幽門螺桿菌通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲及血管新生因子的作用研究*

趙越，馮菲，王軍，勾熙，舒小闖，蒲柯，彭宇奎，王玉平

（蘭州大學(xué)第一醫(yī)院1.消化科，2.超聲醫(yī)學(xué)科，甘肅蘭州730020）

胃癌是我國常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率不斷升高，發(fā)病人群呈年輕化趨勢[1]。胃癌的發(fā)生涉及多因素、多環(huán)節(jié)、多基因，但具體機(jī)制并未完全闡明。幽門螺桿菌（helicobacter pylori,Hp）感染是引起胃癌的危險(xiǎn)因素之一。Hp 感染后能夠引起宿主細(xì)胞中癌基因的表達(dá)，信號(hào)通路激活發(fā)生改變，進(jìn)而引起細(xì)胞異常增殖、遷移、侵襲及血管新生[2-4]。Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)通路是與胃癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的信號(hào)通路，上游信號(hào)分子Wnt3 及下游信號(hào)分子β-catenin 的表達(dá)在胃癌組織中升高，表達(dá)升高的β-catenin 進(jìn)入細(xì)胞核后能夠調(diào)節(jié)多種侵襲基因表達(dá)，生成血管新生分子，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲、血管新生。有研究報(bào)道，Hp 感染能夠促進(jìn)胃黏膜上皮GES-1 細(xì)胞中Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的激活[5]。但Hp 感染是否直接促進(jìn)胃癌細(xì)胞中Wnt/βcatenin 信號(hào)通路的激活以及是否通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞侵襲、血管新生均未闡明。為此，本實(shí)驗(yàn)將以胃癌細(xì)胞株SGC-7901 為對(duì)象，具體分析Hp通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲及血管新生能力的調(diào)節(jié)作用。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床樣本及分組收集2015年5月—2018年12月在蘭州大學(xué)第一醫(yī)院手術(shù)切除的胃癌蠟塊樣本84例，根據(jù)Hp感染情況分為Hp陰性胃癌組織45 例及Hp陽性胃癌組織39 例。

1.1.2 細(xì)胞胃癌細(xì)胞株SGC-7901 購自南京科佰生物科技有限公司。

1.1.3 HpHp 標(biāo)準(zhǔn)菌株購自北京NTCC 中國質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心。

1.1.4 試劑石蠟包埋組織切片總RNA 提取試劑盒、cDNA 第一鏈合成預(yù)混試劑盒、Talent 熒光定量檢測試劑盒購自北京天根公司，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路抑制劑ICG-001、結(jié)晶紫購自美國Sigma 公司，RIPA 裂解液購自上海碧云天公司，兔來源Wnt1、Wnt3a、β-catenin、基質(zhì)金屬蛋白酶7（MMP-7）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、E-鈣黏蛋白（Ecadherin）的單克隆一抗購自美國Abcam 公司，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、血管生成素-2（Ang-2）的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒購自上海西唐公司。

1.1.5 儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo 公司，顯微鏡購自日本Nikon 公司，凝膠成像儀購自美國Bio-rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 胃癌組織中目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的檢測取胃癌蠟塊標(biāo)本，采用石蠟包埋組織切片總RNA 提取試劑盒分離RNA，采用cDNA 第一鏈合成預(yù)混試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用Talent 熒光定量檢測試劑盒對(duì)cDNA 中的目的基因Wnt1、Wnt3a、β-catenin、MMP-7、N-cadherin、E-cadherin、VEGF、bFGF、Ang-2及內(nèi)參基因β-actin進(jìn)行PCR 反應(yīng)，得到反應(yīng)曲線及循環(huán)閾值，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算目的基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 Hp培養(yǎng)基菌體提取物制備將Hp菌株接種在含有10%胎牛血清的布氏肉湯培養(yǎng)基中，在微需氧、37℃環(huán)境下培養(yǎng)48 h，離心收集細(xì)菌后用磷酸鹽緩沖溶液重懸，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及處理SGC-7901 細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)，細(xì)胞鋪滿底面80%后用0.25%胰蛋白酶消化并傳代，傳代細(xì)胞接種在培養(yǎng)板中并分組處理。對(duì)照組用不含細(xì)菌及藥物的DMEM 處理，連續(xù)處理24 h；Hp組加入感染復(fù)數(shù)100∶1的Hp 菌液進(jìn)行處理，連續(xù)處理24 h；Hp+ICG-001 組預(yù)先用含有4 μmol/L ICG-001 的DMEM 處理12 h，而后再加入感染復(fù)數(shù)100∶1 的Hp 菌液并繼續(xù)處理24 h。

1.2.4 Western blotting 檢測采用RIPA 裂解液裂解分組處理后的細(xì)胞，提取蛋白后進(jìn)行Western blotting 檢測。測定蛋白含量后取30 μg 蛋白樣本加入聚丙烯酰胺凝膠中，電泳后電轉(zhuǎn)移至NC 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h 后4℃孵育Wnt1、Wnt3a、β-catenin、MMP-7、N-cadherin、E-cadherin 的單克隆一抗過夜；第2 天室溫孵育HRP 二抗1 h，最后在凝膠成像儀中顯影得到蛋白條帶，根據(jù)條帶的灰度值計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 Transwell 檢測細(xì)胞侵襲活力在預(yù)涂基質(zhì)膠的Transwell 小室中檢測細(xì)胞侵襲活力，在上層小室內(nèi)接種細(xì)胞并按分組方法進(jìn)行處理，在下層小室內(nèi)加入含有10%胎牛血清的DMEM 誘導(dǎo)細(xì)胞侵襲。分組處理24 h 后，取出小室，用棉簽擦未侵襲的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色后在顯微鏡的高倍視野下觀察侵襲細(xì)胞數(shù)目。

1.2.6 血管新生分子含量的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測分組處理后細(xì)胞培養(yǎng)基中血管新生分子VEGF、bFGF、Ang-2 的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hp 陰性和Hp 陽性胃癌組織中目的基因相對(duì)表達(dá)量的比較

與Hp 陰性胃癌組織比較，Hp 陽性胃癌組織中Wnt1、Wnt3a、β-catenin、MMP-7、N-cadherin、VEGF、bFGF、Ang-2 的mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高（P<0.05），E-cadherin mRNA 的相對(duì)表達(dá)量降低（P<0.05）。見表1。

表1 Hp陰性和陽性胃癌組織中目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

表1 Hp陰性和陽性胃癌組織中目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

組別Wnt1 mRNA Wnt3a mRNA β-catenin mRNA MMP-7 mRNA N-cadherin mRNA E-cadherin mRNA VEGF mRNA bFGF mRNA Ang-2 mRNA Hp陰性胃癌組織Hp陽性胃癌組織t 值P 值0.73±0.15 1.32±0.24 13.697 0.000 0.69±0.12 1.29±0.34 11.077 0.000 0.81±0.19 1.24±0.28 8.134 0.000 0.75±0.13 1.38±0.31 12.438 0.000 0.66±0.19 1.40±0.35 12.258 0.000 1.31±0.41 0.79±0.24 7.206 0.000 0.59±0.09 1.49±0.52 11.424 0.000 0.65±0.08 1.43±0.34 14.932 0.000 0.82±0.18 1.27±0.33 7.896 0.000

2.2 Hp 對(duì)SGC-7901 細(xì)胞中Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的影響

3 組SGC-7901 細(xì)胞中Wnt1、Wnt3a、β-catenin 蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.615、9.283 和7.953，均P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較t檢驗(yàn)，Hp組SGC-7901細(xì)胞中Wnt1、Wnt3a、β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組明顯增加（P<0.05）；Hp+ICG-001組SGC-7901 細(xì)胞中Wnt1、Wnt3a、β-catenin 蛋白相對(duì)表達(dá)量較Hp組明顯減少（P<0.05）。見表2和圖1。

圖1 3組Wnt1、Wnt3a、β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

表2 3組細(xì)胞中Wnt1、Wnt3a、β-catenin相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

表2 3組細(xì)胞中Wnt1、Wnt3a、β-catenin相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與Hp組比較，P<0.05。

組別β-catenin蛋白Wnt1蛋白Wnt3a蛋白對(duì)照組Hp組Hp+ICG-001組F 值P 值1.19±0.32 1.84±0.52①1.33±0.36②7.953 0.000 1.20±0.27 1.82±0.34①1.24±0.32②7.615 0.000 1.23±0.35 2.03±0.52①1.44±0.41②9.283 0.000

2.3 Hp 通過Wnt/β-catenin 信號(hào)通路增強(qiáng)SGC-7901細(xì)胞的侵襲活力

對(duì)照組SGC-7901 細(xì)胞侵襲數(shù)目為（24.10±6.59），Hp 組為（71.93±11.58），Hp+ICG-001 組為（34.12±9.39），3 組比較經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.474，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較t檢驗(yàn)，Hp組SGC-7901 細(xì)胞的侵襲數(shù)目較對(duì)照組明顯增加（P<0.05）；Hp+ICG-001 組SGC-7901 細(xì)胞的侵襲數(shù)目較Hp組明顯減少（P<0.05）。見圖2。

圖2 3組細(xì)胞的結(jié)晶紫染色結(jié)果（A）及侵襲活力比較(B)

2.4 Hp 通過Wnt/β-catenin 信號(hào)通路增加SGC-7901細(xì)胞中MMP-7、N-cadherin、E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 組SGC-7901 細(xì)胞中MMP-7、N-cadherin、Ecadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=16.585、16.585 和14.557，均P=0.000）。經(jīng)LSD-t法兩兩比較，Hp 組SGC-7901 細(xì)胞中MMP7、N-cadherin 蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組增加（P<0.05），E-cadherin 蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組減少（P<0.05）；Hp+ICG-001組SGC-7901 細(xì)胞中MMP-7、N-cadherin 蛋白相對(duì)表達(dá)量較Hp組減少（P<0.05），E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量較Hp組增加（P<0.05）。見表3和圖3。

圖3 3組細(xì)胞MMP-7、N-cadherin、E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

表3 3組細(xì)胞MMP-7、N-cadherin、E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

表3 3組細(xì)胞MMP-7、N-cadherin、E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與Hp組比較，P<0.05。

組別E-cadherin蛋白MMP-7蛋白N-cadherin蛋白對(duì)照組Hp組Hp+ICG-001組F 值P 值1.21±0.32 0.36±0.09①1.02±0.20②14.557 0.000 0.23±0.08 0.83±0.19①0.45±0.09②16.585 0.000 0.32±0.07 0.91±0.21①0.28±0.06②13.018 0.000

2.5 Hp 通過Wnt/β-catenin 信號(hào)通路增加SGC-7901細(xì)胞中血管新生因子的生成

3 組SGC-7901 細(xì)胞培養(yǎng)基中VEGF、bFGF、Ang-2 含量的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.737、9.283 和11.384，均P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較t檢驗(yàn)，Hp 組SGC-7901 細(xì)胞培養(yǎng)基中VEGF、bFGF、Ang-2的含量較對(duì)照組增加（P<0.05）；Hp+ICG-001組SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)基中VEGF、bFGF、Ang-2的含量較Hp組減少（P<0.05）。見表4和圖4。

圖4 3組細(xì)胞培養(yǎng)基中VEGF、bFGF、Ang-2含量的比較

表4 3組細(xì)胞培養(yǎng)基中VEGF、bFGF、Ang-2含量的比較 （±s）

表4 3組細(xì)胞培養(yǎng)基中VEGF、bFGF、Ang-2含量的比較 （±s）

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與Hp組比較，P<0.05。

組別Ang-2/（ng/ml）VEGF/（ng/ml）bFGF/（pg/ml）對(duì)照組Hp組Hp+ICG-001組F 值P 值1.01±0.23 2.65±0.62①1.72±0.36②11.384 0.000 1.33±0.29 4.23±0.92①1.94±0.45②13.737 0.000 16.69±3.25 42.39±8.79①27.67±7.14②9.283 0.000

3 討論

Wnt/β-catenin 信號(hào)通路是與多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的信號(hào)通路，Wnt1、Wnt3a 是該信號(hào)通路經(jīng)典的上游信號(hào)分子，高表達(dá)的Wnt1、Wnt3a 與膜受體Lrp5/6 結(jié)合后使細(xì)胞內(nèi)的GSK-3β發(fā)生磷酸化，磷酸化的GSK-3β 失去水解β-catenin的活性，進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)β-catenin 增多并不斷向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，進(jìn)入細(xì)胞核的β-catenin 能夠調(diào)節(jié)多種癌基因的表達(dá)并引起細(xì)胞的惡變[6-8]。胃癌與Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的關(guān)系也被多項(xiàng)研究證實(shí)[9-10]，但胃癌組織中該通路發(fā)生激活的機(jī)制尚未完全明確。

Hp 感染是目前已知與胃癌發(fā)生密切相關(guān)的危險(xiǎn)因素，Hp 感染胃黏膜上皮細(xì)胞后，細(xì)胞中多種基因的表達(dá)發(fā)生改變，進(jìn)而可造成相應(yīng)細(xì)胞學(xué)行為的變化[4,11]。吳鶯等[5]以人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1為對(duì)象的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Hp 感染GES-1 細(xì)胞后，細(xì)胞中β-catenin 的表達(dá)明顯增多，提示Hp 感染與Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的激活有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)首先分析胃癌組織中Hp 感染與Wnt/β-catenin 信號(hào)通路激活的關(guān)系， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hp 陽性胃癌組織中Wnt1、Wnt3a、β-catenin 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯高于Hp 陰性胃癌組織。在該基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)以胃癌SGC-7901 細(xì)胞為對(duì)象，用Hp感染后觀察Wnt/βcatenin 信號(hào)通路的變化。本實(shí)驗(yàn)的觀察結(jié)果顯示：Hp 感染后細(xì)胞中Wnt1、Wnt3a 及β-catenin 蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯增加，說明Hp 感染能夠激活胃癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路也可能是Hp 感染參與胃癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制。

為進(jìn)一步驗(yàn)證Hp 感染是否通過激活Wnt/βcatenin 信號(hào)通路參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展，本實(shí)驗(yàn)在Hp 感染的基礎(chǔ)上加用Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的抑制劑ICG-001 并觀察細(xì)胞侵襲、血管新生能力的變化。Hp 感染后，細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯增多；而在加用ICG-001 后，Hp 感染增加細(xì)胞侵襲數(shù)目的效應(yīng)明顯減弱，說明Hp 感染通過激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲。已有研究報(bào)道，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路激活后能夠增加下游MMP-7、N-cadherin 的表達(dá)，同時(shí)抑制E-cadherin 的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的水解及細(xì)胞上皮間質(zhì)的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲能力[13-14]。本實(shí)驗(yàn)通過檢測上述蛋白表達(dá)的變化來進(jìn)一步驗(yàn)證Hp 感染調(diào)控胃癌細(xì)胞侵襲的作用及機(jī)制可知：Hp 感染后，細(xì)胞中MMP-7、N-cadherin 蛋白相對(duì)表達(dá)量增加，Ecadherin 的相對(duì)表達(dá)量減少；而在加用ICG-001 后，Hp 感染調(diào)節(jié)上述蛋白表達(dá)的作用減弱，這一結(jié)果與細(xì)胞侵襲數(shù)目的變化結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了Hp 感染通過激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲的作用。

腫瘤血管新生是胃癌局部病灶內(nèi)重要的惡性生物學(xué)行為之一，同時(shí)也是癌細(xì)胞增殖、侵襲的重要病理基礎(chǔ)。Wnt/β-catenin 信號(hào)通路所調(diào)控的VEGF、bFGF、Ang-2 與血管新生密切相關(guān)，能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管樣結(jié)構(gòu)的形成。已有研究報(bào)道，胃癌患者血清中VEGF、bFGF、Ang-2的含量均明顯增多[14-16]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)血管新生因子的觀察發(fā)現(xiàn)：Hp 感染后，細(xì)胞培養(yǎng)基中VEGF、bFGF、Ang-2 的含量增加；而在加用ICG-001 后，Hp 感染增強(qiáng)VEGF、bFGF、Ang-2 生成的作用減弱，Hp感染通過激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞中血管新生因子的生成、增強(qiáng)細(xì)胞的血管新生能力。

綜上所述，Hp 能夠激活胃癌細(xì)胞中Wnt/βcatenin 信號(hào)通路并增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲能力、血管新生能力。激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路是Hp 感染增強(qiáng)胃癌細(xì)胞侵襲及血管新生能力的分子機(jī)制之一。