銀蘭含漱方UPLC指紋圖譜及6種成分含量測定研究

江潔怡，曾志浩，黃華靖，李素梅，胥愛麗，李養(yǎng)學(xué)

（1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東廣州 510095；2.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣東廣州 510095；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405）

銀蘭含漱方是廣東省第二中醫(yī)院臨床應(yīng)用多年的經(jīng)驗方，是治療脾胃濕熱或濕濁內(nèi)阻的口腔潰瘍、口臭等口腔疾病的協(xié)定處方，由金銀花、黃芩、薄荷、甘草、佩蘭、丁香組成，其中金銀花主要含有黃酮類、環(huán)烯醚萜苷類等成分[1]，黃芩中主要含有黃酮及黃酮苷類化合物[2]，二藥共為君藥，共奏清熱燥濕、瀉火解毒功效；佩蘭主要含揮發(fā)油、黃酮類成分[3?4]，芳香化濕，為臣藥；薄荷主要含有揮發(fā)油、黃酮類等成分[5]，丁香主要含揮發(fā)油、色酮苷等[6?7]，兩者共為佐藥；甘草主要有三萜皂苷類、甘草多糖類等化學(xué)成分[8?9]，為使藥；以上諸藥合用，共奏清熱化濁、芳香辟穢之功。

銀蘭含漱方在廣東省第二中醫(yī)院臨床口腔護理中應(yīng)用多年，能有效地治療口腔潰瘍、去除異味、防治口腔炎癥，復(fù)發(fā)率低，具有良好的應(yīng)用前景，但質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究方面仍不深入，僅建立了其檢查項、薄層鑒別、單成分含量測定方法，阻礙了其進一步的推廣利用，提高及完善其質(zhì)量控制體系成了亟待解決的問題。眾所周知，化學(xué)成分是藥效物質(zhì)發(fā)揮作用的基礎(chǔ)，中藥特別是復(fù)方制劑，化學(xué)成分復(fù)雜，且具有多靶點、協(xié)同作用的特點，單一指標(biāo)成分難以全面評價其內(nèi)在質(zhì)量，而指紋圖譜技術(shù)能較為全面地反映中藥及其制劑中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進而對藥品質(zhì)量進行整體描述和評價。在此基礎(chǔ)上，指紋圖譜結(jié)合模式識別方法能有效彌補現(xiàn)有質(zhì)量控制方法的不足[10?11]。本研究對15批銀蘭含漱方進行指紋圖譜研究，測定其中甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸、漢黃芩素6個成分的質(zhì)量濃度，并應(yīng)用指紋圖譜相似度評價結(jié)合PCA分析和PLS?DA分析對其結(jié)果進行分析，為銀蘭含漱方的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)，為其開發(fā)成為安全有效、穩(wěn)定可控的中藥新藥奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Agilent 1290色譜儀（美國Agilent公司）；XS205DU電子分析天平（瑞士梅特勒?托利多公司）；Milli?QAdvantage型A10自動型純水機（美國Millipore公司）。

綠原酸（批號：110753?201415，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.1%）、甘草苷（批號：111610?201106，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.7%）、黃芩苷（批號：110715?201821，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.4%）、漢黃芩苷（批號：112002?201702，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.5%）、黃芩素（批號：111595?201607，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.5%）、甘草酸銨（批號：110731?201116，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.1%）均購自中國食品藥品檢定研究院；隱綠原酸（批號：Y?067?180425，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、新綠原酸（批號：RFS?X01411804010，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.83%）、漢黃芩素（批號：H?029?160802，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）購自成都瑞芬思生物科技有限公司；甲酸、磷酸、乙腈等液相用試劑為色譜純（德國Merck公司）；甲醇等其余試劑均為分析純（廣州化學(xué)試劑廠）；水為蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

銀蘭含漱方（批號：20180201、20180202、20180203、20180501、20180502、20180503、20180801、20180802、20180803、20190101、20190102、20190103、20190401、20190402、20190403，依次編號為S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15）由廣東省第二中醫(yī)院制劑室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

精密量取銀蘭含漱方約1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0.22μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2 陰性樣品溶液的制備

按照銀蘭含漱方的處方和制備工藝，分別制備缺金銀花、黃芩、薄荷、甘草、佩蘭、丁香的陰性樣品，再按“2.1”項方法制備6種陰性樣品溶液。

2.3 混合對照品溶液的制備

精密稱取各對照品適量，分別加甲醇制成含隱綠原酸（245.00μg/mL）、新綠原酸（367.50μg/mL）、綠原酸（225.00μg/mL）、甘草苷（292.22μg/mL）、黃芩苷（741.42μg/mL）、漢黃芩苷（215.52μg/mL）、黃芩素（181.67μg/mL）、甘草酸銨（237.78μg/mL）、漢黃芩素（124.72μg/mL）的溶液，作為對照品儲備液。

分別取上述對照品溶液各1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成含隱綠原酸24.50μg/mL、新綠原酸36.75μg/mL、綠原酸22.50 μg/mL、甘草苷29.22μg/mL、黃芩苷24.71μg/mL、漢黃芩苷17.96μg/mL、黃芩素18.16μg/mL、甘草酸銨23.78μg/mL、漢黃芩素12.47μg/mL的混合對照品溶液。

2.4 色譜條件

采用Phenomenex Luna Omega PS C1（82.1 mm×150 mm，1.6μm）色譜柱；柱溫為30℃；以乙腈為流動相A，0.1%甲酸（含0.05%磷酸）為流動相B，進行梯度洗脫（0~2 min，5%→11%A；2~7 min，11%A；7~10 min，11%→20%A；10~17 min，20%→28%A；17~19 min，28%→30%A；19~22 min，30%→58%A；22~25 min，58%A）；流速為0.40 mL/min；檢測波長為245 nm；進樣量為1μL；理論塔板數(shù)按黃芩苷峰計算不低于5 000。

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 精密度試驗 取同一供試品溶液（批號20190101），按“2.4”項色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄色譜圖，以漢黃芩苷峰（10號峰）為參照，計算13個共有峰的相對保留時間及相對峰面積，結(jié)果RSD值均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗 分別取同一批次樣品（批號20190101），按“2.1”項方法制備供試品溶液，平行6份，并按“2.4”項色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，以漢黃芩苷峰（10號峰）為參照，計算13個共有峰的相對保留時間及相對峰面積，結(jié)果RSD值均小于2%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（20190101），按“2.4”項色譜條件，分別在放置0、2、4、8、12、24 h后進樣測試，記錄色譜圖，以漢黃芩苷峰（10號峰）為參照，計算13個共有峰的相對保留時間及相對峰面積，結(jié)果RSD值均小于2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 指紋圖譜的建立及相似度評價 分別精密吸取不同批次（S1~S15）的銀蘭含漱方供試品溶液及混合對照品溶液各1μL，注入UPLC色譜儀中，按“2.4”項色譜條件進樣測定，將記錄得到的各批次色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”，以S1為參照圖譜，采用中位數(shù)法，時間窗寬度為0.1 min，自動匹配，生成共有模式圖，標(biāo)定了13個共有峰為特征峰，并通過與對照品保留時間及紫外全波長掃描圖比對，指認(rèn)了其中9個共有峰，分別為1號峰隱綠原酸、3號峰新綠原酸、4號峰綠原酸、6號峰甘草苷、7號峰黃芩苷、10號峰漢黃芩苷、11號峰黃芩素、12號峰甘草酸、13號峰漢黃芩素，見圖1、2。15批銀蘭含漱方供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度分別為0.964、0.982、0.998、0.960、0.997、0.994、0.973、0.998、0.998、0.996、0.998、0.999、0.997、0.998、0.999，均 大于0.9，相似度評價表明，15批供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相關(guān)性良好，各批次銀蘭含漱方化學(xué)成分一致，主要差異表現(xiàn)在各成分的含量上。

圖1 15批銀蘭含漱方UPLC疊加圖譜Figure 1 UPLCoverlay chromatograms of 15 batches of Yin?lan Hanshufang

圖2 銀蘭含漱方對照指紋圖譜Figure 2 Comparison fingerprint of Yinlan Hanshufang

2.5.5 銀蘭含漱方指紋圖譜PCA分析 分別使用SPSS 26.0軟件和SIMCA 14.1軟件對15批銀蘭含漱方的指紋圖譜共有峰峰面積歸一化處理后的數(shù)據(jù)進行PCA分析。

首先采用SIMCA 14.1軟件，對15批銀蘭含漱方樣品進行主成分分析（PCA），選取特征值最大的4個主成分進行擬合分析，其累積方差貢獻(xiàn)率94.138%，得到15批銀蘭含漱方樣品的Scores圖，見圖3。結(jié)果顯示，所有樣品均在95%可信區(qū)間內(nèi)，且15批樣品沒有明顯的聚類趨勢，說明15個批次的銀蘭含漱方質(zhì)量較一致。

圖3 15批銀蘭含漱方的二維主成分得分圖Figure 3 Two dimensional principal component score scatter of 15 batches of Yinlan Hanshufang

表2 銀蘭含漱方主成分因子載荷矩陣Table 2 Principal component load matrix of Yinlan Hanshu?fang

采用SPSS 26.0軟件，提取特征值大于1的成分，得到主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率、主成分載荷矩陣（見表1、2）。由結(jié)果可知，前4個主成分的方差累計貢獻(xiàn)率為94.138%，其代表了15批樣品中13個共有峰的94.138%信息量，體現(xiàn)了樣品的基本特征和主要信息，其中第1主成分信息主要來自2、3、5~10、13號峰；第2主成分信息主要來自4號峰；第3主成分信息主要來自1、11號峰；第4主成分信息主要來自12號峰，上述成分在特征變量的重要性評估中具有優(yōu)勢。2.5.6 PLS?DA分析 將15批銀蘭含漱方按照生產(chǎn)月份分為201802、201805、201808、201901、201904共5類，采用SIMCA 14.1軟件，對15批銀蘭含漱方中13個共有峰峰面積歸一化處理后數(shù)據(jù)進行PLS?DA分析，得到變量重要性投影（Variable Impor?tance in Projection,VIP）值圖（見圖4）。由VIP圖可直觀得出各色譜峰影響程度，依次為2號峰>6號峰>9號峰>5號峰>7號峰>8號峰>4號峰>10號峰>12號峰>3號峰>13號峰>1號峰>11號峰。13個共有峰中，2號峰、6號峰（甘草苷）、9號峰、5號峰、7號峰（黃芩苷）、8號峰、4號峰（綠原酸）、10號峰（漢黃芩苷）的VIP值大于1，說明變量對模型分類的貢獻(xiàn)具有統(tǒng)計學(xué)意義，可作為差異標(biāo)志物。

表1 銀蘭含漱方PCA特征值與方差貢獻(xiàn)率Table 1 PCA eigenvalues and variance contribution rate of Yinlan Hanshufang

圖4 15批銀蘭含漱方PLS?DA模型中11個共有峰的VIP值圖Figure 4 VIPvalues of 11 common peaks in PLS?DA model of 15 batches of Yinlan Hanshufang

2.6 多指標(biāo)含量測定

2.6.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取不同體積的各對照品儲備溶液，加甲醇稀釋，制得質(zhì)量濃度分別含 甘 草 苷29.20、87.60、146.00、204.40、262.80、292.00μg/mL；黃芩苷247.14、741.42、1 235.70、1 729.98、2 224.26、2 471.40μg/mL；漢黃芩苷17.96、35.92、53.88、71.84、89.80、107.76μg/mL；黃芩素18.16、54.48、90.80、127.12、163.44、181.60μg/mL；甘草酸23.78、71.34、118.90、166.46、214.02、237.80 μg/mL；漢黃芩素12.47、37.41、62.35、87.29、112.23、124.70μg/mL的系列對照品溶液。分別精密吸取系列對照品溶液1μL，注入UPLC色譜儀，按“2.4”項色譜條件測定，記錄各色譜峰峰面積。以含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程。結(jié)果見表3。

表3 線性關(guān)系考察結(jié)果Table 3 Results of the linear relationship

2.6.2 專屬性試驗 分別精密吸取“2.3”項的混合對照品溶液、“2.1”項供試品溶液及“2.2”項各陰性樣品溶液1μL，按“2.4”項色譜條件依法進樣測定，結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，待測成分甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸和漢黃芩素可與相鄰成分達(dá)到基線分離，陰性樣品無干擾。

圖5 對照品、供試品與陰性樣品的色譜圖Figure 5 UPLCchromatograms of mixed reference substanc?es,test sample and negative sample

2.6.3 精密度試驗 取同一供試品溶液（20190101），按“2.4”項色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄各峰峰面積，計算得RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.6.4 重復(fù)性試驗 分別取一批次樣品（20190101），按“2.1”項方法制備供試品溶液，平行6份，并按“2.4”項色譜條件進樣測定，記錄各峰峰面積，計算得到甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸、漢黃芩素RSD值分別為1.18%、1.28%、1.16%、0.95%、1.07%、1.22%，RSD均小于2%，表明方法重復(fù)性良好。

2.6.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（20190101），按“2.4”項色譜條件，分別在放置0、2、4、8、12、24 h后進樣測試，記錄各峰峰面積，計算得RSD均小于2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.6 中間精密度試驗 分別由2名不同分析人員在不同日期和不同色譜儀下操作，取同一批次樣品（20190101），按“2.1”項方法制備供試品溶液，每次平行6份，并按“2.4”項色譜條件進樣測定，記錄各峰峰面積，計算得到各成分含量及RSD，結(jié)果RSD均小于2%，表明分析方法中間精密度良好。

2.6.7 加樣回收率試驗 取9份已測定含量樣品（20190101）0.5 mL，分別精密加入一定量的對照品，分別按“2.1”項方法制備供試品溶液9份，按“2.4”項色譜條件進樣分析，計算得到甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸、漢黃芩素的平均加樣回收率分別為97.91%、100.85%、97.99%、100.01%、98.91%、98.85%，RSD分別為1.95%、1.23%、1.94%、1.78%、1.92%、1.43%。

2.6.8 樣品質(zhì)量濃度測定 取15批銀蘭含漱方樣品，分別按“2.1”項方法制備供試品溶液，并按“2.4”項色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算各批次中甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸、漢黃芩素的質(zhì)量濃度，結(jié)果見表4。

從表4可見，15批銀蘭含漱方中各批次之間的成分質(zhì)量濃度差異比較大。甘草苷的質(zhì)量濃度為0.22～0.57μg/mL，平均為0.37μg/mL，其中S1的濃度最低；黃芩苷的質(zhì)量濃度為0.11～3.25μg/mL，平均為2.10μg/mL，各批次之間的差異比較大，其中S15的最高；漢黃芩苷的質(zhì)量濃度為0.21～0.68μg/mL，平均為0.44μg/mL；黃芩素的質(zhì)量濃度為0.05～0.23μg/mL，平均為0.10μg/mL；甘草酸的質(zhì)量濃度為0.03～0.14μg/mL，平均為0.08μg/mL；漢黃芩素的質(zhì)量濃度為0.14～0.45μg/mL，平均為0.27μg/mL。

表4 15批銀蘭含漱方樣品質(zhì)量濃度測定結(jié)果Table 4 Results of determination of 15 batches of Yinlan Hanshufang ρ/(mg·mL?1)

3 討論

研究前期將所制備的供試品溶液在波長210～400 nm進行全波長掃描，結(jié)果顯示在波長為245 nm處各色譜峰的豐度、數(shù)目、分離度較好，故選擇該波長為檢測波長。為了得到更優(yōu)的色譜條件，先后考察了不同色譜柱（Waters CORTECSUPLC T3、Phenomenex Luna Omega PS、Agilent Poroshell 120 EC C18）、不同流動相體系（乙腈?0.1%甲酸水溶液、乙腈?0.1%甲酸（含0.05%磷酸）水溶液、甲醇?0.1%冰醋酸水溶液）、不同柱溫（30、35、40℃）以及不同流速（0.25、0.30、0.35 mL/min），確定了最終的色譜條件。

本研究在銀蘭含漱方多成分含量測定和指紋圖譜相似度評價的分析基礎(chǔ)上，結(jié)合PCA模型對銀蘭含漱方不同批次產(chǎn)品質(zhì)量的一致性進行分析。第1主成分的方差貢獻(xiàn)率達(dá)到64.192%，該主成分信息主要來自新綠原酸、甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素、2號峰和5號峰等成分，這些成分主要來源于金銀花、黃芩、甘草3味藥材。本方的君藥為金銀花和黃芩，其中黃芩苷和漢黃芩苷來源于黃芪，而綠原酸非全部來源于金銀花。另外，根據(jù)PLS?DA的VIP值分析，黃芩苷和漢黃芩苷的VIP值均大于1，可作為差異標(biāo)志物，因此本試驗只考慮君藥黃芪藥材的質(zhì)量對成品的影響。S1~S6的黃芩藥材來源于山西省，S7~S15的黃芩藥材來源于河北省，根據(jù)PCA模型預(yù)判，可知2個產(chǎn)地藥材之間的差異不大。

本研究指認(rèn)了隱綠原酸、新綠原酸、綠原酸、甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸、漢黃芩素9個成分，在專屬性考察試驗時發(fā)現(xiàn)供試品的隱綠原酸、新綠原酸和綠原酸有陰性干擾。因此，在考察質(zhì)量濃度時只測定甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸、漢黃芩素6種成分的質(zhì)量濃度，結(jié)果顯示黃芩苷的質(zhì)量濃度最高，而黃芩素和甘草苷的最低，建議不對黃芩素和甘草苷進行質(zhì)量控制。以15批樣品質(zhì)量平均值的70%~130%設(shè)限，暫將含量限度定為甘草苷0.26~0.48 mg/mL、黃芩苷1.47~2.73 mg/mL、漢黃芩苷0.31~0.57 mg/mL、漢黃芩素0.19~0.35 mg/mL。

15批銀蘭含漱方特征圖譜相似度較高，說明制劑工藝穩(wěn)定；而15批銀蘭含漱方樣品各批次之間的成分含量差異較明顯，這可能與投料藥材的產(chǎn)地、采收期等因素有關(guān)，為了保證成品質(zhì)量的穩(wěn)定、可控，必須從原藥材的質(zhì)量出發(fā)，建立原藥材的入選標(biāo)準(zhǔn)。本研究僅從化學(xué)成分層面出發(fā)，對銀蘭含漱方質(zhì)量進行控制，下一步可結(jié)合藥理研究，明確其質(zhì)量標(biāo)志物，保證產(chǎn)品的安全、有效。