核磁共振波譜法與傳統(tǒng)生化檢測方法血脂檢測結果相關性分析

彭琰君，韓雪晶，唐紅霞，陳俊萌，賈克剛

（1.杭州市余杭區(qū)第二人民醫(yī)院檢驗科，浙江 杭州 211121；2.天津醫(yī)科大學心血管病臨床學院 泰達國際心血管病醫(yī)院檢驗科，天津 300457；3.河北北方學院醫(yī)學檢驗學院，河北 張家口 075000）

目前，臨床實驗一般采用全自動生化分析儀檢測血脂水平。近年來，隨著技術的不斷發(fā)展，一些新型的檢測儀器，如核磁共振儀等逐步應用于臨床，為同時測定包括血脂在內(nèi)的一系列生物分子和代謝產(chǎn)物提供了有力的技術支持。核磁共振儀的原理是通過核磁共振波譜法（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）分析不同脂質(zhì)甲基的特定振幅，從而得出血脂譜水平。NMR將低密度脂蛋白（lowdensity lipoprotein，LDL）按粒徑分為6個亞組分（LDL1～LDL6），其粒徑分別為22.2～23.0、21.3～22.1、20.6～21.2、19.8～20.5、19.1～19.7、18.3～19.0 nm，密度分別為1.019 ～1.031、1.032～1.034、1.035～1.037、1.038～1.040、1.041～1.044、1.045～1.060 g/mL[1]。NMR可測定6個LDL亞組分的膽固醇水平（以LDL1-C～LDL6-C表示）和顆粒濃度（以LDL1-P～LDL6-P表示）[2]。目前，臨床一般通過采用酶法檢測小而密低密度脂蛋白膽固醇（small and dense low-density lipoprotein cholesterol，sd-LDL-C）水平來反映密度為1.044～1.063 g/m3、粒徑為22.0～25.5 nm的小而密低密度脂蛋白（small and dense low-density lipoprotein，sd-LDL）水平[3]。關于酶法與NMR檢測sd-LDL-C及血脂4項[總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）]的相關性尚未見報道。為此，本研究擬探討NMR與生化檢測方法（生化分析儀）檢測sd-LDL-C及血脂4項的相關性，并對LDL-C與低密度脂蛋白顆粒（low-density lipoprotein particle，LDL-P）不一致患者的sd-LDL-C水平進行分析。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選擇2019年8—9月泰達國際心血管病醫(yī)院門診患者54例，其中男28例、女26例，年齡（59.1±10.6）歲。54例患者中冠狀動脈粥樣硬化性心臟病34例，其中合并糖尿病11例、合并高血壓30例，有抽煙史13例，有飲酒史4例。

1.2 方法

分別用肝素抗凝管和乙二胺四乙酸二鉀（ethylenediaminetetraacetic acid-K2，EDTA-K2）抗凝管采集所有研究對象靜脈血7 mL，EDTA-K2抗凝血樣本（2 mL）1 700×g離心13 min，4 h內(nèi)分離血漿，取400 μL，-80 ℃凍存，統(tǒng)一采用AvanceⅢ IVDr核磁共振波譜儀（美國Bruker公司）及配套數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)檢測LDL的顆粒大小和濃度。肝素抗凝血樣本（5 mL）2 821×g離心5 min，分離血清，采用傳統(tǒng)生化檢測方法檢測sd-LDL-C、TC、TG、HDL-C和LDL-C水平，sd-LDL-C試劑盒（酶法）購自北京九強公司，LDL-C試劑盒（選擇保護法）、HDL-C試劑盒（抗體阻礙法）、TC試劑盒（酶法）和TG試劑盒（酶法）均購自日本和光公司，檢測儀器為LABOSPECT 008AS全自動生化分析儀（日本日立公司）。樣本采集過程嚴格參照我國衛(wèi)生行業(yè)標準WS/T 225—2016中的規(guī)定?；颊週DL-C水平盡可能分散并覆蓋高、中、低濃度范圍，高值、中值、低值分別占20%、20%、40%。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0和Excel 2007軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用配對樣本t檢驗。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用配對樣本秩和檢驗。采用Pearson相關分析評估2種方法的相關性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 傳統(tǒng)生化檢測方法與NMR血脂檢測結果的相關性

傳統(tǒng)生化檢測方法與NMR檢測sd-LDL-C、LDL-C、HDL-C、TG、TC的回歸方程分別為：Y=0.457X+5.893（r2=0.640，P=0.000），Y=0.719X+21.656（r2=0.827，P=0.000），Y=0.800X+13.552（r2=0.875，P=0.000），Y=0.947X-6.217（r2=0.996，P=0.000），Y=0.961X+20.726（r2=0.928，P=0.000）。

2.2 sd-LDL-C與LDL亞組分的相關性

傳統(tǒng)生化檢測方法檢測sd-LDL-C水平與NMR檢測LDL5-C、LDL4-C+LDL5-C+LDL6-C、LDL5-C+LDL6-C、LDL6-C水平呈正相關（r值分別為0.326、0.341、0.352、0.800，P<0.05），與NMR檢測LDL1-C、LDL2-C、LDL3-C、LDL4-C水平無相關性（r值分別為0.199、0.093、0.100、0.209，P>0.05）。

2.3 傳統(tǒng)生化檢測方法與NMR血脂檢測結果的比較

NMR檢測sd-LDL-C、LDL-C、HDL-C、TC水平與傳統(tǒng)生化檢測方法比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P=0.000），而TG水平2種檢測方法之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 傳統(tǒng)生化檢測方法與NMR血脂檢測結果的比較 mg/L

2.4 LDL-C與LDL-P不一致患者sd-LDL-C水平的比較

根據(jù)NMR的LDL-C和LDL-P檢測結果分別對54例樣本進行排序，并計算其百分位數(shù)。將LDL-C百分位數(shù)≥LDL-P百分位數(shù)的患者列為A組，LDL-C百分位數(shù)

表2 LDL-C與LDL-P不一致患者sd-LDL-C水平的比較mg/L

3 討論

冠心病（coronary heart disease，CHD）的發(fā)病與性別、年齡、血壓、血糖等因素有關。在諸多危險因素中，膽固醇是CHD的核心致病性危險因素，因此降低膽固醇是CHD的首要治療靶標。由于LDL的異質(zhì)性，檢測LDL-C無法有效評估致動脈粥樣硬化的膽固醇顆粒含量。sd-LDL-C可以有效反映LDL顆粒的異質(zhì)性，sd-LDL-C濃度越高，致動脈粥樣硬化能力越強[3]。美國膽固醇教育計劃（the National Cholesterol Education Program，NECP）和美國內(nèi)分泌協(xié)會已將sd-LDL-C納入主要動脈粥樣硬化心血管疾病風險因素中的附加危險因素，證據(jù)等級為D[4-5]。

酶法檢測sd-LDL-C結果與超速離心法具有良好的相關性[6]，重復性較好，適用于大批量檢測。酶法可在生化分析儀上檢測密度為1.044～1.063 g/mL的sd-LDL-C[7]。NMR支持同時測定包括葡萄糖、氨基酸、苯類、維生素、藥物、化妝品在內(nèi)的多種分析物，為分析一系列生物分子和代謝產(chǎn)物提供了有力的技術支持。NMR的原理是通過分析原子在磁場中共振特征的不同來定量檢測分子。目前，NMR被已應用于多種疾病，如阿爾茨海默癥、癌癥、糖尿病、炎癥及冠心病等外周血生物標志物的檢測[8]。由于傳統(tǒng)的血脂項目與冠狀動脈狹窄程度的關系不明確，因此需要通過檢測極低密度脂蛋白（verylow-density lipoprotein，VLDL）、中等密度脂蛋白（intermediate-density lipoprotein，IDL）、LDL和高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）的顆粒直徑及其亞組分的濃度，更全面地分析血脂與冠狀動脈狹窄的關系，而NMR可為相關血脂項目的檢測提供有力的支持。以往由于NMR需要特殊的算法，因此校準和驗證問題一直是臨床關注的焦點。有研究結果顯示，當遵循標準化的核磁共振測量協(xié)議時，實驗室之間的結果具有良好的重現(xiàn)性[9]。由于只有化學位移處于（0.7～0.9）×10-6的脂質(zhì)區(qū)域，并且包含甲基信號的物質(zhì)才可能對脂蛋白分析產(chǎn)生干擾，因此NMR不受如濁度等常見干擾因素的影響[10]。雖然NMR有很好的臨床應用價值，但其檢測儀器價格昂貴，目前尚難以在臨床推廣。

本研究結果顯示，傳統(tǒng)生化檢測方法與NMR檢測血脂項目的r2值由高到低依次為TG（0.996）、TC（0.928）、HDL-C（0.875）、LDL-C（0.827）、sd-LDL-C（0.640）。導致r2值不同的原因可能為：傳統(tǒng)生化檢測方法一般直接采用酶法檢測血清TG、TC水平，檢測HDL-C、LDL-C和sd-LDL-C時需先除去其他類型的脂質(zhì)，然后使用酶法檢測相應脂蛋白的膽固醇水平；NMR直接通過脂蛋白的共振特征來檢測其含量，準確程度較傳統(tǒng)生化檢測方法高，因此2種檢測方法檢測不同脂蛋白結果的相關性會出現(xiàn)差異。OTVOS等[11]比對了NMR與傳統(tǒng)生化檢測方法的血脂檢測結果，發(fā)現(xiàn)VLDL-TG、LDL-C、HDL-C項目2種方法的r值分別為0.98、0.91、0.93。JEYARAJAH等[12]的研究結果顯示，VLDL-TG、HDL-C項目NMR與傳統(tǒng)生化檢測方法的r值分別為0.978、0.959。本研究結果與文獻報道[11-12]基本一致。本研究還分析了LDL亞組分膽固醇水平與酶法檢測的sd-LDL-C水平的相關性，結果顯示LDL6-C與sd-LDL-C呈正相關（r=0.800，P<0.05），但相關性不高。原因可能為：首先，酶法檢測的sd-LDL-C是密度為1.044～1.063 g/m3，粒徑為22.0～25.5 nm的LDL[2]；NMR檢測的LDL6-C對應的是密度為1.044～1.060 g/m3，粒徑為18.3～19.1 nm的LDL[1]；2種檢測方法檢測的LDL密度基本一致，但粒徑有差異。其次，酶法檢測sd-LDL-C需先除去其他脂質(zhì)，然后再檢測相應的膽固醇水平，具有一定的模糊性；NMR直接通過相應脂蛋白的共振特征來檢測其水平，準確程度高于酶法。本研究結果顯示，傳統(tǒng)生化檢測方法與NMR檢測sd-LDL-C的回歸方程為Y=0.457X+5.893（r2=0.640，P=0.000）。脂蛋白顆粒的膽固醇含量在不同個體之間差異很大，并且通常取決于患者的代謝狀態(tài)[13]。因此，LDL-C水平與NMR檢測LDL-P的結果常不一致[14]。本研究根據(jù)NMR的LDL-C和LDL-P檢測結果分別計算54例患者各指標的百分位數(shù)。LDL-C百分位數(shù)≥LDL-P百分位數(shù)的患者LDL6-C、sd-LDL-C、LDL6-P水平均高于LDL-C百分位數(shù)

本研究尚有局限之處。首先，由于NMR對基質(zhì)中的劇烈變化較為敏感，離子強度和pH值的改變均會對脂質(zhì)信號的化學位移產(chǎn)生影響。因此，需在采血后4 h內(nèi)完成檢測。若實驗室無檢測條件，須在規(guī)定時間內(nèi)分離血漿，冷凍保存后送檢[19]。本實驗室將EDTA-K2抗凝血樣本在4 h內(nèi)離心并分離血漿，-80 ℃保存后統(tǒng)一送檢。在血漿樣本的保存及運輸過程中不能排除樣本凍融情況，因此可能會對NMR檢測結果的準確性產(chǎn)生一定的影響。其次，本研究為單中心研究，樣本量偏小，其結果可能存在一定的偏差，后續(xù)還將擴大樣本量進一步研究。

綜上所述，NMR與傳統(tǒng)生化檢測方法的血脂檢測結果有一定相關性。LDL-P與LDL-C水平不一致患者的sd-LDL-C水平有一定差異。目前，國內(nèi)外仍將LDL-C作為臨床降脂治療的靶標，但僅測定LDL-C不能很好地預測LDL-P與LDL-C不一致患者的心血管事件風險，此類患者發(fā)生心血管事件的風險往往會被低估，而檢測LDL-P、sd-LDL-C水平可有效反映此類患者的心血管事件風險，有助于指導臨床用藥。