agr功能缺陷金黃色葡萄球菌流行及遺傳學(xué)特征

鮑桃香，宋皓月，楊 涵，何春燕，舒 文，陳雯靜，湯 榮，劉慶中

（上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院，上海 201620）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引起人類各種感染的主要病原體，其致病機(jī)制和致病力與細(xì)菌產(chǎn)生的各種毒力因子密切相關(guān)[1]。這些毒力因子的表達(dá)（如胞外毒素、胞外酶、生物膜相關(guān)分子）很多都由群體感應(yīng)附屬基因調(diào)節(jié)子（accessory gene regulator，agr）系統(tǒng)調(diào)控，使細(xì)菌可以逃避機(jī)體防御，在感染部位播散，損傷組織[2]。

agr操縱子由被P2和P3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的2個(gè)雙向轉(zhuǎn)錄單元組成。P2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄生成RNAⅡ分子，編碼AgrB、AgrD、AgrC和AgrA 4種蛋白。AgrD和AgrB協(xié)作產(chǎn)生agr信號(hào)分子——自誘導(dǎo)肽（autoinduced peptide，AIP）。AIP與AgrC結(jié)合后可磷酸化AgrA，繼而激活P2和P3[2]。P3啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄生成RNAⅢ，是agr系統(tǒng)調(diào)節(jié)多種毒力因子表達(dá)的胞內(nèi)效應(yīng)器，同時(shí)也是編碼δ溶血素的基因。因此，檢測菌株δ溶血情況可以評(píng)估agr功能。

agr基因座在金黃色葡萄球菌中分布廣泛。但近幾年的研究發(fā)現(xiàn)有臨床分離的金黃色葡萄球菌中存在agr功能缺陷[3]。agr功能缺陷與生物膜形成、菌血癥、慢性感染、預(yù)后不良和萬古霉素耐藥有關(guān)[3]。雖然agr功能缺陷在金黃色葡萄球菌感染中發(fā)揮重要作用，但關(guān)于其在我國臨床菌株中流行情況的報(bào)道非常少。因此，本研究對(duì)上海市和浙江省共5家醫(yī)院臨床分離的1 238株金黃色葡萄球菌進(jìn)行agr功能缺陷檢測，并對(duì)功能缺陷菌株進(jìn)行agr分型、金黃色葡萄球菌蛋白A基因（staphylococcal protein A，spa）分型、葡萄球菌盒式染色體mec（staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec）分型和多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST），以了解其流行情況和遺傳學(xué)背景。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集上海市和浙江省5家醫(yī)院分離自各種臨床樣本的非重復(fù)金黃色葡萄球菌1 238株，其中上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院955株（2013年1月—2017年12月）、上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院85株（2011年6月—2011年12月）、上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院37株（2013年2月—2014年9月）、麗水市人民醫(yī)院72株（2013年7月—2014年9月）、上海市第六人民醫(yī)院89株（2010年12月—2014年9月）。藥物敏感性試驗(yàn)質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）由上海市臨床檢驗(yàn)中心提供。金黃色葡萄球菌RN 4220由復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所惠贈(zèng)。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillinresistant Staphylococcus aureus，MRSA）NCTC 10442、N315、85/2082、JCSC4744和D12分別為SCCmecⅠ～Ⅴ型的參考菌株，由上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院臨床微生物科惠贈(zèng)。

1.2 儀器與試劑

VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)（法國生物梅里埃公司）和配套革蘭陽性菌鑒定卡；頭孢西丁紙片（30 μg）購自英國Oxoid公司；血平板和水解酪蛋白培養(yǎng)基購自上海科馬嘉微生物技術(shù)有限公司；引物合成、Taq酶、dNTPs、瓊脂糖及溶葡球菌酶購自生工生物工程（上海）股份有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、GeneGreen核酸染料購自北京天根生物技術(shù)有限公司；DNA Marker購自大連TaKaRa生物工程有限公司；聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物測序交由上海邁普生物科技有限公司完成。

1.3 細(xì)菌分離鑒定和甲氧西林藥物敏感性試驗(yàn)

根據(jù)第4版《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[4]要求進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和分離，采用VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定金黃色葡萄球菌。采用頭孢西丁紙片法[5]檢測金黃色葡萄球菌對(duì)甲氧西林的耐藥性。

1.4 agr功能缺陷菌株篩選

將待測菌株與只產(chǎn)生β溶血的金黃色葡萄球菌RN 4220垂直接種在血平板上，35 °C培養(yǎng)18～20 h。以在與金黃色葡萄球菌RN 4220交界處出現(xiàn)溶血增強(qiáng)為δ溶血陽性，提示agr功能正常；如果沒有δ溶血活性，則為agr功能缺陷[6]。

1.5 DNA提取

在agr功能缺陷金黃色葡萄球菌菌液中加入10 μL溶葡球菌酶（濃度為1 mg/mL），37 °C孵育0.5 h后，按試劑盒說明書要求提取DNA，作為后續(xù)PCR的模板。

1.6 甲氧西林耐藥性確認(rèn)

對(duì)agr功能缺陷金黃色葡萄球菌行mecA和mecC基因檢測，進(jìn)一步確認(rèn)其甲氧西林耐藥性[7]。

1.7 agr、spa、SCCmec和MLST檢測

參考文獻(xiàn)[7-8]，采用PCR對(duì)agr功能缺陷金黃色葡萄球菌進(jìn)行agr（agr1～4型）、spa、SCCmec（SCCmecⅠ～Ⅴ型）和MLST分型檢測，引物見表1。spa基因可變重復(fù)區(qū)產(chǎn)物測序后通過RidomSpaServer數(shù)據(jù)庫（http：//www.ridom.de/spaserver/）確定spa型別。對(duì)目的菌株7個(gè)管家基因arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi和yqiL進(jìn)行擴(kuò)增和測序后，再進(jìn)行MLST分型（http：//www.mlst.net），并應(yīng)用eBURST v3軟件分析菌株所屬的克隆復(fù)合物（clonal complex，CC）。

表1 基因分型引物

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分類變量的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 agr功能缺陷金黃色葡萄球菌的流行特征

1 238株金黃色葡萄球菌中，72.8%（901/1 238）分離自呼吸道樣本，14.6%（181/1 238）分離自膿液或分泌物樣本，7.5%（93/1 238）分離自尿液樣本，1.5%（18/1 238）分離自血液樣本，1.1%（13/1 238）分離自導(dǎo)管引流液樣本，1.4%（17/1 238）分離自其他無菌體液樣本。頭孢西丁藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，有565株（45.6%）為MRSA、673株（54.4%）為甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（methicillin-sensitive Staphylococcus aureus，MSSA）。δ溶血檢測結(jié)果顯示，有45株（3.6%）agr功能缺陷（δ溶血陰性）菌株（圖1），包括28株（5.0%）MRSA和17株（2.5%）MSSA（χ2=5.177，P=0.023）。45株agr功能缺陷菌株中，37株（82.2%）分離自膿液/分泌物（19株）樣本和呼吸道樣本（18株），其余分離自尿液、導(dǎo)管引流液和無菌體液樣本；患者以成年人為主，僅2株分離自兒童患者（6歲和11歲）。見表2。

表2 45株agr功能缺陷金黃色葡萄球菌的來源和遺傳特征

圖1 δ溶血活性檢測結(jié)果

2.2 基因分型

agr分型以1型（44%，20/45）為主，其次為2型（33%，15/45）和3型（11%，5/45）。另有5株未能分型。agr1型在MSSA（58.8%，10/17）和MRSA（35.7%，10/28）間的分布

差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.288，P=0.130）；而agr2型在MRSA中所占比例（46.4%，13/28）顯著高于MSSA（11.8%，2/17）（χ2=4.266，P=0.039）。

SCCmec分型結(jié)果顯示，SCCmecⅡ最常見（71.4%，20/28），其次為SCCmecⅢ（25.0%，7/28），有1株細(xì)菌未能分型。未發(fā)現(xiàn)SCCmecⅠ、Ⅳ和Ⅴ型菌株。

spa可變重復(fù)區(qū)序列分析發(fā)現(xiàn)了20個(gè)spa型別。在MRSA中，最常見的為t002（21.4%，6/28），其次是t2460、t037和t311（各占17.9%，5/28）。其他spa型別分別為t030（2株）、t189、t2932、 t4549、 t007、 t010（各1株）。MSSA以t189型（29.4%，5/17）最為流行，其他12株分別為t3622（2株）和t091、t4362、t437、t2932、t338、t318、t6497、t11270、t502和t346（各1株）。僅有t189和t2932共存于MRSA和MSSA中（每個(gè)型別各1株）。

MLST結(jié)果顯示，45株agr功能缺陷金黃色葡萄球菌分為10個(gè)型別，分別為ST7（CC7）、ST5（CC5）、ST239（CC8）、ST188（CC1）、ST88（CC88）、ST30（CC30）、ST59（CC59）、ST2114（CC6）、ST39（CC30）和ST15（CC15）。其中ST5（40.0%，18/45）和ST239（17.7%，8/45）是最主要的型別，且主要分布于MRSA[60.7%（17/28）和28.6%（8/28）]。居第3位的為ST188（13.3%，6/45），主要分布于MSSA（29.4%，5/17）。結(jié)合agr分型結(jié)果進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)CC5是agr2分型中最為常見的CC（93.3%，14/15），而CC8主要存在于agr1分型（40%，8/20）。agr功能缺陷金黃色葡萄球菌的各種分子分型特征見表2。

表3 45株agr功能缺陷金黃色葡萄球菌基因分型總結(jié)

3 討論

以往研究認(rèn)為，agr功能缺陷金黃色葡萄球菌（尤其是MRSA）在臨床上比較常見。而本研究結(jié)果顯示該類菌株的流行率較低（3.6%），其與我國兒童人群中的流行率（3.71%）[3]基本一致；不同之處在于，本研究agr功能缺陷在MRSA中所占比例（5.0%）顯著高于MSSA（2.5%）（P=0.023），而在YANG等[3]的研究中，兒童分離株中兩者的比例相近，分別為3.79%和3.45%。FOWLER等[9]和SCHWEIZER等[10]認(rèn)為，agr功能缺陷與血流感染及預(yù)后不良有關(guān)。不過，本研究并未從血液培養(yǎng)樣本中分離出agr功能缺陷菌株。因此，agr功能缺陷與血流感染的相關(guān)性仍有待進(jìn)一步探討，或是對(duì)更多的血流感染樣本進(jìn)行研究。

agr型別會(huì)因地域、CC分布、毒力、耐藥及AIP特性而不同[2]。因此，確定特定區(qū)域agr的主要型別較有意義。YANG等[3]發(fā)現(xiàn)agr1型是我國兒童人群agr功能缺陷金黃色葡萄球菌的主要型別，而本研究結(jié)果顯示agr1型也是成年人群agr功能缺陷金黃色葡萄球菌的主要型別（表2）。本研究中，agr2型MRSA所占比例較高，與韓國的數(shù)據(jù)[11-12]相似。

agr功能缺陷MRSA可分為5個(gè)CC，其中CC5（ST5）和CC8（ST239）最為常見。而agr功能缺陷MSSA菌株克隆的多樣性更高，有8個(gè)CC，以CC1（ST188）為主（表2），這種情況與PéREZ-MONTARELO等[13]的研究結(jié)果一致。CC5是拉丁美洲、德國和西班牙MRSA中最流行的克隆[13]。同樣，本研究中CC5與agr功能缺陷的MRSA也顯著相關(guān)（60.7%）。這些結(jié)果表明，臨床需要重視探索CC5克隆菌株的發(fā)病機(jī)制、分子特性及傳播影響因素。

agr1常被發(fā)現(xiàn)于CC8、CC25、CC22、CC45和CC395菌株中，agr2在CC5、CC12和CC15菌株中較多，而agr3通常由克隆系CC30攜帶[2]。本研究發(fā)現(xiàn)，agr2與CC5顯著相關(guān)（93.3%），而40%的agr1型菌株屬于CC8。

本研究結(jié)果顯示，60.7%（17/28）的agr功能缺陷MRSA屬于ST5-SCCmecⅡ型，25.0%（7/28）屬于ST239-SCCmecⅢ型。這一相對(duì)較高的同源性在分離自中國兒童和韓國菌血癥患者的agr功能缺陷MRSA中也得到證實(shí)[3，11]。有研究結(jié)果顯示，agr功能缺陷MRSA多見于SCCmecⅠ～Ⅲ型[14]，本研究的結(jié)果也證實(shí)了這一結(jié)論。

本研究中，agr功能缺陷菌株共檢出20個(gè)spa型別，表現(xiàn)出很大的spa遺傳多樣性。在主要的spa型別中（t002、t037、t189、t311、t2460，≥5株），t002 和t037也被發(fā)現(xiàn)于兒童及其他來源的agr功能缺陷菌株[11，14-15]。spa與ST型別間的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，t002、t2460和t311菌株屬于ST5（CC5）克隆，t037菌株與ST239（CC8）克隆有關(guān)，所有t189型菌株均與ST188（CC1）克隆相關(guān)。

總之，agr功能缺陷表型在金黃色葡萄球菌臨床分離株中的流行率較低，但在MRSA中所占比例高于MSSA。agr功能缺陷MRSA主要為ST5（CC5）-SCCmecⅡ-t002/t311/t2460-agr2（42.9%，12/28）和ST239（CC8）-SCCmecⅢ-t037-agr1（17.9%，5/28），而agr功能缺陷MSSA最常見的型別為ST188（CC1）-t189-agr1（29.4%，5/17）。雖然本研究agr功能缺陷菌株數(shù)量不多，但結(jié)果依然能反映我國agr功能缺陷金黃色葡萄球菌的流行特征。