血清microRNA-618表達與原發(fā)性肝癌療效及預后的關(guān)系

韓齡鋒，蔣輝，趙俊，徐強，降禮軍，蔣鷗

（內(nèi)江市第二人民醫(yī)院超聲科,四川內(nèi)江641000）

原發(fā)性肝癌（primary hepatic cancer,PHC）是肝膽外科常見的惡性腫瘤，多發(fā)于中老年男性群體。目前，該疾病具體發(fā)病機制尚未明確，但普遍認為與肝硬化、病毒性肝炎、化學致癌物質(zhì)等因素關(guān)系密切[1]。臨床對早期肝癌多采用手術(shù)切除治療，雖然可徹底根除，但部分患者因肝硬化、抵抗力差、腫瘤分期較晚等因素，已無法接受一期手術(shù)治療，故多采用肝動脈化療栓塞（transcatheter arterial chemoembolization,TACE）、激光、冷凍、高強度聚焦超聲（high intensity focused ultrasound,HIFU）等綜合治療方法[2-3]。TACE 是無法手術(shù)PHC患者的首選治療方式，將含有化療藥物的混合劑注入至肝動脈，從而使腫瘤局部保持較高的藥物濃度，提高化療效果，并可通過栓塞切斷病灶處血液供應，促使腫瘤細胞凋亡[4-5]。HIFU 是在機體內(nèi)病變區(qū)域聚集穿透性較強的超聲波，使該區(qū)域瞬時升溫，進而促使腫瘤細胞壞死[6]。由于PHC 患者接受TACE 聯(lián)合HIFU 治療的術(shù)后表現(xiàn)及預后不一，目前臨床尚無可靠標志物預測治療效果及預后。因此，發(fā)現(xiàn)可預測術(shù)后預后的生物學標志物對PHC 患者的治療具有重要意義。已有研究證實，microRNA-618（miR-618）是一種腫瘤抑制因子，在胃癌、甲狀腺癌、前列腺癌等多種腫瘤中呈異常表達，可能參與腫瘤發(fā)病過程[7]。然而，目前關(guān)于miR-618 表達與PHC 的相關(guān)研究少有開展，miR-618是否參與PHC 的發(fā)生、發(fā)展仍需驗證。本研究探討血清miR-618 表達與PHC 療效及預后的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年2月—2018年3月在內(nèi)江市第二人民醫(yī)院接受治療的PHC 患者65 例作為病例組。其中，男性42 例，女性23 例；年齡42～75 歲，平均年齡（62.34±4.72）歲；體重指數(shù)（BMI）（21.59±2.24）kg/m2。納入標準：符合《原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南（2015年版）》[8]相關(guān)診斷標準，且經(jīng)臨床影像學確診為PHC 者；Child-Pugh 分級A、B級；患者及家屬自愿簽署知情同意書；治療前未接受無水酒精灌注、射頻消融等治療；腫瘤最大直徑≤10 cm；腫瘤數(shù)量≤3 個。排除標準：合并其他重要器官（心、腦等）惡性腫瘤者；合并凝血功能或其他血液系統(tǒng)疾病者；合并免疫系統(tǒng)疾病者；腫瘤保留不完整、邊界模糊者；既往接受過肝膽手術(shù)者；已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移者；門靜脈主干癌栓者。另選取同期65 例健康體檢者為健康組。其中，男性40 例，女性25 例；年齡43～75 歲，平均（63.06±5.03）歲；平均BMI（22.31±2.46）kg/m2。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 TACE術(shù)前常規(guī)檢查血常規(guī)、肝腎功能等，并對患者身體狀況進行評估。將患者置于平臥位，局部麻醉，經(jīng)右側(cè)股動脈穿刺并置管，行腹腔干及腸系膜動脈造影，確定腫瘤的血供情況，并在造影引導下置管至此，緩慢將碘油、化療藥物混合物經(jīng)壓力注射器注入靶血管，在造影的配合下，確保栓塞滿意，必要時可多次栓塞?；熕幬铮喉樸K（廣東嶺南制藥有限公司，國藥準字H20183341）50 mg，博來霉素（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H20051232）20 mg、吡柔比星（深圳萬樂藥業(yè)有限公司，國藥準字H10930105）30 mg、碘化醇50 ml、超液化碘化油（上海旭東海普藥業(yè)有限公司，國藥準字H31021603）15～20 ml?？筛鶕?jù)患者身體狀況、腫瘤大小調(diào)整用量。

1.2.2 HIFUTACE 術(shù)后1～2 周進行HIFU 治療，術(shù)前常規(guī)準備，包括腸道準備、治療區(qū)皮膚脫脂脫氣處理，采用持續(xù)硬膜外麻醉。機載超聲明確腫瘤確切位置，在超聲的引導、監(jiān)測下開始治療，治療順序由點至線，由線至面，最后由面至體，為防止腫瘤細胞清除不徹底，各治療層面需相互重疊。若患者腫瘤位于肝臟膈頂區(qū)域或邊緣區(qū)域，則行全身麻醉。術(shù)中注入600～750 ml 人工胸水，在呼吸機幫助下，充分顯露被肺部氣體、肋骨遮擋的腫瘤區(qū)域。為減少術(shù)后組織水腫，治療區(qū)皮膚行間歇性冰敷。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清腫瘤標志物水平于治療前、治療1 周后采集病例組患者空腹靜脈血3 ml，3 000 r/min 離心5 min，取上清液，置入-20℃冰箱冷凍保存，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清甲胎蛋白（AFP）、甲胎蛋白異質(zhì)體（AFP-L3）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）、高爾基體蛋白-73（GP73）水平，試劑盒購自上海研卉生物科技有限公司；并分析血清腫瘤標志物與miR-618 表達的相關(guān)性。

1.3 熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測miR-618相對表達量

采集研究對象空腹靜脈血5 ml，室溫下12 500 r/min離心15 min，取上清液于干凈離心管中，-80℃冰箱冷凍保存。參考Trizol 試劑盒、總RNA 提取試劑盒（愛必信上海生物科技有限公司）說明書提取血清中總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海研卉生物科技有限公司）將提取的RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。將逆轉(zhuǎn)錄反應試劑盒放置冰上，融化試劑，按照說明書在miRNA 樣本中加入體積為7.5 μl 逆轉(zhuǎn)錄反應混合液，混勻，2 000 r/min 離心5 min，使用逆轉(zhuǎn)錄熱循環(huán)儀，采用7.5 μl 反應體系，反應條件：16℃30 min，42℃ 30 min， 85℃ 5 min。 使用美國Applied Biosystems 公司ABI 7500 PCR 儀進行熒光定量測量，反應總體系為20 μl。qRT-PCR 檢測miR-618 mRNA相對表達量，全自動qRT-PCR 儀（美國ABI 科技有限公司）進行擴增，反應條件：95℃預變性20 s，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸10 s，循環(huán)40 次，72℃延伸10 min。miR-618 正向引物：5'-GGGGAAACTCTACTTGTCCTT-3'，反向引物：5'-TCGTATCCAGTGCGTGTCGT-3'。U6為內(nèi)參，正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。根據(jù)2-ΔΔCt法計算miR-618 mRNA 相對表達量。

1.4 觀察指標

①兩組研究對象治療前及治療1 周后miR-618 mRNA 相對表達量；②病例組患者血清miR-618 mRNA 相對表達量與性別、年齡、腫瘤直徑、Childpugh 分級、是否伴有肝硬化及癌栓的關(guān)系；③病例組患者血清血清AFP、AFP-L3、GPC3、GP73 水平及其與miR-618 表達的相關(guān)性。④治療后隨訪，統(tǒng)計miR-618 mRNA 高表達、低表達患者平均疾病進展時間（TTP）和中位生存期（MST）。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗；相關(guān)分析用Pearson 法；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 健康組和病例組miR-618 mRNA相對表達量比較

健康組血清miR-618 mRNA 相對表達量為（1.03±0.43），病例組治療前血清miR-618 mRNA相對表達量為（0.72±0.21），治療后為（0.83±0.19）。病例組治療前血清miR-618 mRNA 相對表達量與健康組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.223，P=0.000），病例組較健康組低；病例組治療前后血清miR-618 mRNA 相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.132，P=0.002），治療后較治療前高。

2.2 病例組不同臨床病理特征患者治療前血清miR-618 mRNA 相對表達量的比較

病例組不同性別、年齡、腫瘤直徑、Childpugh 分級、是否伴有肝硬化及是否癌栓患者治療前血清miR-618 mRNA 相對表達量比較，經(jīng)t檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 病例組不同臨床病理特征患者治療前血清miR-618 mRNA相對表達量的比較 （±s）

表1 病例組不同臨床病理特征患者治療前血清miR-618 mRNA相對表達量的比較 （±s）

臨床病理特征性別n miR-618 mRNA t 值P 值男女年齡42 23 0.68±0.32 0.75±0.29 0.871 0.387<60歲≥60歲腫瘤直徑<5 cm≥5 cm Child-pugh分級A級（5～6分）B級（7～9分）肝硬化26 39 0.74±0.33 0.71±0.28 0.394 0.695 30 35 0.77±0.39 0.69±0.25 0.998 0.322 51 14 0.72±0.26 0.71±0.34 0.119 0.906有無癌50 15 0.75±0.41 0.71±0.36 0.340 0.735栓有無6 0.717 0.476 59 0.68±0.36 0.76±0.25

2.3 血清miR-618 mRNA相對表達量與腫瘤標志物水平的關(guān)系

病例組治療前血清miR-618 mRNA 相對表達量為（0.72±0.21），以0.72 作為標準，將病例組分為低表達組（26 例）和高表達組（39 例）。兩組治療后miR-618 mRNA 相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），低表達組比高表達組低。兩組治療后AFP-L3、AFP、GPC3、GP73 水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），低表達組比高表達組高（見表2）。Pearson 相關(guān)分析顯示，血清miR-618 mRNA相對表達量與血清AFP-L3、AFP、GPC3、GP73 水平呈負相關(guān)（r=-0.453、-0.568、-0.412 和-0.612，P=0.000、0.000、0.003 和0.000）。

表2 高表達組、低表達組治療后miR-618 mRNA相對表達量、血清腫瘤標志物水平比較 （±s）

表2 高表達組、低表達組治療后miR-618 mRNA相對表達量、血清腫瘤標志物水平比較 （±s）

組別n miR-618 mRNA AFP-L3/（μg/ml）AFP/（μg/ml）GPC3/（μg/ml）GP73/（μg/ml）高表達組低表達組t 值P 值39 26 0.89±0.23 0.63±0.34 3.682 0.000 73.62±11.25 113.29±12.03 13.547 0.000 56.69±6.37 86.92±8.02 16.886 0.000 8.03±2.21 13.03±4.19 6.272 0.000 76.32±19.92 110.35±21.09 63.591 0.000

2.4 低表達組和高表達組的TTP和MST比較

低表達組TTP 為（13.97±1.76）個月、MST 為（21.98±3.06）個月，高表達組TTP 為（25.13±2.25）個月、MST 為（34.06±4.19）個月，兩組TTP 和MST 比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=10.691 和28.280，P=0.001 和0.000）。見圖1、2。

圖1 血清miR-618 mRNA相對表達量高表達組和低表達組的TTP生存曲線

圖2 血清miR-618高表達組和低表達組的生存曲線

3 討論

我國PHC 患者多合并嚴重的肝硬化，肝功能不全，且惡性程度高、早期轉(zhuǎn)移率高，僅有20%左右的患者可接受以手術(shù)為主的綜合治療，故HIFU、TACE 等非手術(shù)綜合療法已成為大部分患者的主要治療方式，但難以完全清除體內(nèi)所有腫瘤，復發(fā)率較高，且預后不理想[9-12]。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展屬于一個分子調(diào)控失控過程，涉及諸多環(huán)節(jié)，包括抑癌基因失活、癌基因激活、細胞基質(zhì)間黏附障礙及細胞信號傳導異常等[13-14]。miRNA 廣泛存在于真核生物中，通過與目標mRNA 的3'-UTR 區(qū)結(jié)合，誘導目標mRNA 降解，調(diào)節(jié)靶基因蛋白和mRNA 表達，進而參與腫瘤細胞生物學過程[15-16]。miR-618 為miRNA 家族成員，已有研究證實miR-618 異常表達可誘發(fā)人類諸多惡性腫瘤及擴張性心肌病[17]。SHI 等[18]報道，胃癌組織中miR-618 表達比鄰近非癌組織中低，可見miR-618可能在胃癌中起到抑制腫瘤的作用，且可通過負調(diào)節(jié)TGF-β2轉(zhuǎn)錄水平來抑制胃癌細胞的遷移、侵襲能力。ROSSATO[19]等在一項關(guān)于miR-618 介導的表觀遺傳機制研究中報道，系統(tǒng)性硬化癥患者漿細胞樣樹突狀細胞中的miR-618 表達比健康對照者低，miR-618 可能是調(diào)節(jié)系統(tǒng)性硬化癥患者免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的重點靶點，且上調(diào)miR-618 表達可抑制PHC 的進展。IVANOVIC 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-618在轉(zhuǎn)移性雄激素非依賴性前列腺癌中呈低表達，且患者預后與miR-618 表達相關(guān)，敲低miR-618 表達可誘導上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，并促進前列腺癌細胞的侵襲及遷移。以上諸多研究證實，miR-618 可發(fā)揮一定的抑癌因子作用，但其在肝癌中是否發(fā)揮同樣作用及具體的機制尚未完全闡明。本研究采用qRT-PCR 檢測PHC 患者及健康體檢者血清miR-618 mRNA 相對表達量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病例組治療前血清miR-618 mRNA 相對表達量比健康組低，與上述研究結(jié)論基本一致，再次證實miR-618 可發(fā)揮抑癌作用。病例組治療后血清miR-618 mRNA相對表達量比治療前上升，表明HIFU 結(jié)合TACE 治療有助于上調(diào)miR-618 表達，進而抑制病情加重。

考慮到PHC 的發(fā)病率及病死率可能與患者的年齡、腫瘤直徑、性別等臨床特征有關(guān)，本研究檢測不同臨床病理特征PHC 患者miR-618 mRNA 相對表達量的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病例組患者血清miR-618 mRNA 相對表達量在不同性別、年齡、腫瘤直徑、Child-pugh 分級、是否伴有肝硬化及是否癌栓方面差異無統(tǒng)計學意義。谷士海等[21]研究發(fā)現(xiàn)，miR-618 在非小細胞肺癌組織中的表達與年齡、性別、組織類型無關(guān)，但與腫瘤大小有關(guān)，與本研究結(jié)論略有出入，可能原因與本研究納入樣本量較少、無法拉大差異等因素有關(guān)，故后期需擴大樣本量做進一步分析。本研究根據(jù)miR-618 mRNA相對表達量分為低表達組和高表達組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低表達組血清miR-618 mRNA 相對表達量比高表達組低，血清AFP-L3、AFP、GPC3、GP73 水平比高表達組高，TTP、MST 比高表達組短；Pearson 相關(guān)分析顯示，血清miR-618 mRNA 相對表達量與血清AFP-L3、AFP、GPC3、GP73 水平呈負相關(guān)；由此可見血清miR-618 mRNA 相對表達量與PHC 患者血清腫瘤標志物水平相關(guān)，且對預測治療后患者預后有一定的作用，推測miR-618 可作為預測治療效果及預后的生物學標志物，但具體機制仍需進一步探討。

綜上所述，miR-618 在PHC 中表達下調(diào)，其表達與血清腫瘤標志物水平及預后相關(guān)，可能成為PHC 治療及預后評估的新生物學標志物。