纈沙坦對大鼠急性肝衰竭的保護作用及其機制研究

李建州 劉小靜 葉 峰 李曉青

1.西安交通大學第一附屬醫(yī)院感染科，陜西西安 710061；2.西安交通大學第一附屬醫(yī)院急診科，陜西西安 710061

急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）表現(xiàn)為在短時間內(nèi)發(fā)生大量肝細胞壞死，病情進展迅速，病死率高，發(fā)病機制尚不十分清楚[1]。大量研究表明，腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）不僅能夠維持血壓和體液平衡，還能夠調(diào)節(jié)炎癥、凋亡和纖維化等病理過程，與各種肝病的發(fā)生發(fā)展密切相關[2-3]。RAS 阻斷劑的應用可為肝臟疾病的治療提供新思路，但目前關于其在肝衰竭中的研究報道甚少。本研究通過D-氨基半乳糖（DGalN）/脂多糖（LPS）聯(lián)合腹腔注射誘導大鼠急性肝衰竭模型，采用纈沙坦進行干預，探討纈沙坦對急性肝衰竭的保護作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

購買180～200 g 的清潔級雄性SD 大鼠60 只，遼寧長生生物技術有限公司，合格證號：2107262001001 67346；生產(chǎn)許可證號：（遼）SCXK2020-0001。飼養(yǎng)及實驗過程嚴格遵守實驗動物倫理相關規(guī)定。所有實驗動物于20～25℃室溫飼養(yǎng)1 周后進行實驗，實驗前禁食12 h。

1.2 主要試劑

D-GalN（貨號：G0500）與LPS（貨號：L2630）購自美國Sigma-Aldrich 公司。纈沙坦（貨號：V129241）購自上海阿拉丁生化科技有限公司。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ，貨號：E-EL-R1430c）、血管緊張素1-7（Ang 1-7，貨號：E-EL-R1138c）、腫瘤壞死因子α（TNF-α，貨號：E-EL-R2856c）、白細胞介素-6（IL-6，貨號：EEL-R0015c）酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒，CD68 抗體（貨號：22225-1-AP），抗髓過氧化物酶（MPO）抗體（貨號：28058-1-AP）均購自武漢三鷹生物技術有限公司。RNA 提取試劑（貨號：252250AX）、熒光定量PCR 試劑盒（貨號：ET105-01）均購自北京天根生化科技有限公司。CHOP（貨號：15204-1-AP）、GRP78（貨號：11587-1-AP）一抗均購自上海艾博抗貿(mào)易有限公司，辣根過氧化物酶標記二抗（貨號：BA1051）購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.3 實驗分組及處理方法

采用隨機數(shù)字表法將實驗動物分為正常對照組、肝衰竭組、纈沙坦組，每組各20 只。纈沙坦組腹腔注射纈沙坦（25 mg/kg），30 min 后腹腔注射D-GalN（0.8 g/kg）/LPS（20 μg/kg）；肝衰竭組腹腔注射等量生理鹽水，30 min 后腹腔注射D-GalN（0.8 g/kg）/LPS（20 μg/kg）；正常對照組腹腔注射等量生理鹽水，30 min后再次注射等量生理鹽水。造模10 h 后每組隨機取10 只大鼠統(tǒng)一處死，采血并分離血清，同時留取肝臟組織，凍存?zhèn)錂z。繼續(xù)觀察剩余大鼠并記錄其存活時間。

1.4 觀察指標及檢測方法

1.4.1 生化指標及炎癥因子的檢測 采用生化分析儀（Rayto，Chemray 240）檢測大鼠血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平。酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測大鼠血清或肝組織中TNF-α、IL-6、AngⅡ、Ang 1-7水平。

1.4.2 HE 染色 留取肝臟組織于10%甲醛溶液中固定，按常規(guī)步驟進行石蠟包埋、切片、HE 染色，于光學顯微鏡下觀察肝臟病理變化。

1.4.3 免疫組化檢測炎癥細胞浸潤 取石蠟包埋的大鼠肝臟標本，按常規(guī)步驟，經(jīng)切片脫蠟、抗原修復、封閉、加MPO（1∶100 稀釋）或CD68（1∶100 稀釋）一抗、二抗（1∶10 000 稀釋）、顯色、蘇木精復染、脫水、封片等步驟，最后在光學顯微鏡下觀察，采集圖像，藍色為細胞核，棕褐色為目標蛋白。

1.4.4 熒光定量PCR 檢測 采用Trizol 法提取肝臟組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，應用ABI 7500 熒光定量PCR 儀（型號：QuantStudio 6）進行反應，反應體系為cDNA 4 μL，上下游引物各0.4 μL，qPCR 預混液10 μL、超純水5.2 μL。反應條件為50℃2 min，95℃10 min，95℃30 s，60℃30 s，40 循環(huán)，以2-△△Ct進行分析。β-actin 正向引物為5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’，反向引物為5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’，擴增條帶為240 bp。GRP78正向引物為5’-ACGACCCCTGACAAAAGACA-3’，反向引物為5’-GTCAGGCGGTTTTGGTCATT-3’，擴增條帶為195 bp。CHOP 正向引物為5’-CCCCAGGAAACGAAGAGGAA-3’，反向引物為5’-CGCACTGACCACTCTGTTTC-3’，擴增條帶為210 bp。

1.4.5 Western blot 蛋白印跡分析 每組隨機選取5 只處死大鼠留取的肝臟組織標本，按常規(guī)步驟提取總蛋白、測定蛋白濃度，后進行SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗（1∶2000 稀釋）、二抗（1∶20 000 稀釋）等步驟，最后用ECL 液顯色檢測蛋白信號，用Band Scan 圖像分析軟件分析各陽性條帶的積分灰度值，分別計算GRP78、CHOP 與內(nèi)參β-actin 的灰度值之比作為其蛋白相對含量值。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較比較采用LSD-t 檢驗，生存分析采用Log-Rank 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組存活情況比較

肝衰竭組在28 h 內(nèi)全部死亡，正常對照組無死亡，纈沙坦組72 h 的存活率高于肝衰竭組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。見圖1。

圖1 三組生存曲線比較（n=10）

2.2 三組血清及肝臟組織中AngⅡ、Ang 1-7、AngⅡ/Ang 1-7 比值比較

肝衰竭組血清和肝臟組織的AngⅡ、AngⅡ/Ang 1-7比值均高于正常對照組，血清中Ang 1-7 高于正常對照組，肝臟組織中Ang 1-7 低于正常對照組，差異有高度統(tǒng)計學意義（均P ＜0.01）。纈沙坦組大鼠血清和肝臟組織的AngⅡ、AngⅡ/Ang 1-7 比值均低于肝衰竭組，Ang 1-7 均高于肝衰竭組，差異有高度統(tǒng)計學意義（均P ＜0.01）。見圖2。

圖2 三組AngⅡ、Ang 1-7、AngⅡ/Ang 1-7 比值的比較（n=10）

2.3 三組血清生化指標及炎癥因子比較

肝衰竭組血清ALT、AST、TNF-α、IL-6 水平均高于正常對照組，差異有高度統(tǒng)計學意義（均P ＜0.01）。纈沙坦組血清ALT、AST、TNF-α、IL-6 水平均低于肝衰竭組，差異有高度統(tǒng)計學意義（均P ＜0.01）。見圖3。

圖3 三組血清生化指標及炎癥因子的比較（n=10）

2.4 三組肝組織病理的變化

HE 染色結(jié)果顯示，正常對照組肝臟組織小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列；肝衰竭組肝臟組織部分肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細胞變性壞死嚴重，纈沙坦組肝臟組織肝細胞變性壞死較肝衰竭組減少，見圖4A（封三）。免疫組化結(jié)果顯示，纈沙坦組肝組織匯管區(qū)MPO 和CD68 陽性的炎癥細胞較肝衰竭組減少，見圖4B、C（封三）。

圖4 三組肝臟組織病理染色

2.5 三組肝臟組織GRP78、CHOP 表達水平比較

肝衰竭組肝臟組織中GRP78、CHOP 的mRNA 及蛋白表達水平均高于正常對照組，差異有高度統(tǒng)計學意義（均P ＜0.01）。纈沙坦組肝臟組織中GRP78、CHOP 的mRNA 及蛋白表達水平均低于肝衰竭組，差異有高度統(tǒng)計學意義（均P ＜0.01）。見圖5。

圖5 三組肝臟組織GRP78、CHOP 表達水平比較

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，RAS 與肝炎、肝硬化等各種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[4-5]。目前認為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶-AngⅡ-血管緊張素Ⅱ1 型受體（ACE-AngⅡ-AT1R）軸是RAS 的主要功能軸，而AngⅡ是其中的核心分子，可以通過特異性結(jié)合AT1R 發(fā)揮促炎癥、促纖維化效應[6-10]。同時，在體內(nèi)AngⅡ也能夠被ACE2 裂解成Ang 1-7，后者可以與Mas 受體結(jié)合發(fā)揮抗炎、抗纖維化作用[11-12]。研究表明，AngⅡ能夠刺激巨噬細胞分泌IL-6、TNF-α，其本身也是一種重要的炎癥因子[13-16]。而IL-6、TNF-α 則是肝損傷中重要的促炎性細胞因子，能夠誘導肝細胞凋亡及壞死，加重肝臟炎癥[17-19]。AT1R 阻斷劑（ARB）可以從受體水平選擇性阻斷AngⅡ與AT1R 結(jié)合，從而拮抗AngⅡ的生物學效應。目前關于ARB 在肝纖維化、肝硬化中的應用研究較多，但其在肝衰竭中的作用報道甚少[2-3]。本研究發(fā)現(xiàn)，在急性肝衰竭病理狀態(tài)下，血清及肝組織中的AngⅡ及AngⅡ/Ang 1-7 水平均明顯升高，提示存在ACE-AngⅡ-AT1R 軸的激活。而纈沙坦干預后，急性肝衰竭大鼠的肝功能損傷明顯減輕，TNF-α、IL-6等細胞因子水平低于肝衰竭組，肝臟組織中肝細胞壞死及炎癥細胞浸潤明顯減輕。以上實驗結(jié)果表明，急性肝衰竭時存在RAS 的激活，纈沙坦能夠通過阻斷RAS 發(fā)揮抗炎效應，對急性肝衰竭具有保護作用。

然而對于纈沙坦抗炎作用的具體機制尚不明確。越來越多的研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）與多種肝臟疾病如病毒性肝炎、酒精性肝病、肝衰竭等密切相關[20-24]。適度的ERS 有利于維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，持續(xù)或過度的ERS 則會影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)或功能，激活下游相關的信號通路，繼而誘導炎癥、凋亡，最終導致臟器的損傷[25]。有研究表明，AngⅡ與AT1R 結(jié)合可以激活腎臟細胞的ERS 促進其凋亡，而ARB 可以通過抑制ERS 對糖尿病大鼠發(fā)揮腎臟保護作用，因此推測在肝衰竭中同樣存在這種現(xiàn)象[26]。實驗結(jié)果顯示，急性肝衰竭大鼠肝臟中ERS 標志分子GRP78、CHOP 水平明顯升高，提示存在過度的ERS，這與既往的研究報道一致[27]。而纈沙坦干預后肝衰竭大鼠肝臟組織中GRP78、CHOP 的表達水平明顯下調(diào)，提示ERS 激活水平的下降。因此本研究提示，在急性肝衰竭時，纈沙坦可能通過阻斷RAS抑制肝臟內(nèi)的ERS 水平，進而抑制ERS 下游相關的炎癥通路，減輕細胞因子風暴，最終發(fā)揮抗炎保肝作用，但其具體作用機制仍有待于更深一步的研究。

綜上所述，纈沙坦可能通過阻斷RAS，能夠?qū)毙愿嗡ソ弋a(chǎn)生保護作用，其作用機制可能與抑制肝臟的ERS 水平有關，阻斷RAS 可能為急性肝衰竭的治療提供新的思路。