胃癌組織SOX1和β-catenin的表達及其與臨床病理特征、遠期預后的相關性*

李臘秀，王科，趙家寧，任博，劉月紅

（1.西安市第四醫(yī)院臨床檢驗中心，陜西西安710004；2.重慶市永川區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，重慶412060；3.西安市第四醫(yī)院輸血科，陜西西安710004；4.灃東新城公共衛(wèi)生管理中心，陜西西安710086）

胃癌是我國常見消化道惡性腫瘤之一，近年來的發(fā)病人數(shù)不斷增加且呈年輕化趨勢，但胃癌目前的早期診斷率較低、整體治療效果欠佳、預后情況較差[1-2]。多種參與癌細胞增殖、遷移、侵襲調(diào)控的基因均在胃癌組織中異常表達，但胃癌的具體發(fā)病機制仍未完全明確。性別決定區(qū)Y 框蛋白1（sex determining region Y-box 1,SOX1）是近年來新發(fā)現(xiàn)的具有抑癌作用的基因，在食管癌、宮頸癌、肝癌中被證實呈低表達及過度甲基化[3-5]。已有胃癌相關的細胞實驗證實，過表達SOX1 能夠抑制胃癌細胞的增殖、遷移及侵襲，且這一抑制作用與抑制β-連環(huán)蛋白（β-catenin）的表達、拮抗βcatenin 介導的促癌效應[6]。但SOX1 在胃癌中的表達及臨床病理意義均未明確。本研究擬探討胃癌組織中SOX1 和β-catenin 的表達及其與臨床病理特征、遠期預后的相關性，旨在闡明SOX1 靶向β-catenin在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年2月—2017年3月在西安市第四醫(yī)院接受胃癌根治術或姑息性切除術的患者64 例。其中，男性38 例，女性26 例；年齡33～69 歲，平均（46.23±7.72）歲。均經(jīng)術后病理診斷為胃癌，臨床病理資料完整，術前均未接受抗腫瘤治療。收集患者胃癌組織及距離腫瘤邊緣>5 cm的癌旁組織。

1.2 實驗試劑及儀器

SOX1、β-catenin 的單克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司，SP 二步法免疫組織化學試劑盒購自上海邦奕生物公司，RIPA 裂解液、BCA 試劑盒購自上海碧云天公司，正置顯微鏡購自日本Nikon 公司，凝膠成像儀購自美國Bio-Rad 公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學染色檢測SOX1和β-catenin 的表達取胃癌組織和癌旁組織，經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明浸蠟后進行包埋，得到蠟塊備用。將蠟塊制成4 μm 厚度的切片，用二步法SP 法免疫組織化學試劑盒進行染色，主要步驟為：二甲苯脫蠟、梯度酒精至水，3%過氧化氫孵育進行內(nèi)源性過氧化物酶滅活，抗原微波熱修復后一抗（SOX1、β-catenin 一抗的稀釋比例為1∶200）孵育4℃過夜，二抗、三抗孵育各1 h，DAB 顯色15 min 后蘇木精復染，脫水透明后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，SOX1 染色部位主要為細胞漿，β-catenin 染色部位主要為細胞核，參照王米娜[7]的研究評價染色強度及陽性細胞百分比。染色強度：無染色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分；陽性細胞百分比：無陽性細胞為0 分，陽性細胞<25%為1 分，25%～<50%為2 分，50%～<75%為3 分，≥75%為4 分。兩項評分相加，0～3 分為陰性、4～7 分為陽性。

1.3.2 Western blotting 檢測SOX1、β-catenin 蛋白相對表達量取胃癌組織和癌旁組織，采用RIPA 裂解液裂解組織，提取蛋白，采用BCA 法測定蛋白含量，取含有30 μg 蛋白的樣本加入SDS-PAGE 凝膠中，電泳后電轉移至硝酸纖維素膜（NC 膜），用5%脫脂牛奶室溫封閉NC 膜2 h 后加入1∶1 000 稀釋的SOX1、β-catenin 一抗或1∶5 000 稀釋的β-actin一抗（陰性對照），4℃孵育過夜；次日，TBS-T 溶液洗膜后室溫孵育1∶1 000 稀釋的HRP 二抗1 h，再次洗膜并在凝膠成像儀中曝光得到蛋白條帶，用Image J 軟件分析條帶灰度值，根據(jù)條帶灰度值計算SOX1、β-catenin 蛋白相對表達量。

1.3.3 遠期生存的隨訪隨訪截止日期為2019年10月31日，通過查詢門診或住院資料、電話回訪的方式進行生存情況隨訪。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，比較用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗；相關性分析采用Pearson法。繪制Kaplan-Meier 生存曲線，比較采用Log-rank χ2檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織及癌旁組織SOX1 和β-catenin 陽性表達率及蛋白相對表達量的比較

胃癌組織與癌旁組織SOX1 和β-catenin 陽性表達率比較，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），胃癌組織SOX1 陽性表達率低于癌旁組織，胃癌組織β-catenin 陽性表達率高于癌旁組織。胃癌組織與癌旁組織SOX1 和β-catenin 蛋白相對表達量比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），胃癌組織SOX1 蛋白相對表達量低于癌旁組織，胃癌組織β-catenin 蛋白相對表達量高于癌旁組織（見圖1、2 和表1）。胃癌組織SOX1 蛋白相對表達量與β-catenin 蛋白相對表達量呈負相關（r=-0.347，P=0.017）。

圖1 胃癌組織及癌旁組織SOX1和β-catenin的表達（免疫組織化學×400）

圖2 胃癌組織及癌旁組織SOX1和β-catenin的蛋白表達

表1 胃癌組織及癌旁組織SOX1和β-catenin陽性表達率及蛋白相對表達量的比較

2.2 不同臨床病理特征胃癌組織SOX1 和βcatenin陽性表達率的比較

不同腫瘤直徑的胃癌組織SOX1 和β-catenin 陽性表達率的比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。不同分化程度、TNM 分期、淋巴結轉移的胃癌組織SOX1陽性表達率的比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；低分化，TNM Ⅲ、Ⅳ期，有淋巴結轉移胃癌組織SOX1的陽性表達率低于中、高分化，TNM Ⅰ、Ⅱ期，無淋巴結轉移胃癌組織。不同分化程度、TNM 分期、淋巴結轉移的胃癌組織β-catenin 陽性表達率的比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；低分化，TNM Ⅲ、Ⅳ期，有淋巴結轉移胃癌組織β-catenin 的陽性表達率高于中、高分化，TNMⅠ、Ⅱ期，無淋巴結轉移胃癌組織。見表2。

表2 不同臨床病理特征胃癌組織SOX1和β-catenin陽性表達率的比較 例（%）

2.3 SOX1 和β-catenin 陽性表達、陰性表達患者總生存期的比較

SOX1 陰性表達患者與SOX1 陽性表達患者的總生存期比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.079，P=0.043），SOX1 陽性表達患者的總生存期延長；β-catenin 陰性表達患者與β-catenin陽性表達患者的總生存期比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.332，P=0.021），β-catenin 陽性表達患者的總生存期縮短。見圖3、4。

圖3 SOX1陰性表達與陽性表達患者的生存曲線

圖4 β-catenin陰性表達與陽性表達患者的生存曲線

3 討論

癌細胞過度的增殖、遷移、侵襲是胃癌重要的惡性生物學特征，多因素、多基因參與胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲的調(diào)控。β-catenin 是經(jīng)典Wnt 通路中重要的信號蛋白，也是目前已知重要的促癌蛋白，在包括胃癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤組織中均呈顯著高表達的趨勢[8-10]。β-catenin 在細胞核中能夠啟動CyclinD1、c-myc、MMP-2等基因的表達，促進癌細胞的增殖、遷移、侵襲，進而參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本研究對胃癌組織β-catenin 的分析顯示，胃癌組織β-catenin 的陽性表達率高于癌旁組織，且與分化程度、TNM 分期、淋巴結轉移有關，說明βcatenin的高表達與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關。

β-catenin 在惡性腫瘤中表達增多的機制復雜，其中SOX1可能是β-catenin的負性調(diào)控分子。研究證實[6]，過表達SOX1 能夠通過降低β-catenin 的表達來抑制癌細胞的增殖、遷移、侵襲；另有乳腺癌及鼻咽癌相關的細胞實驗也證實SOX1能夠抑制β-catenin的表達[11-12]。SOX1 介導的抑癌作用在近些年受到越來越多的關注，多項研究已經(jīng)證實SOX1表達降低及過度甲基化與食管癌、宮頸癌、肝癌的發(fā)病有關[3-5]。本研究在既往關于SOX1研究的基礎上探討胃癌組織SOX1表達的變化：胃癌組織SOX1的陽性表達率較癌旁組織降低，且與分化程度、TNM 分期、淋巴結轉移有關，說明SOX1 的低表達與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關。進一步通過相關性分析發(fā)現(xiàn)：胃癌組織SOX1 蛋白相對表達量與β-catenin 蛋白相對表達量呈負相關，結合SOX1 在離體胃癌細胞中對βcatenin 表達的抑制作用[6]推測，胃癌組織中低表達的SOX1 可能增加β-catenin 的表達并促進了胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

目前胃癌患者的整體預后情況較差，手術后的生存率較低，TNM 分期、腫瘤分化程度、淋巴結轉移、幽門螺桿菌感染、原癌基因及抑癌基因表達異常均是影響胃癌患者預后及遠期生存的相關因素[13-14]。本研究中，在明確SOX1 低表達及β-catenin低表達與胃癌發(fā)生及臨床病理特征惡化的關系后，進一步對患者的總生存時間進行隨訪，并比較SOX1和β-catenin 陽性表達、陰性表達患者總生存時間的差異，結果顯示：與SOX1 陰性表達患者比較，SOX1 陽性表達患者的總生存期延長；與β-catenin陰性表達患者比較，β-catenin 陽性表達患者的總生存期縮短。這說明SOX1 低表達及β-catenin 高表達會使胃癌患者的總生存期縮短，與SOX1 低表達及β-catenin 高表達參與胃癌發(fā)生、臨床病理特征惡化的分析結果一致。

綜上所述，胃癌組織SOX1 的低表達與β-catenin的高表達有關，且與臨床病理特征、遠期預后的惡化相關，未來SOX1可能成為研究胃癌診療手段的新靶點。