藏藥普爾那提取物對(duì)宮頸癌海拉細(xì)胞增殖作用的研究?

陳 靜，褚福浩，金珠措姆，索朗次仁，單增卓嘎

1 西藏藏醫(yī)藥大學(xué)，西藏 拉薩 850000；2 北京中醫(yī)藥大學(xué)

宮頸癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤疾病之一。全世界每年死于宮頸癌的女性超過(guò)20 萬(wàn)人。目前，該病的死亡率已攀升至女性癌病的第二位。藏藥普爾那Artemisia vestitaWall.ex Bess.為菊科蒿屬植物全草，具有清熱解毒、殺蟲(chóng)利濕等功效，藏醫(yī)臨床常用來(lái)治療蟲(chóng)病、腦炎、皮膚病、溫毒疔毒瘡、咽喉病等［1-5］，現(xiàn)代研究也用于治療婦科疾病，如乳腺炎、慢性附件炎、痛經(jīng)等［6］。查閱文獻(xiàn)可知，藏藥普爾那的化學(xué)成分有綠原酸［7］、熊果酸［8］、棕矢車(chē)菊素、柳穿魚(yú)素、中國(guó)薊醇、傘型花內(nèi)酯和薊黃素等，基于熊果酸、棕矢車(chē)菊素具有抗腫瘤活性［9-12］，本研究以四唑鹽（MTT）比色法檢測(cè)普爾那不同部位的乙酸乙酯提取物、石油醚提取物對(duì)宮頸癌海拉細(xì)胞（hela cell）的作用，為其科學(xué)、合理用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞宮頸癌hela 細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院納米科研中心提供。

1.2 試藥RPMI-1640 培養(yǎng)基（HyClone，批號(hào)：AF29584257），DMEM培養(yǎng)基（Gibco，批號(hào)：8120350），0.25%胰蛋白酶溶液（Gibco，批號(hào)：2177715），磷酸鹽緩沖液（Corning，批號(hào)：05717003）；胎牛血清（FBS，四季青，批號(hào)：20030502）；噻唑藍(lán)（MTT，阿拉丁，批號(hào)：20170606）；二甲基亞砜（DMSO，天津百倫斯生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20170720）；青鏈霉素混合液（Gibco，批號(hào)：1640831）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器3111 型CO2培養(yǎng)箱（Thermo）；生物安全柜（HFsafe）；酶標(biāo)儀（Multiskan GO）；LD5-2B 型臺(tái)式低速離心機(jī)（京立）；IX71 倒置熒光顯微鏡（Olympus）；96 孔板（Corning）；離心管（Costor）；其他耗材均為國(guó)產(chǎn)耗材。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 普爾那提取物制備分別取干燥的普爾納根莖、葉的粉末10 g，加入10倍量80%乙醇，50℃、頻率100%超聲提取3次，每次1 h，濾過(guò)，合并提取液，提取液減壓濃縮至無(wú)醇味。用水復(fù)溶，以乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮至浸膏狀態(tài)，烘干，稱質(zhì)量，得根莖乙酸乙酯提取物（GE）和石油醚提取物（GP）、葉乙酸乙酯提取物（YE）和石油醚提取物（YP）。稱取一定量的GE、GP、YE、YP，分別加入適量的DMSO配制成10 mg/mL的儲(chǔ)備液，其中DMSO占總體積比小于10%。取0.22 μm 的無(wú)菌濾膜，過(guò)濾除菌，得濾液，備用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)宮頸癌hela細(xì)胞培養(yǎng)在含有1%胎牛血清、1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液。hela 細(xì)胞呈貼壁狀態(tài)生長(zhǎng)，待細(xì)胞數(shù)量適量、生長(zhǎng)狀態(tài)良好（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)）時(shí)傳代培養(yǎng)或鋪板。

2.3 倒置顯微鏡觀察hela 細(xì)胞形態(tài)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定普爾那不同提取物的濃度梯度為125、250、500 μg/mL。將各提取物分別加入到宮頸癌hela 細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.4 MTT 法檢測(cè)hela 細(xì)胞的增殖取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的宮頸癌HeLa 細(xì)胞，以3×103個(gè)/mL 的細(xì)胞數(shù)濃度接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL，置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基。取一定量的儲(chǔ)備液用新鮮培養(yǎng)液稀釋至系列濃度0、125、250、500 μg/mL 的待測(cè)樣品液，在有細(xì)胞的孔板中分別加入100 μL 不同濃度的待測(cè)液，并設(shè)空白組（無(wú)細(xì)胞，僅加入培養(yǎng)基），測(cè)試組與空白組均設(shè)置4 個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT 溶液（避光操作），繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后終止培養(yǎng)。棄去上清液，加入150 μL/孔的DMSO，充分震蕩，待紫色結(jié)晶充分溶解后，用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm下的OD 值，計(jì)算不同濃度普爾那乙酸乙酯提取物對(duì)肝癌細(xì)胞hela 的增殖抑制率，正常組為加入濃度為0 μg/mL的待測(cè)液。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

125 μg/mL濃度GE、YP、GP對(duì)hela細(xì)胞增殖有一定的抑制作用，但抑制作用不明顯；高劑量GP和YE 對(duì)hela 細(xì)胞表現(xiàn)出一定抑制活性；低劑量GE 和YP 對(duì)hela 細(xì)胞表現(xiàn)出一定抑制活性，隨著濃度的升高，抑制作用降低。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度GE、GP、YE、YP對(duì)宮頸癌hela細(xì)胞增殖的抑制率比較（） %

表1 不同濃度GE、GP、YE、YP對(duì)宮頸癌hela細(xì)胞增殖的抑制率比較（） %

4 討論

藏藥普爾那具有抗菌、消炎的作用，廣泛用于藏醫(yī)臨床［12-14］。體外實(shí)驗(yàn)表明，GP、YE部位隨濃度增加，其對(duì)細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用，而GE、YP 部位則隨著濃度的增加，其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用降低［15］。125 μg/mL 的低濃度YP 部位的抑制作用相對(duì)最強(qiáng)，抑制率為（65.0±0.30）%。

普爾那提取物對(duì)hela 細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用，其不同部位提取物表現(xiàn)出的抑制規(guī)律顯著不同，應(yīng)進(jìn)一步研究藏藥普爾那的物質(zhì)基礎(chǔ)、藥理活性，進(jìn)行體外、動(dòng)物毒性實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)格控制其臨床使用劑量。