，作為基礎(chǔ)值。除正常對(duì)照組外，其余各組均進(jìn)行腳跖局部軟組織挫傷造模，造模時(shí)用輾壓器在腳跖中部連續(xù)輾壓3 次，造成局部軟組織挫傷。除正常對(duì)照組、模型對(duì)照組外，其余各組大鼠輾壓后立即給予對(duì)應(yīng)藥物涂抹，涂抹范圍以瘀斑面積相同，正常對(duì)照組、模型對(duì)照組大鼠涂抹等量膏體基質(zhì)，連續(xù)涂抹3天。末次給藥2 h后觀察病情評(píng)分。

1.4.3 觀察指標(biāo) 軟組織損傷病情程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［1-2］。1）觸痛：受損組織局部觸痛很明顯計(jì)3分，觸痛明顯計(jì)2 分，觸痛不明顯計(jì)1 分，無觸痛計(jì)0分。2）腫脹：受損組織局部紅腫面積≥0.5 cm2計(jì)3分，紅腫面積≥0.3 cm2，＜0.5 cm2計(jì)2分，紅腫面積≥0.1 cm2，＜0.3 cm2計(jì)1 分，無紅腫計(jì)0 分。3）功能障礙：受損傷肢明顯跛行，行走困難計(jì)3 分，受損傷肢有跛行計(jì)2 分，受損傷肢跛行不明顯計(jì)1分，無跛行計(jì)0分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)兩兩比較，方差齊時(shí)采用SNK 法，方差不齊時(shí)采用Dunnett’s T3法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠右足軟組織損傷病情程度評(píng)分在輾壓后1、2、3天顯著增高。與模型對(duì)照組比較，給藥1天后扶他林組，治傷軟膏組，XZC樣品1、2、3、4組大鼠右足軟組織受損病情程度評(píng)分降低（P＜0.05）；連續(xù)給藥2、3天后，扶他林組，治傷軟膏組，XZC樣品1、3、4組大鼠右足軟組織受損病情程度評(píng)分明顯降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠軟組織損傷病情程度評(píng)分比較（）

表1 各組大鼠軟組織損傷病情程度評(píng)分比較（）

注：與正常對(duì)照組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

3 巴布劑配置工藝參數(shù)考察

由“2.1”項(xiàng)下結(jié)果可知，XZC 樣品1 和4 的消腫止痛效果相對(duì)較好，結(jié)合臨床用法和載藥量需求，確定樣品4 的制備工藝為基本工藝：處方四分之一的飲片粉碎成細(xì)粉，過100 目篩，備用；其余飲片加水提取的工藝，進(jìn)一步對(duì)其巴布劑的配置工藝參數(shù)進(jìn)行研究。

3.1 粉碎工藝條件的確立分別稱取上述藥材飲片各3 份，每份300 g，置粉碎機(jī)中粉碎成細(xì)粉，取能通過六號(hào)篩的粉末，稱取質(zhì)量，計(jì)算細(xì)粉得率。結(jié)果表明，各藥材粉碎后得粉率都在93%以上，符合要求，說明藥材的粉碎工藝可行。

3.2 水提取工藝研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以干膏得率和黃柏的有效成分之一小檗堿濃度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)加水量、提取時(shí)間和提取次數(shù)等因素進(jìn)行優(yōu)選，優(yōu)化提取工藝并進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。

3.2.1 樣品制備 對(duì)照處方比例稱取大黃等飲片共9 份，每份310 g，按照表2 的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)安排進(jìn)行試驗(yàn)，濾過，合并濾液，濃縮并轉(zhuǎn)移至500 mL，定容，搖勻，分別測(cè)定干膏得率和小檗堿含量。

3.2.2 干膏得率的測(cè)定 精密吸取各試驗(yàn)的樣品溶液20 mL，置已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，按《中華人民共和國藥典》2015 年版四部通則2201浸出物測(cè)定法［3］202測(cè)定，計(jì)算干膏得率。

3.2.3 小檗堿的含量測(cè)定［4］

3.2.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.50 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（40∶60）（每100 mL 加十二烷基硫酸鈉0.4 g）；波長：345 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃。

3.2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加甲醇使溶解，制成每1 mL含鹽酸小檗堿對(duì)照品248 μg的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

3.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取上述鹽酸小檗堿對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.5，1，2，3，4 mL 置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，分別制成每毫升含有鹽酸小檗堿12.4，24.8，49.6，74.4，99.2 μg 的對(duì)照品溶液。分別吸取10 μL 注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄色譜峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=41.114X-66.161，相關(guān)系數(shù)r=0.999 85。表明鹽酸小檗堿在濃度范圍12.4～99.2 μg/mL線性關(guān)系良好。

3.2.3.4 供試品溶液的制備 精密吸取各試驗(yàn)樣品溶液1 mL，置50 mL 量瓶中，加甲醇45 mL，搖勻，超聲處理30 min（功率250 W，頻率40 kHz），取出，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液2 mL，置10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.2.3.5 專屬性考察 按處方比例稱取除黃柏藥材外的飲片共260 g，加10倍量水，煎煮2次，每次1 h，常壓濃縮至500 mL，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。吸取上述供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μL 注入液相色譜儀，照上述色譜條件測(cè)試，結(jié)果供試品色譜在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上有相同色譜峰，陰性對(duì)照溶液色譜在相應(yīng)位置無吸收，說明陰性無干擾，該法專屬性良好。

3.2.3.6 測(cè)定法 吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，照上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算小檗堿濃度，結(jié)果見表2。

3.2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)選 采取L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取加水倍數(shù)、提取時(shí)間、提取次數(shù)作為考察因素，各取3 個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)。其中小檗堿是為君藥黃柏有效成分之一，含量測(cè)定方法成熟，擬定小檗堿權(quán)重系數(shù)0.6，干膏得率權(quán)重系數(shù)0.4，以二者的綜合評(píng)分［5-6］作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，并利用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)，篩選提取工藝參數(shù)。由直觀分析可知，影響提取效果的因素順序?yàn)椋禾崛〈螖?shù)（A）＞加水倍量（B）＞提取時(shí)間（C），由此得出的最佳工藝組合為A3B3C3。由綜合評(píng)分結(jié)果可知，得分最高工藝組合為A3B3C2。方差分析結(jié)果顯示提取次數(shù)（A）對(duì)水提工藝具有顯著性影響，而加水倍量（B）和提取時(shí)間（C）無顯著影響。綜合考慮到降低生產(chǎn)成本，縮短生產(chǎn)周期等綜合因素，選擇A3B1C1為優(yōu)選工藝，即提取3 次，每次加水量為6 倍，提取時(shí)間為1 h。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 水提正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

3.2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 按處方比例稱取藥材3 份，每份620 g，照優(yōu)化工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，濾過，合并濾液，濃縮，定容至1000 mL。分別測(cè)定干膏得率和小檗堿濃度，計(jì)算綜合評(píng)分。由表4 可知，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與正交試驗(yàn)優(yōu)選結(jié)果基本吻合，說明擬定提取工藝條件基本合理、穩(wěn)定。見表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3.3 濃縮工藝的考察以鹽酸小檗堿保留率為考核指標(biāo)，對(duì)比常壓濃縮和減壓濃縮工藝。稱取提取液（鹽酸小檗堿含量為0.3744 mg/g）2 份，每份36.40 kg，分別采用常壓濃縮和減壓濃縮（濃縮條件：80℃，真空度-0.06 MPa）進(jìn)行濃縮，濃縮至約750 g，稱定質(zhì)量，分別測(cè)定相對(duì)密度（60℃）和鹽酸小檗堿的含量，計(jì)算鹽酸小檗堿保留率。結(jié)果顯示，減壓濃縮工藝的鹽酸小檗堿保留率略高于常壓濃縮工藝，因此選擇減壓濃縮（80℃，-0.06 MPa）。見表5。

表5 濃縮工藝考察結(jié)果

3.4 XZC的制備工藝研究

3.4.1 XZC 的制備 將處方量四分之一的大黃、黃柏、澤蘭等飲片粉碎成最細(xì)粉；其余飲片煎煮3次，每次1 h，濾過，合并，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.20～1.30（60℃），加入藥材細(xì)粉，混勻。再與由甘油、聚丙烯酸鈉、甘羥鋁、高嶺土、酒石酸、純化水等組成的基質(zhì)混勻，涂布，切片，晾干，即得。

3.4.2 質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)及檢測(cè)方法

3.4.2.1 初黏力 按照《中華人民共和國藥典》2015 年版四部通則0952 黏附力測(cè)定法第一法測(cè)定［3］130，每個(gè)樣品平行測(cè)定5 次，以測(cè)得最大值為100 分，并按照（測(cè)得值/最大值）×100 計(jì)算初黏力得分。

3.4.2.2 持黏力試驗(yàn) 按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0952黏附力測(cè)定法第二法測(cè)定［3］131，以50 g 的砝碼試驗(yàn)，記錄試驗(yàn)開始至滑脫的時(shí)間，每個(gè)樣品平行測(cè)定5 次，以測(cè)得最大值為100 分，并按照（測(cè)得值/最大值）×100 計(jì)算持黏力得分。

3.4.2.3 外觀評(píng)價(jià)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 按照文獻(xiàn)［7］方法分別對(duì)基質(zhì)均勻性、表面光澤度、氣泡狀態(tài)等進(jìn)行評(píng)價(jià)，并對(duì)各項(xiàng)的綜合得分按權(quán)重求和，以最大值為100 分，并按照（測(cè)得值/最大值）×100 計(jì)算外觀評(píng)價(jià)得分。

3.4.3 基質(zhì)載藥量的優(yōu)選

3.4.3.1 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì) 因素水平選擇根據(jù)文獻(xiàn)以及巴布劑基質(zhì)制備方法［8-13］，固定藥粉為25 g，藥物濃縮液30 g（每克相當(dāng)于2.5 g 飲片），以外觀、初黏力、持黏力等為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)甘油（37～100 g）、高嶺土（0.17～5 g）、酒石酸（0～0.42 g）、甘羥鋁（0.18～0.60 g）、吐溫80（0.16～1.00 g）、聚丙烯酸鈉（1.7～8.00 g）6種基質(zhì)配方進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)，優(yōu)選最佳配比。

3.4.3.2 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)與結(jié)果 根據(jù)擬定的因素水平方案，按照U22（226）均勻設(shè)計(jì)表［14］安排，制成巴布劑，晾干，照擬定評(píng)價(jià)指標(biāo)與檢測(cè)方法試驗(yàn)。見表6。

表6 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)與結(jié)果

3.4.3.3 均勻試驗(yàn)結(jié)果與數(shù)理統(tǒng)計(jì)［15］以綜合評(píng)分為因變量，各因素為變量，利用DPS 15.10 數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸分析，得回歸方程：Y=196.6605-124.2771X3-84.6405X4-16.3695X6+0.39082X12+0.0064X22+350.8948X32-35.7531X52+1.9180X62-3.0728X1×X5-0.12767X2×X6+80.6682X4×X5+18.8113X4×X6+1.4985X5×X6。通過對(duì)方程的F檢驗(yàn)結(jié)果顯示，各系數(shù)P值均小于0.05，表明該方程的各個(gè)系數(shù)均具有顯著性意義。根據(jù)該方程計(jì)算確定的最優(yōu)配方為高嶺土∶甘油∶酒石酸∶甘羥鋁∶吐溫80∶聚丙烯酸鈉質(zhì)量比1.20∶50∶0.10∶0.6∶0.15∶8.4。

3.4.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照優(yōu)選的基質(zhì)配方制備3 批消腫止痛巴布劑，測(cè)定其初黏力、持黏力及綜合感官指標(biāo)，計(jì)算綜合評(píng)分值。結(jié)果表明，按均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)選結(jié)果制備的XZC 色澤均一，延展性良好，外觀平整光滑，且能滿足黏性要求，綜合評(píng)分值與均勻試驗(yàn)結(jié)果基本相符。見表7。

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

3.5 中試放大研究根據(jù)擬定工藝進(jìn)行三批中試放大研究，每批投料飲片19.84 kg，結(jié)果成品得率分別為94.3%、93.1%、94.6%，中試產(chǎn)品檢驗(yàn)結(jié)果顯示各工藝參數(shù)穩(wěn)定，說明優(yōu)選的工藝基本合理，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。

4 結(jié)論

在中藥巴布劑（凝膠貼膏）的制備過程中，飲片的粉碎、提取對(duì)其制備工藝、藥效具有一定的影響，本研究結(jié)合當(dāng)前臨床的使用情況，設(shè)計(jì)采用不同提取工藝樣品對(duì)大鼠急性軟組織損傷作用的影響，優(yōu)選了XZC 的提取工藝路線，并進(jìn)一步采用單因素和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法相結(jié)合的方法對(duì)中間品的生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化，明確了XZC 的粉碎、提取、濃縮工藝的參數(shù)。提取工藝路線篩選過程中，在選用消痛止痛巴布劑對(duì)急性軟組織損傷大鼠病情程度評(píng)估評(píng)分的同時(shí)，還選用了對(duì)急性軟組織損傷大鼠腳腫脹的影響以及對(duì)急性軟組織損傷大鼠腳跖軟組織白細(xì)胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）的影響作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果與其基本相同，因此只列了對(duì)急性軟組織損傷大鼠病情程度評(píng)估評(píng)分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

巴布劑的基質(zhì)配方是影響巴布劑制劑成型和保障臨床療效的關(guān)鍵因素，根據(jù)藥物的性質(zhì)和加入形態(tài)，以及基質(zhì)配方組分的理化性質(zhì)，選擇合適的基質(zhì)組分和比例是巴布劑制備的技術(shù)難點(diǎn)和關(guān)鍵［16］。因此在XZC 的制劑成型過程中，采用巴布劑質(zhì)量控制的初黏力、持黏力以及外觀性狀等關(guān)鍵指標(biāo)作為評(píng)價(jià)依據(jù)，采用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法進(jìn)行多組分多水平的基質(zhì)配方優(yōu)選，通過對(duì)各次試驗(yàn)結(jié)果及基質(zhì)配方組成進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸分析，采用方程擬合法預(yù)測(cè)最優(yōu)的消痛止痛巴布劑基質(zhì)組成配方，進(jìn)一步通過驗(yàn)證試驗(yàn)確立成型工藝的參數(shù)。中試放大研究結(jié)果顯示，本研究確定的XZC 制備工藝基本合理，穩(wěn)定，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，可以適應(yīng)該制劑的生產(chǎn)，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和制劑穩(wěn)定性的考察奠定了基礎(chǔ)。