細(xì)菌活細(xì)胞分離的HPLC研究

桂 亮，林 娟，劉樹(shù)滔

（1.安徽衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院 醫(yī)學(xué)系，安徽 池州 247099；2.福州大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108）

由于微生物體積小、分布廣和多樣性等生物學(xué)特點(diǎn)，使其在整個(gè)生命科學(xué)的發(fā)展中起著無(wú)可爭(zhēng)辯的關(guān)鍵作用[1]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，一系列微生物分離分析的新方法層出不窮，人類對(duì)微生物生命活動(dòng)的認(rèn)識(shí)也日趨豐富[2]。因此，打破傳統(tǒng)觀念的束縛，探求一種創(chuàng)新性的微生物形態(tài)學(xué)研究方法，快速準(zhǔn)確地分離鑒定微生物的生物學(xué)特性，是推進(jìn)微生物學(xué)乃至整個(gè)生命科學(xué)發(fā)展的重要因素[3-4]。

細(xì)菌是一類形體微?。ㄖ睆郊s0.5 μm，長(zhǎng)度約0.5～5 μm）、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的單細(xì)胞原核微生物。它們是在自然界分布最廣、個(gè)體數(shù)量最多的有機(jī)體，與大自然和人類有著密不可分的聯(lián)系，因此，也是最具有代表性的微生物類群。在特定的生理狀態(tài)下，不同細(xì)菌或同種細(xì)菌由于細(xì)胞表面物質(zhì)的化學(xué)基團(tuán)解離狀態(tài)不同，決定了其帶電荷的不同，因此可以使用高效液相離子交換色譜（HPLC）使不同吸附力的細(xì)菌依次被洗脫下來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)不同表面特性構(gòu)造的細(xì)菌的分離分析，并能對(duì)分離的細(xì)菌活細(xì)胞進(jìn)行再研究[5-6]。

鄭雪芳、邱丹騰等[7-8]利用高效離子交換色譜對(duì)單一細(xì)胞進(jìn)行了分離，但對(duì)混合細(xì)菌體系的HPLC研究較少。本研究將不同種屬細(xì)菌進(jìn)行色譜表征，對(duì)利用高效離子交換色譜分離細(xì)菌活細(xì)胞的分離條件進(jìn)行優(yōu)化，并探討如何對(duì)腸道混合菌株體系進(jìn)行色譜分離。

1 材料

1.1 菌株

大腸桿菌（Escherichia coli），植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），變形桿菌（Protens vulgaris），產(chǎn)氣桿菌（Enterobacter aerogenes）。

1.2 緩沖液

平衡緩沖液：0.02 mol/L哌嗪鹽酸緩沖液（pH7.0）。洗脫緩沖液：0.02 mol/L哌嗪鹽酸緩沖液（pH7.0）+1 mol/L NaCl。所用試劑均為分析純以上，所有色譜緩沖液用超純水配制，且經(jīng)0.22 μm孔徑的醋酸纖維素膜過(guò)濾。

1.3 儀器設(shè)備和材料

高效液相色譜儀（Beckman Golden System，美國(guó)Bechman公司），激光光散射儀（Dawn Eos Enhanced Optical System，美國(guó)Wyatt Technology 公司）、離心機(jī)（CF15RX，日本Hitachi公司）、超純水機(jī)（MILLI-Q，美國(guó)Millipore公司）、超凈工作臺(tái)（1285型，美國(guó)Thermo Forma公司）、光學(xué)顯微鏡（XSB-3，上海光學(xué)儀器廠）、強(qiáng)陰離子交換樹(shù)脂（Toyopearl TSKgel SuperQ-650C，日本Tosoh公司）。

2 方法

2.1 樣品的預(yù)處理

2.2.1 固體培養(yǎng)菌樣品的制備

將經(jīng)平板培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體，經(jīng)無(wú)菌操作，挑取菌落溶解于無(wú)菌水中，制備成菌懸液，漩渦充分振蕩均勻，調(diào)整至適合的菌濃[5]，即為色譜上樣品。

2.1.2 液體培養(yǎng)菌樣品的制備

菌體經(jīng)活化后，接種至相應(yīng)液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，于4 ℃，5 000 r/min下，離心10 min，取菌泥加入超純水，漩渦振蕩后，離心洗滌菌體，以除去殘余培養(yǎng)基，將兩次離心洗滌處理后的菌泥，加入適量超純水，漩渦振蕩均勻，調(diào)整至相應(yīng)的菌濃，即為上樣菌懸液。

2.2 高效離子交換色譜分析

色譜柱規(guī)格100 mm×7.6 mm，流速1 mL/min，室溫。采用高效液相色譜儀紫外檢測(cè)器和激光光散射儀串聯(lián)的在線雙檢測(cè)系統(tǒng)，跟蹤檢測(cè)細(xì)菌過(guò)柱情況。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，激光光散射儀檢測(cè)波長(zhǎng)為600 nm，信號(hào)倍增系數(shù)為1。整個(gè)HPLC色譜體系中的所有管路、部件先經(jīng)0.1 mol/L NaOH沖洗30 min，再經(jīng)無(wú)菌水、20%酒精溶液、無(wú)菌水依次沖洗，最后用無(wú)菌的緩沖液沖洗、平衡系統(tǒng)。

2.3 細(xì)菌色譜分離條件的優(yōu)化

2.3.1 pH值的優(yōu)化

選擇pH6.0、pH7.0兩個(gè)pH值的哌嗪-HCl緩沖液（0.02 mol/L），樣品上樣后，0～10 min經(jīng)平衡緩沖液平衡，使進(jìn)樣的細(xì)菌充分吸附到樹(shù)脂上；10～50 min線性梯度洗脫，洗脫梯度為0.05～0.7 mol/L NaCl；50～55 min洗脫梯度為0.7～1.0 mol/L NaCl；55～65 min完全轉(zhuǎn)換為洗脫緩沖液。對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)氣桿菌、變形桿菌、植物乳桿菌5種不同細(xì)菌進(jìn)行色譜分離效果的比較，以確定合適的緩沖液pH值。

2.3.2 流速的選擇

選擇pH7.0的哌嗪-HCl緩沖液（0.02 mol/L），洗脫梯度為：0～10 min，平衡緩沖液平衡，10～50 min，0.05～0.7 mol/L NaCl線性洗脫，50～60 min，完全轉(zhuǎn)換為洗脫緩沖液。選擇0.25 mL/min、0.5 mL/min、0.75 mL/min、1.0 mL/min、1.25 mL/min、1.5 mL/min、2.0 mL/min 7種不同流速，對(duì)醋化醋桿菌進(jìn)行色譜表征；選擇0.5 mL/min、0.75 mL/min、1.0 mL/min、1.5 mL/min、2.0 mL/min 5種不同流速，對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行色譜表征，比較兩種不同來(lái)源的細(xì)菌的分離效果，以確定最佳流速。

2.3.3 洗脫梯度的優(yōu)化

選擇pH7.0的哌嗪-HCl緩沖液（0.02 mol/L），以3種不同的洗脫梯度，對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)氣桿菌、變形桿菌、植物乳桿菌5種不同細(xì)菌進(jìn)行色譜分離效果的比較，確定最佳洗脫梯度。

梯度1：0～10 min平衡緩沖液平衡，10～ 50 min，0～1.0 mol/L NaCl線性洗脫，50～60 min，完全轉(zhuǎn)換為洗脫緩沖液。

梯度2：0～10 min平衡緩沖液平衡，10～50 min，0.05～0.7 mol/L NaCl線性洗脫，50～55 min，0.7～1.0 mol/L NaCl線性洗脫，55～65 min，完全轉(zhuǎn)換為洗脫緩沖液。

梯度3：0～10 min平衡緩沖液平衡，10～50 min，0.05～0.7 mol/L NaCl線性洗脫，50～60 min，完全轉(zhuǎn)換為洗脫緩沖液。

2.4 腸道菌的混合菌株分離表征

將固體培養(yǎng)18 h的大腸桿菌、變形桿菌及培養(yǎng)36 h的植物乳桿菌，無(wú)菌條件下，分別用接種環(huán)挑取適量菌泥，溶解于超純水中，漩渦振蕩均勻，制備成菌懸液。按一定比例將3種菌株混合均勻，對(duì)混合菌株進(jìn)行色譜表征。

2.5 顯微鏡檢驗(yàn)

用滅菌的離心管收集不同色譜峰組分，分別于4 ℃下12 000×g 離心5 min，收集沉淀；挑取少許沉淀涂片，0.01%的美蘭染色，油鏡（×100）下觀察。

3 結(jié)果與討論

3.1 pH值的優(yōu)化

緩沖液pH值，不僅決定了樣品各組分的有效分離，同時(shí)也直接影響細(xì)菌的生理活性和結(jié)構(gòu)。本課題選擇了pH6.0、pH7.0兩個(gè)最接近細(xì)菌生長(zhǎng)環(huán)境的pH值，對(duì)5種細(xì)菌進(jìn)行色譜分離效果的比較，以確定最合適的緩沖液pH值。

如圖1所示，當(dāng)pH為6.0時(shí)，色譜曲線除分離主峰外，還會(huì)出現(xiàn)小的雜峰，影響分離效果；從圖2可以看出，當(dāng)pH為7.0時(shí)，各種細(xì)菌的分離峰型較為對(duì)稱，形成尖銳的色譜峰。

圖1 pH6.0哌嗪-HCl緩沖液（0.02 mol/L）的分離效果比較

圖2 pH7.0哌嗪-HCl緩沖液（0.02 mol/L）的分離效果比較

分析不同pH條件下5種細(xì)菌的色譜峰保留時(shí)間（表1），當(dāng)pH為7.0時(shí)，所有細(xì)菌的保留時(shí)間較pH為6.0時(shí)均有所推遲，由于溶液pH大于細(xì)菌的等電點(diǎn)時(shí)，菌體表面帶負(fù)電荷，pH越高，菌體表面帶電量越大，與樹(shù)脂的吸附程度越強(qiáng)，因此保留時(shí)間也隨之延長(zhǎng)。綜合以上各因素考慮，選定緩沖液的pH值為7.0。

表1 不同pH條件下5種細(xì)菌的色譜峰保留時(shí)間

3.2 流速的選擇

高效離子交換色譜的分離方法，除考慮緩沖液鹽濃度、pH值等因素以外，選擇適合的流速是高效快速分離方法必不可少的因素。流速過(guò)小會(huì)導(dǎo)致整個(gè)分離時(shí)間延長(zhǎng)從而影響細(xì)菌生理狀態(tài)及分離效果，流速太大會(huì)影響細(xì)菌和樹(shù)脂結(jié)合度并縮短色譜柱的使用周期。本課題選擇了0.5 mL/min～2.0 mL/min一系列不同的流速，針對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行色譜表征，研究不同流速對(duì)分離效果的影響。

植物乳桿菌經(jīng)平板培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（32～36 h），無(wú)菌操作挑取少量菌，溶解于無(wú)菌水中，漩渦振蕩均勻，調(diào)整至適合菌濃，每次上樣量一致，以0.5 mL/min、0.75 mL/min、1.0 mL/min、1.5 mL/min、2.0 mL/min 5種不同流速分別進(jìn)行色譜分析，比較不同流速色譜分離效果（圖3）。

圖3 不同流速對(duì)植物乳桿菌分離效果的比較

如圖3所示，植物乳桿菌色譜峰呈現(xiàn)典型的對(duì)稱單峰，當(dāng)流速增加至1.5 mL/min時(shí)，在死時(shí)間附近開(kāi)始出現(xiàn)峰1；隨流速的增大，峰1面積有逐漸增大的趨勢(shì)。并且，色譜峰的保留時(shí)間隨流速的增加依次遞減。對(duì)植物乳桿菌色譜峰峰面積進(jìn)行積分，分析比較不同流速對(duì)峰面積的影響。

從表2可以得出結(jié)論，隨著流速逐漸地增大，植物乳桿菌在死體積附近逐漸形成色譜峰1，并且峰1面積比逐漸增大，導(dǎo)致峰2面積相應(yīng)減少。由色譜圖分析可知，流速太小，形成的色譜峰峰形較寬，影響分離效果；菌體在色譜柱上的保留時(shí)間增加，延長(zhǎng)了色譜分離時(shí)間；流速過(guò)大，影響菌體與離子交換樹(shù)脂的吸附程度，保留時(shí)間縮短。當(dāng)流速為1 mL/min時(shí)，出現(xiàn)對(duì)稱尖銳的色譜峰，保留時(shí)間也適中，因此，選擇1 mL/min的流速作為色譜分離的最適流速。

表2 不同流速下植物乳桿菌相應(yīng)峰面積比

3.3 洗脫梯度的優(yōu)化

洗脫梯度很大程度上決定了組分在離子交換色譜柱上的保留時(shí)間及分離度，因此，確立良好的洗脫梯度是分離效果的保證。圖4、圖5、圖6分別為3種不同的洗脫梯度對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)氣桿菌、變形桿菌、植物乳桿菌5種不同細(xì)菌的色譜分離效果比較。

圖4 梯度1洗脫

圖5 梯度2洗脫

圖6 梯度3洗脫

由圖4、圖5、圖6可以看出，相同的洗脫時(shí)間內(nèi)，0～1.0 mol/L NaCl線性洗脫比0.05～0.7 mol/L NaCl線性洗脫的梯度更快，從表3結(jié)果來(lái)看，5種細(xì)菌的保留時(shí)間比較在梯度1時(shí)比在梯度2時(shí)更接近，因此，相對(duì)較緩的梯度，可以提高各組分的分離度。梯度3對(duì)梯度2進(jìn)行改進(jìn)，減少了0.7～1.0 mol/L NaCl線性洗脫5 min的步驟，對(duì)比兩個(gè)梯度分離色譜圖，55～65 min過(guò)程中，5種細(xì)菌均未出現(xiàn)洗脫峰，說(shuō)明各組分在0.05～0.7 mol/L NaCl線性洗脫過(guò)程中，已經(jīng)全部洗脫下來(lái)，為縮短梯度時(shí)間，提高分離效率，選用梯度3：0～10 min平衡緩沖液平衡，10～50 min，0.05～0.7 mol/L NaCl線性洗脫，50～60 min，完全轉(zhuǎn)換為洗脫緩沖液，作為最佳分離梯度。

表3 不同洗脫梯度條件下5種細(xì)菌的色譜峰保留時(shí)間

3.4 腸道菌的混合菌株分離表征

腸道菌群是一個(gè)極其復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，對(duì)宿主的營(yíng)養(yǎng)與健康有著重要的影響。傳統(tǒng)的檢測(cè)腸道微生物技術(shù)主要是通過(guò)微生物的選擇性培養(yǎng)，或者靠直接形態(tài)觀察來(lái)獲得部分信息，再進(jìn)行鑒定和分類[9-11]。分子生物學(xué)、免疫學(xué)等新技術(shù)等應(yīng)用不依賴純培養(yǎng)的分子生態(tài)學(xué)方法及分子工具，能大大擴(kuò)展對(duì)腸道分離物的鑒定能力[12-13]，這些方法在為腸道菌群檢驗(yàn)帶來(lái)高特異性，但無(wú)法對(duì)細(xì)菌細(xì)胞回收以用于進(jìn)一步的形態(tài)、生理和生化研究，無(wú)法真實(shí)全面地反映腸道菌群的生存狀態(tài)。

大腸桿菌、變形桿菌、植物乳桿菌生存于人類和動(dòng)物的腸道，為人體內(nèi)的正常菌相[14-15]。為研究腸道細(xì)菌活細(xì)胞的色譜分離分析，采用確定的色譜條件對(duì)大腸桿菌、變形桿菌、植物乳桿菌3種菌株組成的腸道菌混合菌株進(jìn)行色譜表征，見(jiàn)圖7。單菌株和混合菌株的色譜峰保留時(shí)間見(jiàn)表4。

圖7 純培養(yǎng)菌株的混合色譜分離表征

表4 單菌與混合菌株色譜峰保留時(shí)間對(duì)比

收集各色譜峰組分離心，取沉淀，按方法2.5進(jìn)行顯微鏡觀察。結(jié)果如圖8所示。

圖8 各色譜峰鏡檢圖

變形桿菌、大腸桿菌及植物乳桿菌組成的腸道菌的混合菌株進(jìn)行色譜表征，可以得到效果較好的分離，混合菌株的色譜保留時(shí)間與單菌保留時(shí)間基本一致（表4）。色譜峰2、3組分比較接近是由于植物乳桿菌和大腸桿菌的色譜保留時(shí)間相近，要實(shí)現(xiàn)完全分離需在后續(xù)研究中進(jìn)一步優(yōu)化色譜分離條件。通過(guò)對(duì)各色譜峰顯微鏡檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)（圖8），HPLC法對(duì)不同表面構(gòu)造的細(xì)菌活細(xì)胞實(shí)現(xiàn)分離后，可對(duì)各色譜峰中細(xì)菌進(jìn)行回收，且細(xì)菌形態(tài)并無(wú)明顯變化。因此，利用高效離子交換色譜用于分離分析活菌細(xì)胞，不僅具有良好的分離效果，還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌活細(xì)胞進(jìn)行下一步的形態(tài)研究和生理、生化分析，是一種快速、準(zhǔn)確、使用的分離檢測(cè)方法。

4 結(jié)論

確立了高效離子交換色譜分離細(xì)菌活細(xì)胞的最佳色譜條件：采用Toyopearl TSKgel SuperQ-650C強(qiáng)陰離子交換樹(shù)脂、pH7.0、0.02 mol/L的哌嗪-HCl，洗脫鹽濃度為1 mol/L NaCl、洗脫梯度為：0～10 min平衡緩沖液平衡，10～50 min，0.05～0.7mol/L NaCl線性洗脫，50～60 min，完全轉(zhuǎn)換為洗脫緩沖液、流速1 mL/min；同時(shí)應(yīng)用高效離子交換色譜方法分離3種純培養(yǎng)的腸道菌的混合菌株懸液，得到了較好的分離效果，具有良好的穩(wěn)定性和廣泛的實(shí)用性，為進(jìn)一步研究微生態(tài)體系中混合菌株的數(shù)量變化及其相互作用奠定了基礎(chǔ)。