膽道閉鎖患兒血清microRNA-21水平的表達及與肝纖維化的相關性分析*

宮穎新，王萍，白玉坤，張桂枝，焦晗亮，劉偉棟，李楊，祁艷衛(wèi)

（河北省兒童醫(yī)院普外二科，河北石家莊050031）

膽道閉鎖是新生兒、嬰幼兒出現(xiàn)阻塞性黃疸的最主要病因之一，具體病理表現(xiàn)為肝內外膽管進行性炎癥及纖維性梗阻，隨病情持續(xù)進展后續(xù)可出現(xiàn)肝纖維化、肝硬化，嚴重可導致小兒死亡[1-3]。膽道閉鎖患兒行手術治療的預后差異較大，故對其發(fā)病機制、防治手段等探索具有重要的臨床意義。microRNA 是一類高度保守的小分子，參與細胞增殖、分化、胚胎發(fā)育、信號傳導等多個生命過程，且在腫瘤發(fā)生過程中也扮演重要角色。有研究[4]指出microRNA 在膽道閉鎖的發(fā)生中扮演重要角色。且AFONSO[5]等研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-21（miR-21）消融術可預防膽汁淤積癥患者的肝損傷和壞死。膽道閉鎖患兒膽汁淤積嚴重，但國內關于miR-21 在膽道閉鎖病程中扮演角色的研究極少。本文探討膽道閉鎖患兒血清中miR-21 的表達水平，并分析其具體表達量與肝纖維化的內在聯(lián)系，旨在明確miR-21 對膽道閉鎖病情進展的影響，并為后續(xù)疾病治療干預等提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年7月—2019年7月河北省兒童醫(yī)院收治的先天性膽道閉鎖患兒76 例作為膽道閉鎖組。其中，男性36 例，女性40 例；年齡1～6 個月，平均年齡（3.17±0.49）個月。納入標準：①均經(jīng)葛西探查、膽道造影及病理確診為膽道閉鎖；②符合手術指征，既往無相關治療史。排除標準：①合并先天性心臟病等其他嚴重先天性疾?。虎诤喜⒒A性肝臟病變。選取同期在本院進行體檢的健康嬰幼兒50 例作為正常對照組，各項檢查結果均在正常范圍內、未合并明顯先天性疾病，其監(jiān)護人簽署知情同意書。其中，男性23 例、女性27 例，年齡1～5 個月，平均年齡（3.21±0.68）個月。兩組小兒的基礎資料分布差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患兒監(jiān)護人簽署知情同意書。

1.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測miR-21 mRNA相對表達量

膽道閉鎖組患兒在術前1 周內收集外周靜脈血標本；正常對照組小兒在體檢時留取外周靜脈血標本。標本收集后2 h內以3 000 r/min離心10 min，分離上層血清并置于-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩２捎胵RT-PCR 法檢測血清中miR-21 mRNA 相對表達量。其引物序列為正向：5'-AGCTTGACCGTAGCGGATG-3'；反向：3'-TCGAAGCTGAAAGCTGAGT-5'。具體步驟：提取總RNA、測定RNA 濃度及純度、逆轉錄反應、qRT-PCR 反應?？俁NA 提取試劑盒購自加拿大Norgen 公司，逆轉錄試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司，PCR 試劑盒購自北京華夏遠洋科技有限公司。以U6為內參，2-△△Ct法計算各組受試小兒miR-21 mRNA 相對表達量。膽道閉鎖組患兒根據(jù)miR-21 mRNA 相對表達量的中位數(shù)進一步分為高miR-21 組和低miR-21 組，每組38 例。

1.3 血清總膽紅素檢測

取1.2 血液標本，使用德國利霸XL300 全自動生化分析儀檢測其血清總膽紅素水平。

1.4 肝組織纖維化評分及天冬氨酸轉氨酶與血小板比值（APRI）計算

調取病理科膽道閉鎖患兒術中肝組織切片，采用改良HAI 的Ishak 系統(tǒng)進行肝纖維化評分[6]。采用0～6 分評分值，隨分值增加，肝纖維化程度加重。其中，0 分為無纖維化，1～3 分為低纖維化，4～6 分為高纖維化。同時采用APRI 肝纖維化無創(chuàng)診斷模型對患者肝纖維化程度進行評估[7]，計算APRI，計算公式為APRI=（血清AST/60）×（100/血小板計數(shù)）。

1.5 血清肝纖維化指標檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清標本中肝纖維化指標的水平，包括層粘連蛋白（LN）、透明質酸酶（HA）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-Col）。酶聯(lián)免疫試劑盒購自美國Abcam 公司。

1.6 上皮-間質細胞轉化（EMT）相關分子相對表達量檢測

取膽道閉鎖組患兒的術中病變肝臟組織標本，采用qRT-PCR 法檢測EMT 相關分子的表達水平，其引物序列分別為E-cadherin正向：5'-AGCTGGTT GACTAGCGTAGT-3'，反向：3'-CTAAGCTGATGGC GTAGTA-5'；ZEB1正向：5'-TAGCTGAGCGGCTGA GAT-3'，反向：3'-ATCGGATGCGGGAACTTAGC-5'。以β-catenin為內參，正向：5’-GCTGGCCCCAGCC GCTGGAG-3’，反向：5’-GAGTGCAGGGTCAGC ACTAC-3’。具體檢測步驟同1.2。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗；計數(shù)資料以構成比（%）表示，比較用χ2檢驗；相關分析用Pearson 法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-21 mRNA相對表達量的比較

膽道閉鎖組患兒的miR-21 mRNA相對表達量的中位數(shù)為9.33，高miR-21 組、低miR-21 組、正常對照組血清miR-21 mRNA相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=398.075，P=0.000），高miR-21 組高于低miR-21 組（t=5.818，P=0.000），低miR-21 組高于正常對照組（t=25.095，P=0.000）。見表1。

表1 各組小兒血清miR-21 mRNA相對表達量的比較（±s）

表1 各組小兒血清miR-21 mRNA相對表達量的比較（±s）

注：①與正常對照組比較，P<0.05；②與低miR-21組比較，P<0.05。

microRNA-21 mRNA組別n 11.46±2.13①②8.18±1.14①3.04±0.78高miR-21組低miR-21組正常對照組38 38 50

2.2 血清總膽紅素水平的比較

高miR-21 組、低miR-21 組、正常對照組血清總膽紅素水平比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=516.478，P=0.000），高miR-21 組高于低miR-21 組（t=7.754，P=0.000），低miR-21 組高于正常對照組（t=28.913，P=0.000）。見表2。

表2 各組小兒血清總膽紅素水平的比較 （mg/dl，±s）

表2 各組小兒血清總膽紅素水平的比較 （mg/dl，±s）

注：①與正常對照組比較，P<0.05；②與低miR-21組比較，P<0.05。

血清總膽紅素組別n 21.31±3.76①②15.48±2.71①4.10±0.57高miR-21組低miR-21組正常對照組38 38 50

2.3 肝組織纖維化評分及APRI值的比較

高miR-21 組與低miR-21 組肝組織纖維化評分、APRI 比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），高miR-21 組的肝組織纖維化評分、APRI 高于低miR-21 組（P<0.05）。兩組纖維化程度比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

表3 不同miR-21表達水平的膽道閉鎖患兒肝組織纖維化評分及APRI比較

2.4 血清肝纖維化指標的比較

膽道閉鎖患兒中，兩組血清LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-Col 水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），高miR-21 組高于低microRNA-21 組。見表4。

表4 不同microRNA-21表達水平的膽道閉鎖患兒血清肝纖維化指標水平比較 （n=38，±s）

表4 不同microRNA-21表達水平的膽道閉鎖患兒血清肝纖維化指標水平比較 （n=38，±s）

組別LN/（μg/ml）HA/（mg/L）PCⅢ/（μg/L）Ⅳ-Col/（μg/L）高miR-21組低miR-21組t 值P 值218.39±30.77 142.53±19.86 12.769 0.000 194.37±25.22 128.04±15.19 13.888 0.000 187.51±22.69 141.12±18.63 9.741 0.000 161.07±22.85 99.63±11.74 14.743 0.000

2.5 EMT相關分子相對表達量的比較

膽道閉鎖患兒中，兩組肝臟組織E-cadherin mRNA 的表達量和ZEB1 mRNA 的表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），高miR-21 組Ecadherin mRNA 的表達量低于低miR-21 組，ZEB1 mRNA 的表達量高于低miR-21 組。見表5。

表5 不同miR-21表達水平的膽道閉鎖患兒肝臟組織EMT相關分子mRNA相對表達量的比較 （n=38）

2.6 相關性分析

膽道閉鎖患兒血清miR-21 水平與血清總膽紅素水平、肝組織纖維化評分、APRI 值呈正相關（r=0.546、0.669 和0.578，P=0.023、0.014 和0.019）；與肝纖維化指標LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-Col 的水平呈正相關（r=0.781、0.663、0.628 和0.503，P=0.000、0.014、0.018 和0.037）；與E-cadherin mRNA 相對表達量呈負相關（r=-0.614，P=0.018）；與ZEB1 mRNA 相對表達量呈正相關（r=0.607，P=0.019）。

3 討論

miR-21 是重要的microRNA 之一，除了參與增殖、凋亡、生殖等多個生命過程，越來越多研究發(fā)現(xiàn)其在各種病理狀態(tài)下也發(fā)揮重要作用，如CHEN 等[8]研究指出miR-21 參與缺氧/復氧誘導的小鼠腎小管上皮細胞凋亡；SOEDA 等[9]認為miR-21在預測胃癌患者腹膜復發(fā)方面意義重大。膽道閉鎖約占新生兒長期阻塞性黃疸的50%左右，可導致淤膽性肝硬化，最終發(fā)生肝衰竭，是小兒肝移植最常見的適應證。手術是膽道閉鎖最有效的治療方法，但鑒于目前肝源有限的現(xiàn)狀，積極延緩膽道閉鎖患兒的肝纖維化進程，增加患兒可等待手術的時間對患兒最終治療結局的改善有重要意義，故需積極明確對膽道閉鎖患兒肝纖維化產(chǎn)生重要影響的分子靶點。目前國外研究[10]指出miR-21 可能是膽汁淤積性兒科肝病的重要病因學標志物。膽道閉鎖是最嚴重的膽汁淤積性兒科疾病之一，目前國內關于miR-21 與該病病情的內在聯(lián)系研究不多。本研究結果發(fā)現(xiàn)，膽道閉鎖患兒血清中miR-21 mRNA 相對表達量與健康小兒比較有了大幅升高，推測異常高表達的miR-21 可能參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。血清總膽紅素水平是反映膽道閉鎖患兒病情嚴重程度的最常用指標，文中膽道閉鎖組患兒血清總膽紅素水平較正常小兒大幅上升，且其中高miR-21 組上升更為顯著，相關性分析進一步證實膽道閉鎖患兒血清miR-21 表達量與血清總膽紅素水平呈正相關關系，初步說明高miR-21 表達對膽道閉鎖病情嚴重程度有指向性。關于miR-21 在膽道閉鎖患兒中表達上調并預示病情較重的具體原因，目前尚未有結論、有待后續(xù)基礎研究深入明確。

肝纖維化是膽道閉鎖患兒膽汁淤積持續(xù)加重后對肝臟組織產(chǎn)生損害的最終結果，也是導致患兒治療預后不佳及死亡的直接原因之一。有研究指出miR-21 可調節(jié)肺纖維化[11]、心肌纖維化[12]進程，其是否也通過調節(jié)膽道閉鎖患兒的肝纖維化進程從而左右整體病情及治療結局目前尚無結論。研究結果發(fā)現(xiàn)，高miR-21 組患兒的肝組織纖維化評分、APRI 均較高，初步說明miR-21 高表達對膽道閉鎖患兒肝纖維化的促進作用。檢測血清肝纖維化指標水平是佐證纖維化病情嚴重程度的常用手段，主要包括LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-Col，既往多用于衡量慢性肝病的炎癥活動度及纖維化程度[13-14]。本文中高miR-21 組患兒上述纖維化指標的水平較高，進一步佐證miR-21 在促進膽道閉鎖患兒肝纖維化進程方面的作用。

目前大量研究[15-16]提示EMT 可促進產(chǎn)生過多的肌成纖維細胞并使細胞外基質大量堆積，最終導致器官出現(xiàn)纖維化。在膽道閉鎖進程中，隨膽汁淤積加重肝細胞EMT 進程加速，共同誘導纖維化促進因子TGF-β1的過表達并導致肝纖維化發(fā)生發(fā)展[17-18]。E-cadherin 是EMT 進程的重要分子，ZEB1可通過抑制E-cadherin 表達而促進EMT 發(fā)生發(fā)展[19-21]。本研究高miR-21 組患兒肝臟病灶組織ZEB1 mRNA 相對表達量較高，而E-cadherin mRNA相對表達量較低，說明miR-21 高表達預示著旺盛的EMT 過程，推測miR-21 可能通過促進肝細胞EMT 而加速其纖維化過程，從而促進膽道閉鎖患兒發(fā)生肝纖維化。關于miR-21 對EMT 產(chǎn)生影響的直接機制研究目前涉及極少，有待后續(xù)基礎研究進一步深入明確。

綜上所述，膽道閉鎖患兒血清中miR-21 mRNA 相對表達量水平異常升高，且與患兒肝纖維化程度一致，可能通過調節(jié)EMT 過程而實現(xiàn)上述作用，但具體機制有待后續(xù)細胞研究進一步開展明確。