當(dāng)歸多糖對(duì)慢性應(yīng)激抑郁小鼠的行為影響及其機(jī)制研究

丁 超，許 寅，葛韻芝

上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508

作為一種常見(jiàn)的精神疾病，抑郁癥能夠影響患者的認(rèn)知、情感及機(jī)體功能［1-2］。抑郁癥的發(fā)生發(fā)展與多種風(fēng)險(xiǎn)因素有關(guān)，包括社會(huì)因素、心理壓力、慢性疾病與遺傳因數(shù)等［3］。患者除了感到悲傷、焦慮、空虛和絕望外，還常表現(xiàn)出興趣缺失、食欲不振及自殺傾向［1］。目前，全球約有4億人受到抑郁癥困擾［4-5］。

近年來(lái)，抑郁癥的病理機(jī)制逐漸明晰，包括下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitaryadrenal，HPA）軸改變、炎癥反應(yīng)系統(tǒng)激活、代謝異常、內(nèi)分泌失調(diào)及神經(jīng)系統(tǒng)病變等［6-8］。而抗抑郁藥物也快速發(fā)展，臨床常用的三環(huán)類抗抑郁藥物、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）再攝取抑制劑和單胺氧化酶抑制劑等能夠一定程度上改善抑郁癥患者的認(rèn)知與情感等功能［9］。但是，抑郁癥的高度異質(zhì)性［10-11］、易耐藥性［9］、藥物的嚴(yán)重不良反應(yīng)及昂貴售價(jià)限制了現(xiàn)有抗抑郁藥物的臨床應(yīng)用。因此，抗抑郁藥物的開(kāi)發(fā)引起了研究人員的關(guān)注。而價(jià)格低廉、不良反應(yīng)較小的中藥成為了抗抑郁藥物開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)［12-13］。

作為一種在亞洲國(guó)家被廣泛使用的天然藥物［14］，當(dāng)歸（Angelica archangelicaL）能夠補(bǔ)血和血、調(diào)經(jīng)止痛，它參與了多種抗抑郁中藥復(fù)方的組成，包括逍遙散［15］、當(dāng)歸補(bǔ)血湯［16］和當(dāng)歸芍藥散［17］等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究報(bào)道［18］，當(dāng)歸能夠顯著減少抑郁模型小鼠懸尾與強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間，降低抑郁模型小鼠下丘腦中精氨酸加壓素的表達(dá)［19］；對(duì)抗慢性束縛應(yīng)激引起的嗜睡癥狀［20］，增加抑郁模型大鼠腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)［21］。但是，當(dāng)歸改善抑郁癥的活性成分和作用機(jī)制尚不明確。

當(dāng)歸多糖（angelica polysaccharides，AP）是從當(dāng)歸中分離得到的主要活性成分之一［22］。研究表明，當(dāng)歸多糖具有廣泛的藥理活性，包括了免疫調(diào)節(jié)［23］、抗腫瘤［24］、抗肝臟損傷［25］、抗炎［26］、抗貧血［27］、抗脊髓損傷［28］等作用。然而，目前對(duì)于當(dāng)歸多糖干預(yù)抑郁癥的研究仍然未見(jiàn)報(bào)道。在本研究中，筆者使用行為學(xué)評(píng)價(jià)、神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)及mRNA測(cè)定的方法探討了當(dāng)歸多糖對(duì)慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁模型小鼠的影響及作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6小鼠，SPF級(jí)，雄性，6周齡，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：［SYXK（滬）2014-0029］，飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，飼養(yǎng)條件：溫度（22±1）℃，濕度（60±5）%，12 h明暗交替。

1.2 試藥與試劑當(dāng)歸多糖（美國(guó)泛華醫(yī)藥公司，批號(hào)：A22000）；氟西汀（美國(guó)禮來(lái)公司，批號(hào)：J20130010）；烏來(lái)糖（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：30191228）；蛋白測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：B69320）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、甲酸、乙腈及甲醇［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，批號(hào)分別：11146024、166963、172443、138489］；qPCR 反應(yīng)試劑盒［東洋紡（上海）生物科技有限公司，批號(hào)：SCQ-501］；RNA 提取試劑盒［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司及東洋紡（上海）生物科技有限公司，批號(hào)分別為AM1931、NPK-801］；qPCR引物（上海賽百盛基因技術(shù)有限公司）。

1.3 模型制備采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)篩選出60 只合格健康C57BL/6小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后隨機(jī)分為正常對(duì)照組（Control）、模型對(duì)照組（Model）、當(dāng)歸多糖低劑量組（20 mg/kg AP）、當(dāng)歸多糖高劑量組（40 mg/kg AP）及氟西汀組（10 mg/kg Fluoxctinc），每組12 只。正常對(duì)照組小鼠正常飼養(yǎng)；其他組小鼠制備慢性應(yīng)激抑郁模型，在標(biāo)準(zhǔn)小鼠框單籠飼養(yǎng)，并不定時(shí)給予以下7 種刺激：禁食24 h、禁水12 h、連續(xù)日照36 h、電擊5 min（0.7 A）、無(wú)墊料飼養(yǎng)24 h、傾斜45°飼養(yǎng)、24 h 和夾尾刺激1 min。每種刺激重復(fù)出現(xiàn)（非連續(xù)），共5 周。造模的同時(shí)灌胃給藥，其中正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等體積的水，藥物組給予對(duì)應(yīng)藥物灌胃。每周記錄小鼠體質(zhì)量。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 行為學(xué)檢測(cè) 5 周結(jié)束時(shí)，進(jìn)行強(qiáng)迫游泳測(cè)試（forced swimming test，F(xiàn)ST），將小鼠置于含20 cm 深清水容器中，記錄小鼠在6 min 內(nèi)累積不動(dòng)時(shí)間；懸尾測(cè)試（tail suspension test，TST），將小鼠尾部固定在一根水平木棍上，使其倒掛，記錄小鼠在6 min 內(nèi)累積不動(dòng)時(shí)間；高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)（elevated plus maze test，EPMT），使用30%的酒精清潔高架十字迷宮后，將小鼠放入中央位置并使頭部面向開(kāi)臂，記錄6 min內(nèi)小鼠進(jìn)入開(kāi)臂的時(shí)間；記錄小鼠1 h 飲用1%蔗糖溶液百分比（糖水消耗量/用水量×100%）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)計(jì)算糖水偏好率（sugar perference）。

1.4.2 海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè) 5 周結(jié)束時(shí)，麻醉?xiàng)l件下將小鼠安樂(lè)死，取海馬組織加入500 μL的甲酸-甲醇（1∶1000）勻漿，以離心半徑15 cm，2 3000 r/min離心15 min。取上清液，使用LC-MS/MS色譜法進(jìn)行海馬組織多巴胺（dopamine，DA）、5-HT、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）和谷氨酸（glutamate，GLU）含量檢測(cè)。

液相條件如下：A 相為甲酸-水（1∶1000），B 相為乙腈，進(jìn)行梯度洗脫。洗脫條件為0～2 min，0.02B；2.01 min，0.8B；7 min，0.9B；11 min，0.02B；流速為0.2 mL/min。

1.4.3 海馬組織TPH1、SNAP25 mRNA 檢測(cè) 取小鼠海馬組織進(jìn)行色氨酸羥化酶1（tryptophan Hydroxylase 1，TPH1）和突觸體相關(guān)蛋白25（synaptosome associated Protein 25，SNAP25）mRNA表達(dá)的檢測(cè)，所有實(shí)驗(yàn)方案嚴(yán)格按照qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，反應(yīng)體系為20 μL。TPH1、SNAP25和ACTB引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

海馬組織總RNA提取方法如下：將海馬組織加入1 mL Trizol 試劑，勻漿后以離心半徑15 cm，12 000 r/min條件下離心15 min取上清液；加入200 μL氯仿，振蕩15 s 后靜置5 min，在離心半徑15 cm，12 000 r/min 離心15 min 取上清液；加入500 μL異丙醇，搖勻后在離心半徑15 cm，12 000 r/min離心10 min，取上清液；加入1 mL75%乙醇，吹打后離心半徑15 cm，7000 r/min離心5 min，棄去上清液；加入60 μL RNase-free水溶解沉淀，搖勻。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料使用表示，使用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)表現(xiàn)與正常對(duì)照組比較，其余各族可顯著增加小鼠在強(qiáng)迫游泳測(cè)試與懸尾測(cè)試中的累積不動(dòng)時(shí)間（P＜0.01），減少小鼠在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中的進(jìn)入開(kāi)臂時(shí)間及糖水偏好率（P＜0.01），對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與模型對(duì)照組比較，當(dāng)歸多糖高劑量組和氟西汀組顯著降低小鼠在強(qiáng)迫游泳測(cè)試中的累積不動(dòng)時(shí)間（P＜0.05），增加小鼠在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中的進(jìn)入開(kāi)臂時(shí)間及糖水偏好率（P＜0.05）；當(dāng)歸多糖各組及氟西汀組可顯著降低小鼠在懸尾測(cè)試中的累積不動(dòng)時(shí)間（P＜0.05），對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠行為學(xué)表現(xiàn)

2.2 海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)含量與正常對(duì)照組比較，其余各組顯著減少小鼠海馬組織中DA、5-HT含量及GABA/GLU比率（P＜0.01），對(duì)GABA和GLU含量的影響未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與模型對(duì)照組比較，當(dāng)歸多糖高劑量組和氟西汀組可顯著增加小鼠海馬組織中DA 和5-HT 含量（P＜0.05）；當(dāng)歸多糖高劑量組顯著增加小鼠海馬組織中GABA/GLU 比率（P＜0.05），對(duì)GABA 和GLU 含量的影響未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)含量

2.3 海馬組織中TPH1 和SNAP25 mRNA 表達(dá)與正常對(duì)照組比較，其余各組可顯著減少小鼠海馬組織中的TPH1、SNAP25 mRNA 表達(dá)（P＜0.05）。與模型對(duì)照組比較，當(dāng)歸多糖高劑量組可顯著增加小鼠海馬組織中的TPH1 mRNA 表達(dá)（P＜0.05），對(duì)SNAP25 mRNA表達(dá)的影響未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠海馬組織中TPH1和SNAP25 mRNA表達(dá)

3 討論

在我國(guó)，抑郁癥已經(jīng)成為造成青少年非正常死亡的首要原因［29］。近年來(lái)，抑郁癥和身體健康之間的生物學(xué)關(guān)聯(lián)越發(fā)得到重視［1］。由于細(xì)胞模型無(wú)法滿足對(duì)情緒及認(rèn)知評(píng)估的要求，動(dòng)物模型仍舊是抑郁癥實(shí)驗(yàn)研究的首選［30］。目前，常用的抑郁癥動(dòng)物模型包括藥物誘導(dǎo)、慢性應(yīng)激誘導(dǎo)與腦損傷誘導(dǎo)等［30-31］。而作為人類抑郁癥的誘因之一，動(dòng)物在經(jīng)歷慢性應(yīng)激后容易產(chǎn)生與人類相似的食欲減少、淡漠及絕望情緒等抑郁癥狀［32］。因此，慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁模型是目前抗抑郁藥物評(píng)價(jià)時(shí)的常用模型［32-33］。在本研究中，我們采用慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁小鼠模型探討當(dāng)歸中的主要活性成分當(dāng)歸多糖對(duì)抑郁癥的影響。

在臨床上，抑郁量表與行為評(píng)分是評(píng)估抑郁癥程度的重要指標(biāo)［34］。在動(dòng)物模型上，由于可以較好地反映動(dòng)物認(rèn)知情況，行為學(xué)評(píng)估在抑郁癥藥物篩選中也是至關(guān)重要的［35-36］。常規(guī)的抑郁相關(guān)動(dòng)物行為學(xué)評(píng)估包括糖水偏好率、FST、TST、EMPT 及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（open field test，OFT）等［37-38］。這些測(cè)試能夠評(píng)估動(dòng)物的認(rèn)知與絕望情緒，進(jìn)而反應(yīng)動(dòng)物的抑郁行為程度。在本研究中，模型組小鼠糖水偏好率、FST、TST、EMPT 顯著變化，說(shuō)明慢性應(yīng)激誘導(dǎo)了小鼠抑郁行為；高劑量當(dāng)歸多糖可對(duì)小鼠糖水偏好率、FST、TST、EMPT 進(jìn)行調(diào)節(jié)。該結(jié)果提示當(dāng)歸中的主要活性成分當(dāng)歸多糖能夠通過(guò)改善抑郁行為對(duì)抑郁癥產(chǎn)生影響。

抑郁行為的發(fā)展常與大腦中的神經(jīng)遞質(zhì)變化有關(guān)［39］。作為學(xué)習(xí)與記憶的關(guān)鍵部位，海馬組織也與抑郁癥的發(fā)生關(guān)系密切［40］。當(dāng)抑郁發(fā)生時(shí)，海馬組織內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)傳導(dǎo)功能通常顯著受損［41-42］。在抑郁癥實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校ｑR組織中的神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)是常用的抑郁評(píng)估指標(biāo)［43］。這些神經(jīng)遞質(zhì)包括DA、5-HT、GABA、GLU 和5-羥吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA）等［44-46］。其中，DA 的缺失能夠引起悲傷和自我否定［47］；5-HT分泌減少能夠誘發(fā)人類抑郁與自殺行為［34］；GABA能夠直接影響人類認(rèn)知與焦慮情緒［47］；海馬組織內(nèi)GLU 水平異常升高能夠引發(fā)興奮性神經(jīng)毒性，進(jìn)而促進(jìn)抑郁的產(chǎn)生［48］；GABA/GLU 比值變化與腦內(nèi)興奮抑制功能紊亂相關(guān)［48］。在本研究中，模型組小鼠海馬組織中DA、5-HT含量及GABA/GLU比率的下降，說(shuō)明慢性應(yīng)激誘導(dǎo)了小鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)傳導(dǎo)功能減退與興奮抑制功能紊亂；高劑量當(dāng)歸多糖對(duì)小鼠海馬組織中DA、5-HT 含量及GABA/GLU比率的調(diào)節(jié)指示：當(dāng)歸多糖能夠改善慢性應(yīng)激誘發(fā)的小鼠大腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)傳導(dǎo)功能減退與興奮抑制功能紊亂。該結(jié)果提示當(dāng)歸中的主要活性成分當(dāng)歸多糖改善抑郁癥的效果可能與其能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)傳導(dǎo)及糾正興奮抑制功能紊亂有關(guān)。

在抑郁癥的發(fā)生發(fā)展中，相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)紊亂常與其上下游效應(yīng)分子變化有關(guān)［5，36］。5-HT 是抑郁過(guò)程中的重要靶點(diǎn)，其在中樞系統(tǒng)的表達(dá)與抑郁行為密切相關(guān)［6］。TPH1 是5-HT 合成過(guò)程中的重要限速酶，與5-HT 含量直接相關(guān)，因此檢測(cè)海馬組織中TPH1 的表達(dá)可以衡量5-HT 傳導(dǎo)功能的情況［49］。SNAP25 直接影響著DA、5-HT、GLU 及GABA 等神經(jīng)遞質(zhì)合成后的遞質(zhì)釋放，與神經(jīng)遞質(zhì)傳遞能力密切相關(guān)。因此，檢測(cè)TPH1 和SNAP25 mRNA 表達(dá)可以評(píng)估腦內(nèi)5-HT 合成與神經(jīng)遞質(zhì)傳遞情況［50］。在本研究中，模型組小鼠海馬組織中TPH1 和SNAP25 mRNA 表達(dá)顯著下降，說(shuō)明慢性應(yīng)激誘導(dǎo)了小鼠腦內(nèi)5-HT 合成障礙和神經(jīng)遞質(zhì)傳遞功能減退；高劑量當(dāng)歸多糖組小鼠海馬組織中TPH1 mRNA 表達(dá)升高，SNAP25 mRNA 表達(dá)未見(jiàn)明顯變化，說(shuō)明當(dāng)歸多糖能夠改善慢性應(yīng)激誘發(fā)的小鼠腦內(nèi)5-HT 合成障礙。綜合該結(jié)果與腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量變化結(jié)果，提示當(dāng)歸中的主要活性成分當(dāng)歸多糖改善抑郁癥的效果可能與TPH1 mRNA 表達(dá)升高引起5-HT 合成增加有關(guān)，與SNAP25 mRNA表達(dá)變化引發(fā)的神經(jīng)遞質(zhì)傳遞功能變化無(wú)關(guān)。

在本研究中，我們通過(guò)行為學(xué)評(píng)價(jià)、神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)及mRNA 測(cè)定的方法探討了當(dāng)歸多糖對(duì)慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁模型小鼠的影響及作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸多糖能夠改善慢性應(yīng)激模型小鼠抑郁行為；其作用機(jī)制與上調(diào)TPH1 mRNA 表達(dá)引起5-HT 合成增加、提高DA 含量及升高GABA/GLU 比率進(jìn)而調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)傳導(dǎo)及糾正興奮抑制功能紊亂有關(guān)，與調(diào)節(jié)SNAP25 mRNA 表達(dá)變化無(wú)關(guān)。該研究結(jié)果能夠?yàn)楫?dāng)歸多糖改善抑郁癥的藥物開(kāi)發(fā)和作用機(jī)制研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。然而當(dāng)歸多糖改善抑郁癥的作用機(jī)制仍未完全明晰。在未來(lái)的研究中，我們將進(jìn)一步探討當(dāng)歸多糖對(duì)腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)上下游效應(yīng)分子的影響。