致密細(xì)斑點(diǎn)型抗核抗體在系統(tǒng)性自身免疫性風(fēng)濕性疾病診斷中的意義

楊可可，吳俊淵，曹興建

（南通市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，南通 江蘇 226001）

近年來，自身免疫性疾病的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，且當(dāng)合并其他疾病時(shí)，患者的死亡率較高[1]。正常情況下，接觸自身抗原的免疫細(xì)胞克隆會(huì)被清除，這種情況被稱為免疫耐受。當(dāng)機(jī)體對(duì)這些自身反應(yīng)的免疫細(xì)胞克隆控制失敗時(shí)，就會(huì)發(fā)生自身免疫性疾病[2]。目前，臨床常見的自身免疫性疾病主要為系統(tǒng)性自身免疫性風(fēng)濕性疾病（systemic autoimmune rheumatic disease，SARD），包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、抗磷脂綜合征、干燥綜合征、皮肌炎[3]。自身免疫性疾病實(shí)驗(yàn)室診斷的主要依據(jù)為自身抗體檢測(cè)，包括自身抗體譜篩查和抗核抗體核型判斷。特定的抗核抗體類型和某些疾病的發(fā)生具有一定的相關(guān)性[4]?？购丝贵w常見的核型主要為核顆粒型、核均質(zhì)型、胞漿顆粒型、著絲點(diǎn)型、核點(diǎn)型、核膜型等。致密細(xì)斑點(diǎn)型近幾年已被列為抗核抗體檢測(cè)中必報(bào)的核型之一[5]。致密細(xì)斑點(diǎn)型核型特征為細(xì)胞分裂中期濃縮染色質(zhì)和分裂間期細(xì)胞核上分布著細(xì)小、均勻、一致的斑點(diǎn)顆粒[5]。本研究擬探討致密細(xì)斑點(diǎn)型抗核抗體的檢測(cè)方法及其對(duì)SARD的診斷價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年10月—2018年12月至南通市第一人民醫(yī)院門診就診或住院，疑似或確診為SARD的患者1 683例，其中男556例、女1 127例，年齡16～73歲。本研究中的SARD特指彌漫性結(jié)締組織病，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡606例、硬皮病67例、皮肌炎68例、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎252例、干燥綜合征690例，累及多系統(tǒng)、多器官（皮膚、關(guān)節(jié)、肌肉等）。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采集所有對(duì)象的血清或乙二胺四乙酸 、肝素抗凝血漿，避免使用嚴(yán)重脂血、黃疸、溶血及被污染的樣本。

1.2.2 抗核抗體檢測(cè) 抗核抗體（IgG）檢測(cè)試劑盒[間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence，IIF）]購自德國歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷有限公司。樣本的稀釋比例分別為1∶100、1∶320、1∶1 000，其他步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。1∶100稀釋：將5 μL血清加入495 μL PBST緩沖液（將10.2 g磷酸鹽溶于1 L蒸餾水中，再加入2 mL Tween-20配制而成）中。1∶320稀釋：將100 μL 1∶100稀釋的血清加入220 μL PBST緩沖液中。1∶1 000稀釋：將11.1 μL 1∶100稀釋血清加入100 μL PBST緩沖液中。鏡檢：在20倍鏡下判斷熒光滴度（1∶100、1∶320、1∶1 000），在40倍鏡下判斷抗核抗體核型。

1.2.3 自身抗體檢測(cè) 采用自身抗體譜（IgG）檢測(cè)試劑盒（免疫印跡法，德國歐蒙公司）檢測(cè)抗核糖核蛋白（nuclear ribonucleoprotein，nRNP）抗體、抗史密斯（Smith，Sm）抗體、抗天然干燥綜合癥A（Sj?gren syndrome A，SS-A）抗體、抗干燥綜合癥B（Sj?gren syndrome B，SS-B）抗體、抗Ro52抗體、抗硬皮病70（scleroderma-70，SCL-70）抗體、抗皮肌炎-系統(tǒng)性硬化癥（polymyositis-sclerosis，PM-Scl）抗體、抗組氨酰轉(zhuǎn)運(yùn)RNA合成酶（aminoacyl tRNA synthase，Jo-1）抗體 、抗著絲點(diǎn)蛋白B（centromere protein B，CENP-B）抗體、抗增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體、抗雙鏈DNA（double-stranded DNA antibody，dsDNA）抗體、抗核小體抗體（antinucleosome antibody，AnuA）、抗組蛋白抗體（anti-histone antibody，AHA）、抗核糖體P蛋白抗體（anti-ribosomal P protein antibody，ARPA）、抗線粒體M2抗體（anti-mitochondrial antibody subtype M2，AMA-M2），嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。結(jié)果判讀：將膜條用KEWB83014型掃描儀（日本Canon公司）掃描，掃描結(jié)果分為0、1、2、3、4、5、6共7個(gè)等級(jí)，對(duì)應(yīng)的血清IgG抗體水平分別為0～0.34、0.35～0.69、0.70～3.49、3.50～17.49、17.50～49.99、50.00～99.99和≥100.00 kU/L，以IgG抗體≥3.5 kU/L為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。致密細(xì)斑點(diǎn)型抗核抗體滴度與SARD的相關(guān)性分析采用秩相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IIF檢測(cè)抗核抗體與免疫印跡法檢測(cè)自身抗體的陽性率比較

分別采用IIF和免疫印跡法檢測(cè)1 683例患者樣本。IIF檢測(cè)抗核抗體的陽性率與免疫印跡法檢測(cè)自身抗體的陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 IIF檢測(cè)抗核抗體與免疫印跡法檢測(cè)自身抗體的比較

2.2 72例IIF陽性、免疫印跡法陰性樣本的核型分布

在7 2例I I F陽性、免疫印跡法陰性樣本中，核顆粒型所占比例最高，為44.44%（32/72），然后依次為致密細(xì)斑點(diǎn)型[40.28%（29/72）]、均質(zhì)型[12.50%（9/72）]、核仁型[2.78%（2/72）]。4種核型所占比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=36.333，P<0.001）。兩兩比較結(jié)果顯示，致密細(xì)斑點(diǎn)型所占比例與核顆粒型比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.148，P=0.701）；與均質(zhì)型、核仁型比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.526，P=0.001；χ2=23.516，P<0.001）。

2.3 致密細(xì)斑點(diǎn)型抗核抗體滴度與SARD的相關(guān)性分析

29例致密細(xì)斑點(diǎn)型抗核抗體中，熒光滴度為1∶100、1∶320、≥1∶1 000的分別有8例（27.59%）、17例（58.62%）、4例（13.79%），每個(gè)滴度對(duì)應(yīng)的SARD確診病例數(shù)分別為1例、5例、2例。秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，熒光滴度與SARD無相關(guān)性（r=-0.300，P=0.667）。

2.4 IIF和免疫印跡法均陽性樣本的核型分布

IIF和免疫印跡法均陽性的644例樣本的核型分別為核顆粒型、核均質(zhì)型、胞漿顆粒型、著絲點(diǎn)型、核點(diǎn)型、核膜型、核仁型、溶酶體型、高爾基體型、胞漿纖維型和PCNA型，未見致密細(xì)斑點(diǎn)型。核顆粒型所占比例最高（38.98%），其次是胞漿顆粒型（22.05%）。除了核點(diǎn)型和核膜型，每種核型都對(duì)應(yīng)著相應(yīng)的自身抗體?？筊o52抗體在多種核型中出現(xiàn)，未表現(xiàn)出特異性。見表2。

表2 IIF和免疫印跡法均陽性的644例樣本的核型分布

3 討論

本研究結(jié)果顯示，IIF和免疫印跡法檢測(cè)自身抗體結(jié)果的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。對(duì)IIF和免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本的核型進(jìn)行分析，在IIF陽性而免疫印跡法陰性的結(jié)果中，致密細(xì)斑點(diǎn)型值得關(guān)注。

美國風(fēng)濕病學(xué)協(xié)會(huì)將IIF作為抗核抗體篩查的“金標(biāo)準(zhǔn)”[6]。自從IIF的生物載片采用人喉癌細(xì)胞為基質(zhì)后，其方法學(xué)的靈敏度大大提高，但降低了特異性，導(dǎo)致健康人和非自身免疫性疾病患者的抗核抗體陽性率升高[7]。因此，在臨床工作中，除了用IIF篩查抗核抗體外，還應(yīng)采用特異性較強(qiáng)的免疫印跡法聯(lián)合檢測(cè)自身抗體。本研究結(jié)果顯示，IIF和免疫印跡法的陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；對(duì)于IIF陰性、免疫印跡法陽性的樣本，免疫印跡法結(jié)果大多為抗Ro52抗體可疑、弱陽性或陽性。有研究結(jié)果顯示，健康人群抗Ro52抗體也會(huì)出現(xiàn)陽性，因此僅抗Ro52抗體陽性與SARD關(guān)系不大，只有伴隨抗SS-A抗體出現(xiàn)時(shí)有一定提示意義[8]。本研究結(jié)果還顯示，抗Ro52抗體可在多種核型中出現(xiàn)，缺乏特異性；對(duì)于IIF陽性、免疫印跡法陰性的樣本，核顆粒型所占比例最高，其次是致密細(xì)斑點(diǎn)型，核均質(zhì)型和核仁型所占比例相對(duì)較低。核顆粒型是IIF抗核抗體檢測(cè)中最常見的核型，且低滴度的核顆粒型最常見[4]。本研究，32例核顆粒核型中有4例熒光滴度≥1∶1 000。這4例高滴度的核顆粒型又被稱為Ku顆粒型[5]。Ku顆粒型的核型特征為分裂中期染色質(zhì)為陰性，分裂期細(xì)胞的細(xì)胞核核質(zhì)均勻分布著分散的細(xì)顆粒，核仁陰性或陽性。與Ku顆粒型相關(guān)的疾病包括干燥綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮肌炎等彌漫性結(jié)締組織病[5]。由于本研究使用的免疫印跡法膜條中未包被Ku抗原，所以免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果為陰性。鑒于Ku顆粒型的陽性率較低，因此在IIF陽性、免疫印跡法陰性的樣本中，致密細(xì)斑點(diǎn)型最有價(jià)值。隨著致密細(xì)斑點(diǎn)型抗核抗體滴度的升高，SARD確診例數(shù)相應(yīng)增多，但秩相關(guān)分析結(jié)果顯示致密細(xì)斑點(diǎn)型抗核抗體的熒光滴度與SARD無相關(guān)性（r=-0.300，P=0.667）。由于本研究中致密細(xì)斑點(diǎn)型抗核抗體的陽性例數(shù)較少，因此其滴度與SARD的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

與致密細(xì)斑點(diǎn)型密切相關(guān)的自身抗體為轉(zhuǎn)錄激活因子p75，即晶狀體上皮細(xì)胞源性生長因子，相對(duì)分子質(zhì)量為75 000[9]。在研究的初期，研究者確認(rèn)這種自身抗體的相對(duì)分子質(zhì)量為7 0 0 0 0，因此致密細(xì)斑點(diǎn)型抗核抗體的靶抗原被稱為致密細(xì)斑點(diǎn)-70（dense fine speckle-70，DFS-70）。有≤10%的健康者會(huì)出現(xiàn)抗DFS-70抗體陽性，與自身免疫性疾病關(guān)系不大；但在纖維肌痛患者中，有關(guān)節(jié)痛的患者的抗DFS-70抗體水平高于其他患者（P=0.024）[10]。這說明抗DFS-70抗體可能與一小部分自身免疫性疾病有關(guān)。與抗DFS-70抗體一樣，致密細(xì)斑點(diǎn)型抗核抗體在自身免疫性疾病中也較少出現(xiàn)。有研究結(jié)果顯示，經(jīng)過4年的隨訪，40例致密細(xì)斑點(diǎn)型抗核抗體陽性的健康人均未發(fā)生自身免疫性疾病[11]。但在上述研究致密細(xì)斑點(diǎn)型抗核抗體和自身免疫性疾病相關(guān)性的報(bào)道中均未考慮抗體滴度。DELLAVANCE等[4]認(rèn)為低滴度的致密細(xì)斑點(diǎn)型抗核抗體一般出現(xiàn)在健康人群中，中、高滴度的致密細(xì)斑點(diǎn)型抗核抗體陽性一般伴隨著抗DFS-70抗體陽性；在致密細(xì)斑點(diǎn)型陽性的患者中，有86%的患者致密細(xì)斑點(diǎn)型的熒光滴度≥1∶640，免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示有98%的患者血清中存在抗DFS-70抗體[4]；在IIF和免疫印跡法均陽性的患者中，只有39%的患者患有自身免疫性疾病，其中自身免疫性甲狀腺炎占43.3%、系統(tǒng)性紅斑狼瘡占16.7%、多發(fā)性硬化癥占0.03%，與本研究結(jié)果類似。根據(jù)SARD的診斷指南，SARD患者常表現(xiàn)出中、高滴度的抗核抗體陽性，且有對(duì)應(yīng)的自身抗體陽性[12]。本研究結(jié)果顯示，644例IIF和免疫印跡法均陽性的樣本中包括SARD患者的樣本，但這644例樣本均未檢出致密細(xì)斑點(diǎn)型抗核抗體。

綜上所述，鑒于致密細(xì)斑點(diǎn)型抗核抗體與SARD無相關(guān)性，且644例2種方法均陽性的樣本中均未檢出致密細(xì)斑點(diǎn)型抗核抗體，因此致密細(xì)斑點(diǎn)型抗核抗體陽性可以用于排除SARD，有助于提高抗核抗體篩查對(duì)SARD診斷的特異性[13]。但每一種SARD疾病又有特征性的臨床表現(xiàn)和特異性自身抗體。在實(shí)際工作中，致密細(xì)斑點(diǎn)型很容易與普通核顆粒型混淆[13]，其判讀需要豐富的閱片經(jīng)驗(yàn)。另外，致密細(xì)斑點(diǎn)型抗核抗體陽性在日常工作中也較少見，本研究僅有29例，樣本量較小。此外，本研究采用IIF篩查抗核抗體，熒光強(qiáng)度判斷使用的是三系判斷法，即1∶100、1∶320、1∶1 000。與三系判斷法比較，五系判斷法（1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280）更詳細(xì)、更精確，因此本研究結(jié)果還有待于進(jìn)一步確認(rèn)。