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    豌豆寡肽對飲食誘導(dǎo)的高血壓大鼠血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性及腸道菌群調(diào)節(jié)效果評價

    2021-07-29 03:26:58陳炫宏董雷超南希駿孫婉婷周泉城
    食品科學(xué) 2021年13期
    關(guān)鍵詞:灌胃菌群血脂

    陳炫宏,嵇 威,董雷超,南希駿,王 猛,孫婉婷,王 賽,周泉城,*

    (1.山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院,山東 淄博 255000;2.山東省食品快速分析技術(shù)工程實(shí)驗室,山東 淄博 255049)

    高血壓(hypertension,HTN)是一種以體循環(huán)動脈血壓增高為主要特征的臨床綜合征[1]。1958—2015年間全國HTN抽樣調(diào)查結(jié)果顯示,我國成年人HTN總患病率逐年升高趨勢明顯[2]。并且HTN還可引發(fā)其他并發(fā)癥,其中以腦卒中和心肌梗死最為常見,嚴(yán)重威脅著我國居民的健康[3]。隨著對HTN研究的不斷深入,已有研究證明血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)與HTN的形成有重要聯(lián)系[4],ACE的主要作用是催化血管緊張素I(angiotensin I,Ang I)轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)收縮血管作用的Ang II,從而使心肌收縮力增強(qiáng),造成血壓升高[5]。此外,HTN還可能與腸道微生物有關(guān)[6],多項對HTN大鼠腸道菌群的研究表明,HTN組大鼠腸道菌群的混亂度、豐富度和多樣性等與正常大鼠相比均會發(fā)生顯著變化[7-9]。

    近年來,越來越多的研究表明可食用的植物源蛋白酶解液對HTN具有一定的治療效果,朱玲[10]研究發(fā)現(xiàn)豌豆蛋白酶解液具有抑制ACE活性的作用,其中含有2~4 個氨基酸的寡肽效果最好,但未指明其抑制ACE的寡肽組成及與ACE的作用方式。為探明豌豆寡肽(Val-Glu-Pro-Gln,VGPG)對HTN的調(diào)節(jié)效果及作用方式,本研究在VGPG與ACE分子對接作用機(jī)制研究的基礎(chǔ)上,對其調(diào)節(jié)HTN大鼠的血壓、血液中血脂、ACE含量以及腸道菌群相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測定,分析VGPG在HTN調(diào)節(jié)過程中與ACE活性、腸道菌群之間的關(guān)系,旨在闡明VGPG對飲食引起的HTN的作用規(guī)律和機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 動物、材料與試劑

    雄性Wistar大鼠(8 周齡、體質(zhì)量(200±20)g)由濟(jì)南金豐實(shí)驗動物有限公司提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK(魯)2014-0007。配套標(biāo)準(zhǔn)飼料與墊料由濟(jì)南金豐實(shí)驗動物有限公司提供。

    VGPG 杭州肽佳生物科技有限公司;非洛地平緩釋片 合肥立方制藥股份有限公司;馬尿酰組胺酰亮氨酸(N-hippuryl-His-Leu hydrate,HHL)、ACE美國Sigma公司;食用鹽 湖北長舟鹽化有限公司;總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、游離脂肪酸(free fatty acid,F(xiàn)FA)、脂蛋白a(lipoprotein(a),Lp(a))、ACE免疫分析試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司;乙酸乙酯、D-果糖 上海愛純生物科技有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    ZH-HX-Z型無創(chuàng)尾動脈血壓測量分析系統(tǒng) 安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司;精密分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;MULtiskan型酶標(biāo)儀 北京澎昆博遠(yuǎn)科貿(mào)發(fā)展有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 分子對接

    1.3.1.1 受體結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備

    ACE蛋白結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(protein data bank,PDB)中獲取,PDB代碼為1O8A[11]。對蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行加氫處理,并將處理后的結(jié)構(gòu)作為分子對接的初始模型,采用AutoDockTools 1.5.6軟件進(jìn)行處理,保存蛋白原有電荷,并生成pdbqt文件用于對接。

    1.3.1.2 配體結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備

    構(gòu)建多肽分子VGPG的三維結(jié)構(gòu),多肽N端為纈氨酸,C端為谷氨酰胺。由于實(shí)驗條件pH值為7.4,因此VGPG的N端被質(zhì)子化,采用MOPAC程序[12]優(yōu)化分子結(jié)構(gòu),計算PM3原子電荷[13],采用AutoDock Tools 1.5.6軟件處理配體結(jié)構(gòu),生成相應(yīng)的pdbqt文件用于后續(xù)對接。

    1.3.1.3 分子對接

    分子對接采用AutoDock 4.2.6軟件包[14]實(shí)現(xiàn),設(shè)定1O8A晶體結(jié)構(gòu)中Zn2+所在的位置為活性位點(diǎn),將多肽VGPG對接到活性位點(diǎn),對接盒子的中心坐標(biāo)設(shè)為(36.99,41.25,43.45),XYZ各方向的格點(diǎn)數(shù)設(shè)為80×60×60 個,格點(diǎn)間距為0.375 ?,對接次數(shù)為100 次,其余參數(shù)采用默認(rèn)值。

    1.3.1.4 分子對接結(jié)果優(yōu)化

    分子對接的結(jié)果在空間結(jié)構(gòu)上可能存在不合理的原子接觸,可以采用能量優(yōu)化的方法對這些作用力進(jìn)行釋放,使其更趨于穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。能量優(yōu)化采用Amber14力場[15],優(yōu)化過程分兩步進(jìn)行:先進(jìn)行5 000 步的最陡下降法優(yōu)化,再用5 000 步的共軛梯度法對結(jié)構(gòu)進(jìn)一步優(yōu)化,將最終的結(jié)果作為后續(xù)分析的模型。

    1.3.2 體外ACE抑制率及酶促動力學(xué)分析

    體外ACE抑制率實(shí)驗參考吳建平等[16]的方法并稍作修改,樣品采用不同純度(70%、85%、98%)、不同質(zhì)量濃度(0.85、1.7、3.4、6.8、12.8 mg/mL)的VGPG。實(shí)驗在1.5 mL的離心管中進(jìn)行,每次測定體系的總體積為0.2 mL:含50 mmol/L pH 8.3磷酸鹽緩沖液、300 mmol/L NaCl、5 mmol/L HHL、20 μL 0.2 mg/mL的樣品。在37 ℃恒溫水浴保溫5 min,然后加入酶液(0.1 U溶于1 mL相同緩沖液中)啟動反應(yīng),恒溫保持30 min后,加入0.2 mL 1 mol/L HCl溶液終止反應(yīng),再加入1.0 mL冷凍后的乙酸乙酯,均勻混合15 s,3 500 r/min離心5 min,取出0.8 mL乙酸乙酯層轉(zhuǎn)入另一試管中,在90 ℃的烘箱中烘干1 h,再將其重新溶于0.8 mL去離子水中,在228 nm波長處測定光密度值。單位酶活力定義為在37 ℃、1 min內(nèi)催化HHL形成1 μmol馬尿酸所用酶量。抑制率按公式(1)進(jìn)行計算。

    式中:OD1為不存在抑制劑時的光密度值;OD2為抑制劑與酶共同存在時的光密度值;OD0為抑制劑與酶都不存在時的光密度值。

    酶促動力學(xué)實(shí)驗參考Chen Jiali等[17]的實(shí)驗方法并稍作修改,固定ACE質(zhì)量濃度(0.5 mg/mL)不變,分別以不同濃度(0.81、1.62、2.44、3.24、6.48 mmol/L)HHL為底物,并分別添加質(zhì)量濃度為0.85、3.4、12.8 mg/mL的VGPG(純度均為98%),同時設(shè)空白對照組(不添加VGPG),37 ℃保溫準(zhǔn)確反應(yīng)10 min。測定ACE的酶促反應(yīng)速率(V),平行測定3 次,通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法,以1/V-1/[S]作圖,并按米氏雙倒數(shù)方程(公式(2))計算最大酶促反應(yīng)速率(Vmax)和米氏常數(shù)(Km),根據(jù)其結(jié)果判斷VGPG對ACE的抑制作用類型。

    式中:υ為產(chǎn)物生成速率/(μg/min);Km為米氏常數(shù)/(mmol/L);[S]為底物濃度/(mmol/L);Vmax為最大反應(yīng)速率/(μg/min)。

    1.3.3 高鹽、高糖誘導(dǎo)Wistar大鼠HTN模型的建立與分組

    本研究模擬自然人群HTN形成過程[18-19],對大鼠給予含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaCl的高鹽飲食和含質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%果糖的高糖飲水。采用大鼠血壓心率測定儀每天測壓,并進(jìn)行持續(xù)1 周的尾部預(yù)溫和環(huán)境適應(yīng)訓(xùn)練(將大鼠固定好后等待20 min,使大鼠心率穩(wěn)定后進(jìn)行測定),至連續(xù)3 d血壓收縮壓大于140 mmHg并穩(wěn)定,則視為建模成功。

    對建模成功HTN大鼠進(jìn)行分組,分別為模型組(標(biāo)記M,生理鹽水質(zhì)量濃度9 g/L)、對照組(標(biāo)記C,非洛地平緩釋片質(zhì)量濃度0.5 mg/mL)、VGPG高劑量組(質(zhì)量濃度50 mg/mL)、VGPG中劑量組(質(zhì)量濃度25 mg/mL)、VGPG低劑量組(質(zhì)量濃度12.5 mg/mL),同時設(shè)立正常組(標(biāo)記Z,生理鹽水質(zhì)量濃度9 g/L),每組6 只,灌胃劑量5 mL/kgmb,每隔3 d測血壓、稱質(zhì)量,灌胃實(shí)驗持續(xù)3 周。

    1.3.4 大鼠血清中ACE活性、血脂指標(biāo)濃度以及臟器指數(shù)的測定

    血清中ACE活力、血脂指標(biāo)濃度測定:各組經(jīng)3 周灌胃實(shí)驗后,采用眼眶取血法采血,室溫靜置1 h自然凝固,平衡后3 000 r/min離心10 min,取上清液參照試劑盒說明書測定ACE活力及其他血脂指標(biāo)(TC、TG、LDL-C、HDL-C、LP(a)、FFA)濃度。

    臟器指數(shù)測定:灌胃實(shí)驗結(jié)束后解剖大鼠,取出脾臟、腎臟,用濾紙吸干殘血后,分別稱其質(zhì)量作為相應(yīng)臟器指數(shù)。

    1.3.5 大鼠腸道菌群相關(guān)指標(biāo)測定

    3 周灌胃實(shí)驗結(jié)束后處死大鼠并將其解剖,之后在無菌環(huán)境下取大鼠腸道糞便貯于滅菌EP管中并密封保存,置于液氮中備用。后將樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行腸道菌群α-多樣性分析、菌群群落分析、Heatmap分析。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,Origin 2018軟件作圖,實(shí)驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,顯著性分析采用單因素方差分析法,差異性顯著水平P<0.05。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 VGPG與ACE的結(jié)合模式分析

    通過將VGPG對接到ACE的活性位點(diǎn),可以深入研究二者的結(jié)合模式。分子對接得到的結(jié)合能為-26.03 kJ/mol,對接結(jié)果如圖1所示,可以看出多肽分子VGPG能夠結(jié)合在ACE的活性位點(diǎn),并且由于VGPG結(jié)構(gòu)中具有較多的氫鍵供體和受體,與ACE活性位點(diǎn)的氨基酸殘基形成了較強(qiáng)的親水相互作用。因此,分子對接結(jié)果初步表明,VGPG能夠與ACE結(jié)合并具有較強(qiáng)的親和力,其中氫鍵相互作用可能對于二者的結(jié)合具有重要的貢獻(xiàn)。

    圖1 VGPG分子結(jié)構(gòu)(A)及VGPG與ACE活性位點(diǎn)的結(jié)合(B)Fig. 1 Molecular structure of VGPG (A) and binding of VGPG to the active site of ACE (B)

    VGPG與ACE結(jié)合模式如圖2所示。參與二者結(jié)合的氨基酸殘基主要有Ala356、Pro407、Val518、Arg522、Tyr523以及Zn2+,其中VGPG與Ala356和Arg522能夠形成氫鍵,而VGPG的C末端羧基與Zn2+形成了金屬配位鍵,從而起到抑制ACE作用,這與Cheung等[20]的研究結(jié)果一致。表明VGPG主要通過氫鍵作用以及與Zn2+的配位作用與ACE的活性位點(diǎn)結(jié)合,對ACE起競爭性抑制作用,從而抑制ACE的活性。

    圖2 VGPG與ACE的結(jié)合模式Fig. 2 Binding pattern of VGPG to ACE

    2.2 VGPG對ACE抑制率及酶促動力學(xué)分析結(jié)果

    由圖3A及表1可知,VGPG在不同質(zhì)量濃度下的Lineweaver-Burk倒數(shù)圖為近似相交于Y軸的一組直線,其中截距1/Vmax約為1.58 min/μg,Km隨著VGPG質(zhì)量濃度的增大而增大,表明其對ACE的抑制模式為競爭性抑制。

    表1 VGPG對ACE抑制作用的Lineweaver-Burk曲線方程Table 1 Lineweaver-Burk curve equations of VGPG at different concentrations for ACE inhibition

    由圖3B VGPG對ACE體外抑制實(shí)驗結(jié)果可知,不同純度VGPG對ACE的抑制率具有明顯差異。VGPG純度70%、85%、98%的半抑制質(zhì)量濃度分別為2.30、1.15、0.75 mg/mL,表明VGPG的純度越高對ACE的抑制效果越好,兩者呈正相關(guān)關(guān)系。此外,在相同純度下,隨著VGPG質(zhì)量濃度的增加,其對ACE的抑制率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,且當(dāng)VGPG純度為98%、質(zhì)量濃度為3.4 mg/mL時抑制率最大,達(dá)到77.4%,與Nawaz等[21]所制備的酶解豌豆肽研究結(jié)果相似。這是由于當(dāng)VGPG質(zhì)量濃度較低時,隨著濃度升高,VGPG競爭結(jié)合ACE活性位點(diǎn)能力提高,從而對ACE抑制效果顯著提升;而當(dāng)VGPG質(zhì)量濃度較高時,由于ACE活性位點(diǎn)處結(jié)合的VGPG達(dá)到飽和,VGPG的競爭結(jié)合ACE活性位點(diǎn)能力降低,并且由于VGPG的結(jié)構(gòu)中含有較多的氫鍵供體和受體,其在高質(zhì)量濃度下會通過靜電作用相互影響,從而表現(xiàn)出對ACE抑制效果增長緩慢甚至是下降現(xiàn)象。這與前文VGPG對ACE分子結(jié)合模式為競爭性抑制作用的結(jié)論一致。

    圖3 VGPG的酶促動力學(xué)(A)和不同純度VGPG對ACE抑制率(B)Fig. 3 Enzymatic kinetics of VGPG (A) and inhibitory rates of ACE by VGPG of different purities (B)

    2.3 VGPG對HTN大鼠血壓和體質(zhì)量的影響

    如圖4所示,在HTN模型建立期間,Z組大鼠血壓維持在100~120 mm Hg之間,其余實(shí)驗組大鼠的血壓明顯上升并維持在140 mm Hg以上,證明HTN模型建造成功。同時,Z組大鼠在持續(xù)灌胃期間血壓穩(wěn)定,表明實(shí)驗室飼養(yǎng)環(huán)境對大鼠血壓無明顯影響。藥物干預(yù)后,灌胃實(shí)驗結(jié)束時C組大鼠血壓明顯降低,與治療前相比血壓降低了19.0%;VGPG各劑量組血壓也有不同程度的下降,其中VGPG中劑量組下降程度最大,達(dá)到15.8%,低劑量組與高劑量組分別下降11.6%和9.3%。說明中劑量的VGPG降壓效果最好,與圖3B體外模擬抑制實(shí)驗結(jié)果相印證,表明降壓效果不是單純地隨著VGPG質(zhì)量濃度的提高而提升,間接證明VGPG是通過競爭性抑制ACE活性的方式來降低血壓。

    圖4 VGPG對HTN大鼠血壓的影響Fig. 4 Effect of VGPG on blood pressure of HTN rats

    由圖5可知,在整個持續(xù)灌胃期間M組大鼠體質(zhì)量持續(xù)增加,并且顯著高于Z組,C組與VGPG各劑量組同樣顯著上升,符合高鹽高糖飲食所致HTN患者的生理特征[22],間接證明了實(shí)驗建模成功。在給予非洛地平緩釋片與VGPG后,與灌胃實(shí)驗開始時相比,C組與VGPG各劑量組大鼠體質(zhì)量在灌胃期間均呈現(xiàn)不同程度的下降,灌胃結(jié)束時下降幅度為VGPG中劑量組最高,達(dá)到10.3%;C組次之,達(dá)到5.4%。這與對應(yīng)各組大鼠血壓變化趨勢相似,表明HTN對體質(zhì)量具有一定的影響,且VGPG有助于緩解由于高鹽高糖飲食所導(dǎo)致的肥胖,對降低血壓具有積極作用。

    圖5 VGPG對HTN大鼠體質(zhì)量的影響Fig. 5 Effect of VGPG on body mass of HTN rats

    2.4 VGPG對HTN大鼠血清ACE活力的影響

    如圖6所示,M組HTN大鼠血清中ACE活力最高,達(dá)到897 mU/mg,而Z組大鼠血清中ACE活力為511 mU/mg,兩者之間具有顯著差異(P<0.05),表明血清中ACE活力顯著增加是誘發(fā)HTN的一個重要因素[23]。與Z組相比,C組大鼠血清中ACE活力無顯著差異(P>0.05),同時VGPG各劑量組大鼠血清中ACE活力與Z、M組相比具有顯著差異(P<0.05),其中VGPG中劑量組與正常大鼠ACE活力最為接近,證明通過抑制大鼠血清中ACE活力是VGPG降壓的一條途徑,且中劑量的VGPG抑制效果最好。

    圖6 VGPG對HTN大鼠血清ACE活力的影響Fig. 6 Effect of VGPG on ACE activity in serum of HTN rats

    2.5 VGPG對HTN大鼠血清中血脂的影響

    由表2可知,M組較Z組血脂中各項指標(biāo)均發(fā)生不同程度的變化,6 項血脂濃度均低于Z組;C組大鼠血脂中HDL-C、LP(a)、LDL-C濃度與Z組之間無顯著差異(P>0.05),TG濃度顯著低于Z組而高于M組,TC、FFA濃度高于Z組(P<0.05),表明藥物對血脂變化有積極作用,這與文獻(xiàn)[24]報道一致;與Z組相比,VGPG中、低劑量組大鼠血脂中TG、FFA濃度具有顯著差異(P<0.05),VGPG中劑量組大鼠血脂中其余成分與Z組相比無顯著差異(P>0.05),其變化趨勢與C組相似,表明VGPG與HTN藥物對血脂成分的影響作用效果相似。值得注意的是,VGPG各劑量組中VGPG中劑量組的血脂各項指標(biāo)濃度相較于其他兩組與Z組更為接近,因此,中劑量的VGPG對大鼠HTN調(diào)節(jié)具有更好的效果,而且VGPG對于大鼠HTN的作用效果并不是單純隨著濃度的升高而增加,這與前文的研究結(jié)果相同。

    表2 HTN大鼠血脂組成成分濃度Table 2 Blood lipid levels in HTN rats

    2.6 VGPG對HTN大鼠臟器指數(shù)的影響

    由表3可知,M組HTN大鼠的脾臟指數(shù)顯著高于Z組(P<0.05),VGPG低、高劑量組脾臟指數(shù)與M組無顯著差異,C組、VGPG中劑量組脾臟指數(shù)與Z組無顯著差異(P>0.05);對腎臟指數(shù)而言,各組相對Z組均顯著降低(P<0.05),但其中VGPG中劑量組腎臟指數(shù)與Z組最為接近。結(jié)果表明,HTN會對腎臟、脾臟器官產(chǎn)生一定的影響,而VGPG對此具有一定的治療和調(diào)節(jié)作用,且中劑量的VGPG效果最好,與文獻(xiàn)[25]報道一致。

    表3 VGPG對HTN大鼠臟器指數(shù)的影響Table 3 Effect of VGPG on spleen and kidney indices in HTN rats

    2.7 VGPG對大鼠腸道菌群的影響

    2.7.1α-多樣性分析結(jié)果

    對大鼠腸道菌群進(jìn)行物種α-多樣性分析,結(jié)果如圖7所示。M組Sobs指數(shù)較Z組顯著降低,表明由高鹽高糖引發(fā)的HTN會降低腸道菌群的多樣性,這與文獻(xiàn)[26]研究結(jié)果一致;對大鼠給予非洛地平緩釋片與VGPG治療后,C組菌群豐富度有顯著提升,說明藥物對腸道菌群的多樣性具有顯著影響;VGPG低、中劑量組菌群豐富度顯著高于M組,分別高出122.7%、51.1%,且菌群豐富度隨著VGPG質(zhì)量濃度的增加而呈現(xiàn)明顯下降趨勢,說明較低質(zhì)量濃度的VGPG有利于菌群生長,但質(zhì)量濃度太高則會選擇性地導(dǎo)致某些腸道菌群減少或消失,且這種作用隨VGPG質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)。需要注意的是,盡管VGPG低劑量組糞便菌群豐富度最高,但VGPG中劑量組豐富度與Z組最為接近,表明中劑量的VGPG具有改善因HTN而造成的菌群豐富度與多樣性下降的能力,從而使腸道菌群微環(huán)境維持在正常范圍之內(nèi),進(jìn)而起到降壓的效果。

    圖7 大鼠腸道菌群Sobs指數(shù)Fig. 7 Sobs index of intestinal flora in rats

    如圖8A所示,Sobs稀釋曲線趨于平緩,說明測序數(shù)據(jù)達(dá)到飽和,能夠覆蓋大鼠腸道微生物組群落的絕大部分物種。且Sobs指數(shù)中C組最高,之后依次為VGPG低劑量組、VGPG中劑量組、Z組,M組與VGPG高劑量組Sob指數(shù)均低于正常大鼠,VGPG中劑量組與Z組最接近,表明其與正常大鼠的菌群豐富度最相似。

    圖8 大鼠腸道菌群稀釋曲線(A)和Shannon曲線(B)Fig. 8 Rarefaction curve (A) and Shannon (B) curves of intestinal flora in rats

    Shannon指數(shù)能夠反映菌群的多樣性[27],由圖8B可知,M組相較于Z組,多樣指數(shù)明顯降低,說明HTN會降低腸道菌群的多樣性;C組與Z組相近,說明藥物基本不會影響腸道菌群的多樣性;VGPG低劑量組與中劑量組HTN大鼠腸道菌群的多樣性與Z組接近,而高劑量組明顯低于Z組。表明由高鹽高糖所引發(fā)的HTN會明顯改變生物腸道中菌群的豐富度與多樣性,低、中劑量的VGPG對HTN患者腸道菌群有一定的改善作用。

    2.7.2 門水平上大鼠腸道菌群群落分析結(jié)果

    目前已有研究表明厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)之比(F/B)可以反映腸道菌群紊亂程度[8]。由圖9可知,Z組、M組、C組、VGPG高劑量組、VGPG中劑量組、VGPG低劑量組F/B分別為3.27、0.65、5.89、4.54、4.88、6.24。M組腸道菌群的紊亂程度最低,而VGPG低劑量組最高。其原因可能是由于通過高糖高鹽飲食所引發(fā)的HTN會使腸道中菌群的豐富度降低,從而使HTN大鼠腸道菌群的紊亂程度相對降低,同時也表明藥物會增加腸道菌群的紊亂程度,對其造成不良影響。結(jié)合Heatmap圖(圖10)進(jìn)行樣本聚類分析,在門水平上大鼠腸道各菌群分布M組與Z組差別最大,VGPG劑量組中1組與Z組最為接近,證明VGPG對HTN大鼠腸道菌群具有改善效果。

    圖9 門水平大鼠腸道菌群群落分析Fig. 9 Intestinal flora community analysis of rats at the phylum level

    圖10 門水平大鼠腸道菌群Heatmap圖Fig. 10 Heatmap of the intestinal flora of rats at the phylum level

    2.7.3 科水平上大鼠腸道菌群群落分析結(jié)果

    如圖11、12所示,在科水平上,與Z組相比,M組中產(chǎn)短鏈脂肪酸菌科(Prevotellaceae)所占比例明顯上升,產(chǎn)乙酸、丁酸等菌科(Lachnospiraceae)所占比例明顯下降,存在腸道菌群失衡現(xiàn)象。表明HTN大鼠腸道菌群中產(chǎn)短鏈脂肪酸細(xì)菌數(shù)量增加,而產(chǎn)乙酸、丁酸細(xì)菌數(shù)量減少,這與文獻(xiàn)[8]的研究結(jié)果相同。腸道菌群與血脂成分分析結(jié)果表明,腸道微生物影響血壓的機(jī)制之一可能是通過其分泌物(如短鏈脂肪酸等)影響大鼠血脂成分,進(jìn)而對血壓產(chǎn)生一定的影響,這與Felizardo等[28]的研究結(jié)果一致。使用非洛地平緩釋片和VGPG干預(yù)后,C組與VGPG各劑量組Prevotellaceae與Lachnospiraceae占比接近正常大鼠,但C組中螺旋體科(Spirochaetaceae)比例上升,其所屬菌屬(如密螺旋體屬、疏螺旋體屬以及鉤端螺旋體屬等)均具有較強(qiáng)的致病性,并且已有多項研究表明,Spirochaetaceae會導(dǎo)致疾病的發(fā)生和傳播[29-30]。本實(shí)驗中C組的Spirochaetaceae比例上升,盡管未表現(xiàn)出明顯的疾病癥狀,但仍增加了大鼠患病的潛在風(fēng)險;VGPG各劑量組中Lactobacillaceae比例明顯上升,此菌類與糖類物質(zhì)代謝分解有關(guān),其所屬絕大多數(shù)菌屬(如乳酸菌、植物乳桿菌等)均具有較強(qiáng)的分解糖類物質(zhì)的能力,可以將葡萄糖、果糖等物質(zhì)分解為乳酸,屬益生菌[31]。因此,VGPG各劑量組中Lactobacillaceae比例明顯上升,使得大鼠腸道對誘發(fā)HTN病因之一——果糖的分解能力大大提高,從而對緩解、治療HTN疾病產(chǎn)生良好的作用。大鼠腸道菌群分析結(jié)果表明,對照組藥物可能在治療HTN的過程中對腸道菌群產(chǎn)生一定的副作用,而VGPG對菌群無明顯副作用,并且對改善腸道菌群具有積極作用。

    圖11 科水平大鼠腸道菌群群落分析Fig. 11 Intestinal flora community analysis of rats at the family level

    圖12 科水平大鼠腸道菌群Heatmap圖Fig. 12 Heatmap of the intestinal flora of rats at the family level

    3 結(jié) 論

    本研究表明VGPG對HTN疾病具有顯著的治療效果,在21 d的HTN大鼠灌胃干預(yù)實(shí)驗中,純度為98%、質(zhì)量濃度為25 mg/mL的VGPG具有最好的降壓效果,并且VGPG還可緩解由HTN所引起的肥胖;與常規(guī)降壓藥物相比,VGPG對腎臟、脾臟器官以及腸胃微生態(tài)環(huán)境無明顯副作用。VGPG在體內(nèi)存在兩種降壓機(jī)制:1)通過與ACE活性位點(diǎn)相結(jié)合,對其活性產(chǎn)生競爭性抑制從而達(dá)到降壓的作用;2)通過調(diào)節(jié)腸道微環(huán)境,使菌群豐富度和多樣性維持在正常范圍以內(nèi),同時提高菌群對糖類物質(zhì)的分解能力,減少因腸道微生物紊亂而對大鼠血壓造成的不良影響。這兩種調(diào)節(jié)方式之間是否存在關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。綜上所述,本研究從分子對接、體外、體內(nèi)3 個層面,探索性地研究了VGPG對大鼠HTN的抑制效果和機(jī)制,揭示腸道菌群、ACE活性與HTN的關(guān)系,結(jié)果表明VGPG可被用作治療HTN的功能性因子,可用于相關(guān)功能性食品的制備。

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