李臘秀,王科,趙家寧,任博,劉月紅
(1.西安市第四醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心,陜西西安710004;2.重慶市永川區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,重慶412060;3.西安市第四醫(yī)院輸血科,陜西西安710004;4.灃東新城公共衛(wèi)生管理中心,陜西西安710086)
胃癌是我國常見消化道惡性腫瘤之一,近年來的發(fā)病人數(shù)不斷增加且呈年輕化趨勢,但胃癌目前的早期診斷率較低、整體治療效果欠佳、預(yù)后情況較差[1-2]。多種參與癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲調(diào)控的基因均在胃癌組織中異常表達(dá),但胃癌的具體發(fā)病機(jī)制仍未完全明確。性別決定區(qū)Y 框蛋白1(sex determining region Y-box 1,SOX1)是近年來新發(fā)現(xiàn)的具有抑癌作用的基因,在食管癌、宮頸癌、肝癌中被證實(shí)呈低表達(dá)及過度甲基化[3-5]。已有胃癌相關(guān)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí),過表達(dá)SOX1 能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲,且這一抑制作用與抑制β-連環(huán)蛋白(β-catenin)的表達(dá)、拮抗βcatenin 介導(dǎo)的促癌效應(yīng)[6]。但SOX1 在胃癌中的表達(dá)及臨床病理意義均未明確。本研究擬探討胃癌組織中SOX1 和β-catenin 的表達(dá)及其與臨床病理特征、遠(yuǎn)期預(yù)后的相關(guān)性,旨在闡明SOX1 靶向β-catenin在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。
選取2015年2月—2017年3月在西安市第四醫(yī)院接受胃癌根治術(shù)或姑息性切除術(shù)的患者64 例。其中,男性38 例,女性26 例;年齡33~69 歲,平均(46.23±7.72)歲。均經(jīng)術(shù)后病理診斷為胃癌,臨床病理資料完整,術(shù)前均未接受抗腫瘤治療。收集患者胃癌組織及距離腫瘤邊緣>5 cm的癌旁組織。
SOX1、β-catenin 的單克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司,SP 二步法免疫組織化學(xué)試劑盒購自上海邦奕生物公司,RIPA 裂解液、BCA 試劑盒購自上海碧云天公司,正置顯微鏡購自日本Nikon 公司,凝膠成像儀購自美國Bio-Rad 公司。
1.3.1 免疫組織化學(xué)染色檢測SOX1和β-catenin 的表達(dá)取胃癌組織和癌旁組織,經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明浸蠟后進(jìn)行包埋,得到蠟塊備用。將蠟塊制成4 μm 厚度的切片,用二步法SP 法免疫組織化學(xué)試劑盒進(jìn)行染色,主要步驟為:二甲苯脫蠟、梯度酒精至水,3%過氧化氫孵育進(jìn)行內(nèi)源性過氧化物酶滅活,抗原微波熱修復(fù)后一抗(SOX1、β-catenin 一抗的稀釋比例為1∶200)孵育4℃過夜,二抗、三抗孵育各1 h,DAB 顯色15 min 后蘇木精復(fù)染,脫水透明后中性樹膠封片,顯微鏡下觀察,SOX1 染色部位主要為細(xì)胞漿,β-catenin 染色部位主要為細(xì)胞核,參照王米娜[7]的研究評價(jià)染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞百分比。染色強(qiáng)度:無染色為0 分,淡黃色為1 分,棕黃色為2 分,棕褐色為3 分;陽性細(xì)胞百分比:無陽性細(xì)胞為0 分,陽性細(xì)胞<25%為1 分,25%~<50%為2 分,50%~<75%為3 分,≥75%為4 分。兩項(xiàng)評分相加,0~3 分為陰性、4~7 分為陽性。
1.3.2 Western blotting 檢測SOX1、β-catenin 蛋白相對表達(dá)量取胃癌組織和癌旁組織,采用RIPA 裂解液裂解組織,提取蛋白,采用BCA 法測定蛋白含量,取含有30 μg 蛋白的樣本加入SDS-PAGE 凝膠中,電泳后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC 膜),用5%脫脂牛奶室溫封閉NC 膜2 h 后加入1∶1 000 稀釋的SOX1、β-catenin 一抗或1∶5 000 稀釋的β-actin一抗(陰性對照),4℃孵育過夜;次日,TBS-T 溶液洗膜后室溫孵育1∶1 000 稀釋的HRP 二抗1 h,再次洗膜并在凝膠成像儀中曝光得到蛋白條帶,用Image J 軟件分析條帶灰度值,根據(jù)條帶灰度值計(jì)算SOX1、β-catenin 蛋白相對表達(dá)量。
1.3.3 遠(yuǎn)期生存的隨訪隨訪截止日期為2019年10月31日,通過查詢門診或住院資料、電話回訪的方式進(jìn)行生存情況隨訪。
數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,比較用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,比較用χ2檢驗(yàn);相關(guān)性分析采用Pearson法。繪制Kaplan-Meier 生存曲線,比較采用Log-rank χ2檢驗(yàn);P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
胃癌組織與癌旁組織SOX1 和β-catenin 陽性表達(dá)率比較,經(jīng)χ2檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),胃癌組織SOX1 陽性表達(dá)率低于癌旁組織,胃癌組織β-catenin 陽性表達(dá)率高于癌旁組織。胃癌組織與癌旁組織SOX1 和β-catenin 蛋白相對表達(dá)量比較,經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),胃癌組織SOX1 蛋白相對表達(dá)量低于癌旁組織,胃癌組織β-catenin 蛋白相對表達(dá)量高于癌旁組織(見圖1、2 和表1)。胃癌組織SOX1 蛋白相對表達(dá)量與β-catenin 蛋白相對表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.347,P=0.017)。
圖1 胃癌組織及癌旁組織SOX1和β-catenin的表達(dá)(免疫組織化學(xué)×400)
圖2 胃癌組織及癌旁組織SOX1和β-catenin的蛋白表達(dá)
表1 胃癌組織及癌旁組織SOX1和β-catenin陽性表達(dá)率及蛋白相對表達(dá)量的比較
不同腫瘤直徑的胃癌組織SOX1 和β-catenin 陽性表達(dá)率的比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織SOX1陽性表達(dá)率的比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);低分化,TNM Ⅲ、Ⅳ期,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織SOX1的陽性表達(dá)率低于中、高分化,TNM Ⅰ、Ⅱ期,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織。不同分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織β-catenin 陽性表達(dá)率的比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);低分化,TNM Ⅲ、Ⅳ期,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織β-catenin 的陽性表達(dá)率高于中、高分化,TNMⅠ、Ⅱ期,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織。見表2。
表2 不同臨床病理特征胃癌組織SOX1和β-catenin陽性表達(dá)率的比較 例(%)
SOX1 陰性表達(dá)患者與SOX1 陽性表達(dá)患者的總生存期比較,經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.079,P=0.043),SOX1 陽性表達(dá)患者的總生存期延長;β-catenin 陰性表達(dá)患者與β-catenin陽性表達(dá)患者的總生存期比較,經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.332,P=0.021),β-catenin 陽性表達(dá)患者的總生存期縮短。見圖3、4。
圖3 SOX1陰性表達(dá)與陽性表達(dá)患者的生存曲線
圖4 β-catenin陰性表達(dá)與陽性表達(dá)患者的生存曲線
癌細(xì)胞過度的增殖、遷移、侵襲是胃癌重要的惡性生物學(xué)特征,多因素、多基因參與胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲的調(diào)控。β-catenin 是經(jīng)典Wnt 通路中重要的信號蛋白,也是目前已知重要的促癌蛋白,在包括胃癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤組織中均呈顯著高表達(dá)的趨勢[8-10]。β-catenin 在細(xì)胞核中能夠啟動CyclinD1、c-myc、MMP-2等基因的表達(dá),促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲,進(jìn)而參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本研究對胃癌組織β-catenin 的分析顯示,胃癌組織β-catenin 的陽性表達(dá)率高于癌旁組織,且與分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),說明βcatenin的高表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。
β-catenin 在惡性腫瘤中表達(dá)增多的機(jī)制復(fù)雜,其中SOX1可能是β-catenin的負(fù)性調(diào)控分子。研究證實(shí)[6],過表達(dá)SOX1 能夠通過降低β-catenin 的表達(dá)來抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲;另有乳腺癌及鼻咽癌相關(guān)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證實(shí)SOX1能夠抑制β-catenin的表達(dá)[11-12]。SOX1 介導(dǎo)的抑癌作用在近些年受到越來越多的關(guān)注,多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)SOX1表達(dá)降低及過度甲基化與食管癌、宮頸癌、肝癌的發(fā)病有關(guān)[3-5]。本研究在既往關(guān)于SOX1研究的基礎(chǔ)上探討胃癌組織SOX1表達(dá)的變化:胃癌組織SOX1的陽性表達(dá)率較癌旁組織降低,且與分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),說明SOX1 的低表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。進(jìn)一步通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn):胃癌組織SOX1 蛋白相對表達(dá)量與β-catenin 蛋白相對表達(dá)量呈負(fù)相關(guān),結(jié)合SOX1 在離體胃癌細(xì)胞中對βcatenin 表達(dá)的抑制作用[6]推測,胃癌組織中低表達(dá)的SOX1 可能增加β-catenin 的表達(dá)并促進(jìn)了胃癌的發(fā)生、發(fā)展。
目前胃癌患者的整體預(yù)后情況較差,手術(shù)后的生存率較低,TNM 分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、幽門螺桿菌感染、原癌基因及抑癌基因表達(dá)異常均是影響胃癌患者預(yù)后及遠(yuǎn)期生存的相關(guān)因素[13-14]。本研究中,在明確SOX1 低表達(dá)及β-catenin低表達(dá)與胃癌發(fā)生及臨床病理特征惡化的關(guān)系后,進(jìn)一步對患者的總生存時(shí)間進(jìn)行隨訪,并比較SOX1和β-catenin 陽性表達(dá)、陰性表達(dá)患者總生存時(shí)間的差異,結(jié)果顯示:與SOX1 陰性表達(dá)患者比較,SOX1 陽性表達(dá)患者的總生存期延長;與β-catenin陰性表達(dá)患者比較,β-catenin 陽性表達(dá)患者的總生存期縮短。這說明SOX1 低表達(dá)及β-catenin 高表達(dá)會使胃癌患者的總生存期縮短,與SOX1 低表達(dá)及β-catenin 高表達(dá)參與胃癌發(fā)生、臨床病理特征惡化的分析結(jié)果一致。
綜上所述,胃癌組織SOX1 的低表達(dá)與β-catenin的高表達(dá)有關(guān),且與臨床病理特征、遠(yuǎn)期預(yù)后的惡化相關(guān),未來SOX1可能成為研究胃癌診療手段的新靶點(diǎn)。