乳鐵蛋白對炎癥性腸炎大鼠腸道微生態(tài)的正向調(diào)節(jié)作用

趙 曉，徐境含，崔東影，徐珒昭，劉 洋，滕國新，許曉曦,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.武警工程大學裝備管理與保障學院，陜西 西安 710086；3.黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司，北京 100015；4.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 011500）

近年來，炎癥性腸炎（inflammatory bowel disease，IBD）已經(jīng)成為重要的全球性健康問題。IBD患者最普遍的特征是腸道黏膜發(fā)炎且反復發(fā)作，常伴有腹痛和腹瀉，往往還伴隨心血管疾病、心理及精神疾病、代謝綜合征等疾病，進一步惡化會導致結直腸癌。1990—2017年，全球IBD患者由370萬上升到680萬[1-2]，這些變化已使得IBD成為全球需要共同面對和解決的重大問題。IBD患者也往往伴隨患有腸道菌群失調(diào)，通常表現(xiàn)為腸道菌群多樣性下降、共生菌和致病菌群比例失調(diào)等[3-4]。腸道菌群通過自身成分、代謝物和衍生物以及致病菌共生菌移位等機制，參與調(diào)控宿主的代謝、免疫，從而影響罹患IBD等疾病的風險[5]。通過營養(yǎng)干預來調(diào)控腸道菌群，塑造腸道黏膜屏障的結構和功能，維持腸穩(wěn)態(tài)，被證明可以治療和預防某些疾病[6]，同樣也可以通過營養(yǎng)干預來降低IBD風險[7-8]。

乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）是一種鐵結合糖蛋白，具有多種生物活性[9-10]。目前，LF已成為嬰兒配方奶粉的主要功能性添加成分，且在嬰幼兒健康中的影響已有大量研究[11-14]。一些臨床研究結果表明，與喂養(yǎng)嬰兒配方奶粉的早產(chǎn)兒相比，喂養(yǎng)母乳可以顯著降低約13%的新生兒壞死性結腸炎的發(fā)生率和死亡率[15-18]，原因被歸結為母乳中含有的以LF為代表的生物活性成分對預防和治療IBD的有益作用[19-20]。LF還可以調(diào)節(jié)腸道菌群、抑制有害菌生長及在腸道中的定植、促進益生菌生長[21-22]。但LF對IBD疾病的預防和輔助治療作用鮮見報道，尤其是LF對IBD腸道微生態(tài)的系統(tǒng)性研究還缺乏相關數(shù)據(jù)。本研究采用16S rRNA測序技術探究LF對IBD模型大鼠腸道菌群多樣性及豐度的影響，重點分析LF對腸道微生態(tài)中益生菌、潛在有害菌的促進或抑制作用，以期為LF作為營養(yǎng)添加劑在IBD的輔助治療中提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級SD大鼠（雄性、4 周齡、體質量90～110 g）購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006。全部動物飼養(yǎng)于東北農(nóng)業(yè)大學實驗動物房中。飼養(yǎng)條件：室溫（25±2）℃、光暗周期12/12 h，標準鼠盒飼養(yǎng)，5 只一盒，下墊滅菌墊料。大鼠可自由走動、攝食及飲水。所有的實驗操作都得到東北農(nóng)業(yè)大學動物道德委員會批準。

牛LF 美國Hilmar Ingredients公司；葡聚糖硫酸鈉（dextran sulphate sodium，DSS）（36 000～50 000 Da）大連美侖生物技術有限公司；鹽酸小檗堿（berberine hydrochloride，BBH） 東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司。

1.2 儀器與設備

VD-1320型無菌操作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造廠；DW-86L490J型－80 ℃超低溫冰箱 青島海爾集團；電子顯微鏡 德國卡爾蔡司股份公司；NanoDrop 2000微量紫外分光光度計 美國Thermo Fisher公司；GeneAmp?9700型基因擴增聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Life ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 動物模型建立

將SD大鼠適應性飼養(yǎng)7 d后，隨機分為6 個組，每組10 只，進行給藥。

配制含3 g/100 mL DSS的飲用水供大鼠自由飲用，以建立實驗性結腸炎模型SD大鼠[23]。每天對大鼠進行監(jiān)測，以確保它們攝入約等量的DSS水溶液，對照組給予生理鹽水，不加DSS。DSS刺激7 d后，低、中、高劑量組分別灌胃20、50、100 mg/kgmb的LF。BBH是一種異喹啉生物堿，又稱黃連素，臨床主要用于治療胃腸炎、細菌性痢疾等腸道感染。分別以經(jīng)DSS誘導后灌胃生理鹽水和50 mg/kgmbBBH組作為陰、陽性對照，分別標記為DSS組和BHH組。DSS致結腸炎第7天隨機選取對照組和實驗性結腸炎模型組各2 只大鼠處死，從盲腸至肛門上方1 cm處切除結腸，用蘇木精-伊紅染色，根據(jù)染色結果觀察腸道黏膜損傷情況。

1.3.2 疾病活動指數(shù)評分

DSS刺激7 d期間，每天監(jiān)測大鼠的體質量并進行疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分。DAI評分由對上述治療方法不知情的觀察者進行，通過綜合體質量減量、糞便出血和糞便黏稠度進行評分[24]。體質量減量為原體質量（第1天）與第7天體質量的差值與原體質量之比（0：無變化；1：≤5%；2：6%～10%；3：11%～20%；4：≥20%）。糞便出血評分標準為0：無便血；1：糞便中可見血絲；2：糞便中可見血跡；3：糞便中明顯帶血；4：全直腸出血。糞便稠度評分標準為0：正常；1：柔軟但仍然成形；2：非常柔軟；3：腹瀉一半；4：腹瀉。

1.3.3 蘇木精-伊紅染色

將多聚甲醛固定的結腸組織用石蠟包埋，經(jīng)切片、展片、烤片，然后進行蘇木精-伊紅染色，最后使用電子顯微鏡獲得顯微照片。

1.3.4 大鼠腸道菌群多樣性分析

大鼠處死后無菌收集結腸糞便，貯存在－80 ℃冰箱中備用。糞便DNA提取采用Bio Teke糞便DNA試劑盒并按照說明書進行。用NanoDrop 2000微量紫外分光光度計對分離的DNA進行純度和濃度測定，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA純度。使用338 F（5’-ACTCCTACGGAGGCAGCAG-3’）和反向引物806 R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對V3～V4可變區(qū)進行PCR擴增。擴增程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，27 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。然后送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，利用Miseq PE300平臺進行測序。

1.3.5 生物信息學分析

原始測序序列使用Trimmomatic軟件進行質控，使用FLASH軟件進行拼接。采用UPARSE 7.1軟件（http://drive5.com/uparse/），根據(jù)97%的相似度對序列進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類，并在聚類的過程中去除單序列和嵌合體。利用RDP Classifier（http://rdp.cme.msu.edu/）對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva數(shù)據(jù)庫（SSU123）。所有的生物信息學分析均在上海美吉生物集團生物信息分析云平臺上進行。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Sigmaplot軟件進行數(shù)據(jù)處理及作圖。實驗結果采用同組個體測定結果的平均值±標準差表示（n＝10）。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，以P＜0.05判斷差異有顯著性。

2 結果與分析

2.1 IBD大鼠模型驗證

為確保本研究中SD大鼠IBD模型成功建立，檢測了DSS建模期間大鼠體質量、DAI評分變化，并在建模結束后觀察結腸黏膜表觀形態(tài)。

由圖1A可知，DSS建模期間大鼠體質量直線下降，對照組大鼠體質量緩慢上升。DSS建模第1天大鼠體質量呈現(xiàn)較低（小于3%）的上升趨勢，與對照組相比無明顯差異。隨著DSS作用時間延長，大鼠表現(xiàn)出進食量減少、腹瀉等現(xiàn)象，體質量下降明顯，而未受DSS刺激的對照組大鼠體質量持續(xù)上升。

DAI是評價結腸炎的重要指標，主要從體質量減量、糞便性狀及便血程度3 個方面對腸炎進行評估。由圖1B可知，DSS刺激的大鼠，其DAI評分逐漸升高，與對照組差異顯著（P＜0.05）。DSS刺激第3天之后，DAI評分急速升高。實驗發(fā)現(xiàn)，大鼠在DSS刺激第3天開始糞便不成型，第4天開始有便血，而后便血明顯，部分大鼠出現(xiàn)稀水便。這說明DSS刺激7 d能夠造成大鼠產(chǎn)生腸炎癥狀。對照組大鼠在建模的最后2 d，個別出現(xiàn)腹瀉的現(xiàn)象，這可能是灌胃所帶來的應激反應。

圖1 DSS建模期間大鼠體質量（A）和DAI評分（B）變化Fig. 1 Changes in body mass (A) and DAI score (B) of rats during DSS administration

DSS刺激7 d后，解剖大鼠，取結腸進行蘇木精-伊紅染色，觀察其結構形態(tài)。由圖2可知，對照組大鼠結腸具有完整的黏膜以及健康的隱窩結構，并且富含杯狀細胞。而DSS組表現(xiàn)出嚴重的結腸黏膜損傷，黏膜肌層消失，黏膜下層和漿膜發(fā)炎，中性粒細胞浸潤。腸道上皮細胞受到嚴重破壞，杯狀細胞減少，隱窩和絨毛結構消失，腺體組織混亂。綜上，從大鼠體質量、DAI評分及結腸黏膜形態(tài)3 個指標可以看出，DSS刺激IBD大鼠模型成功構建。

圖2 DSS建模后大鼠結腸黏膜形態(tài)顯微圖Fig. 2 Morphological structures of colon after DSS stimulation

2.2 LF攝入對腸道菌群種類多樣性的影響

α-多樣性是指一個特定區(qū)域內(nèi)的多樣性，常用Chao1、Ace、Simpson等一系列指數(shù)來度量，通過多樣性分析可以得到物種的多樣性信息。本研究采用Ace、Sobs、Simpson、Coverage指數(shù)以評估LF對IBD大鼠腸道菌群α-多樣性的影響。

Ace指數(shù)和Sobs指數(shù)能夠反映樣本所含OTU的數(shù)目，即對樣本微生物種類的評估，其數(shù)值越高，說明樣本所含微生物種類越豐富。由圖3A、B可知，與對照組相比，DSS刺激的大鼠，其Ace、Sobs指數(shù)均降低，而與DSS組相比，LF灌胃大鼠這兩個指數(shù)均有不同程度的升高。與DSS組相比，低劑量LF組對Ace、Sobs指數(shù)影響不顯著（P＞0.05），中、高劑量組這兩個指標均顯著提高（P＜0.05），說明LF劑量與結腸炎大鼠腸道菌群多樣性呈正相關。與BHH組相比，高劑量組提高了Ace、Sobs指數(shù)，但對Sobs指數(shù)的影響不顯著（P＞0.05），這說明LF比BHH更有助于腸道菌群多樣性的恢復。但與未受到DSS刺激的對照組大鼠相比，LF灌胃組的大鼠Ace、Sobs指數(shù)均較低，但高劑量組與對照組無顯著性差異（P＞0.05）。

Simpson指數(shù)用來估算樣本中微生物多樣性，Simpson指數(shù)越高，說明群落多樣性越低。由圖3C可知，DSS刺激的大鼠群落多樣性降低，與DSS組相比，LF灌胃的大鼠群落多樣性升高。這說明，DSS刺激降低了大鼠腸道的菌群多樣性，但LF有助于恢復大鼠腸道的菌群多樣性。BHH組Simpson指數(shù)圖中箱形面積較大，說明該組大鼠個體差異較大，可能是因為不同個體對BHH的耐受不同。與對照組相比，LF灌胃的大鼠，Simpson指數(shù)無顯著差異（P＞0.05）。

Coverage指數(shù)越高，則樣本中序列被測出的概率越高，反映測序結果是否代表樣本中微生物的真實情況，可以評價物種種類的覆蓋率。由圖3D可知，各組大鼠Coverage指數(shù)均高于0.99，說明實驗結果可以真實反映大鼠腸道菌群的組成和分布，數(shù)據(jù)有效。α-多樣性指數(shù)結果說明，DSS刺激造成了大鼠腸道菌群種類的降低，而灌胃LF后，腸道菌群多樣性得到恢復，且LF高劑量組的α-多樣性指數(shù)與健康大鼠無顯著差異（P＞0.05）。

圖3 攝入LF對結腸炎大鼠α-多樣性的影響Fig. 3 Effect of LF intake on α-diversity of gut microbiota in rats with colitis

2.3 LF攝入對IBD大鼠腸道菌群組成的影響

腸道菌群的組成會影響機體的腸穩(wěn)態(tài)，進一步會影響機體的整體健康。本研究從門和科水平考察了LF對IBD大鼠腸道菌群種類和豐度的影響。作為腸道菌群的兩大優(yōu)勢菌，厚壁菌門（Firmicutes）與擬桿菌門（Bacteroidetes）的比例失調(diào)與多種疾病相關，而IBD患者的腸道菌群特征之一就是厚壁菌門/擬桿菌門比例降低。由圖4A可知，DSS刺激下大鼠腸道菌群厚壁菌門/擬桿菌門比例與對照組相比降低了79.6%，而LF低、中、高劑量組分別提高厚壁菌門/擬桿菌門比例至119%、223%和380%，分別是對照組的23%、43%和74%。LF中、高劑量組對厚壁菌門/擬桿菌門比例的提高比BHH組分別高22.1%和230.8%。這說明LF比BHH更有助于恢復DSS刺激所引起的大鼠結腸腸道菌群優(yōu)勢菌——厚壁菌門和擬桿菌門的失調(diào)。

腸道菌群多樣性科水平分布如圖4B所示，大鼠腸道菌群科水平的優(yōu)勢菌群為乳桿菌科（Lactobacillaceae）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）、擬桿菌科（Bacteroidaceae）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）等。與對照組組相比，DSS刺激下大鼠結腸中乳桿菌科（32% vs. 12%）、瘤胃菌科（34% vs. 17%）等菌群相對豐度降低，同時擬桿菌S24-7（7.8% vs. 28%）、毛螺旋菌科（17% vs. 22%）、普雷沃氏菌科（3% vs. 13%）等菌群相對豐度增加。與DSS組相比，LF高劑量組提高了乳桿菌科（12% vs. 40%）、瘤胃菌科（17% vs. 27%）等菌群的相對豐度，降低了擬桿菌科（28% vs. 8%）、普雷沃氏菌科（13% vs. 6%）等菌群的相對豐度，且部分呈現(xiàn)出一定的劑量依賴關系。同時，相對于DSS組，BHH組也呈現(xiàn)與LF相似的作用。值得一提的是，DSS組的獨有菌群是促炎菌科（Erysipelotrichaceae），這可能是造成IBD的原因之一。

圖4 大鼠腸道菌群門水平（A）和科水平（B）物種組成Fig. 4 Dominant flora and species composition in rat colon at phylum (A)and family (B) level

采用Venn圖統(tǒng)計不同組別大鼠腸道菌群所共有和獨有的物種數(shù)目（OTU水平）。如圖5所示，6 組大鼠腸道菌落所共有的物種數(shù)目為346 個。對照組大鼠的物種數(shù)最高，為648 個，其次為LF高劑量組，有632 個，而BHH組OTU數(shù)目為606 個。DSS組OTU數(shù)目為573 個，比對照組OTU數(shù)目少11.6%。對照組和LF高劑量組所獨有的物種數(shù)目分別為41 個和20 個，DSS組有12 個獨有物種。與DSS組相比，LF低、中劑量組對物種OTU數(shù)目影響不大，但LF高劑量組物種OTU數(shù)目提高了10.3%。OTU數(shù)目的大小也從另一方面說明了菌群的多樣性，結果表明對照組健康鼠的腸道菌群多樣性最豐富，而DSS組和LF低劑量組菌群多樣性最低，LF中、高劑量有助于提高菌群多樣性水平，且LF高劑量組菌群多樣性和對照組組最接近，這一結果和α-多樣性結果相一致。

圖5 大鼠腸道菌群物種差異性分析Venn圖Fig. 5 Venn diagram showing differences in gut microbiota composition among rats in different groups

2.4 攝入LF對IBD大鼠腸道菌群KEGG信號通路相關OTU豐度的影響

通過KEGG信號通路的功能分析，所有OTU被注釋到254 種信號通路中。通過對這些信號通路的功能性進行分類匯總，然后選出影響機體健康并與本研究關聯(lián)性較大的12 種信號通路，結果見表1。

表1 攝入LF對IBD大鼠腸道菌群KEGG信號通路相關OTU豐度的影響Table 1 Effect of LF intake on the abundance of OTU related to KEGG signaling pathway in intestinal microbiota of IBD rats

同一種KEGG信號通路下不同組大鼠的OTU豐度差異明顯。從與人類疾病相關的3 種信號通路（癌癥、感染性疾病和神經(jīng)退行性疾?。┧鶎腛TU豐度可以明顯看出，DSS組所對應的OTU豐度最高，而LF中、高劑量組和對照組差異較小。這說明IBD患者同時罹患癌癥、感染性疾病等其他疾病的風險較高。器官相關KEGG信號通路中，免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的OTU豐度在DSS組分布最高，而隨著LF劑量的升高，其對應的OTU豐度逐漸下降，其趨勢和人類疾病相關的信號通路OTU豐度分布相似。但消化系統(tǒng)相關KEGG信號通路的OTU豐度在DSS組分布較低。代謝功能相關KEGG信號通路的OTU豐度在DSS組相對較高，尤其是運輸和分解代謝對應的OTU豐度最高。與代謝功能相關的KEGG信號通路對應的OTU豐度在不同組大鼠腸道菌群中的分布規(guī)律類似，細胞及遺傳信息相關的KEGG信號通路對應的OTU豐度在DSS組大鼠中分布最高，LF低劑量組應對的OTU豐度次之，LF高劑量組對應的OTU豐度較低，BHH組對應的OTU豐度最低。這可能是因為IBD患者氧化應激水平高，導致與細胞相關的菌群豐度增加[25]。通過對菌群KEGG通路OTU豐度的分析可以看出，IBD也會伴隨其他疾病的發(fā)生[26]。

3 討 論

腸道菌群對多種疾病，尤其是對消化道類疾病的影響近十幾年受到廣泛關注。腸道菌群通過其組成與代謝物影響腸道基因表達調(diào)控通路變化，而且這種靶向調(diào)節(jié)作用可能存在精細復雜性與通路特異性。IBD患者腸道菌群個體差異較大，但目前廣泛接受的認知是IBD疾病常伴隨腸道厚壁菌門的數(shù)量下降，同時產(chǎn)生內(nèi)毒素的變形桿菌（Proteobacteria）數(shù)量增加[27]。IBD患者腸道菌群種類下降，大多數(shù)是因為厚壁菌門類細胞減少。其中，梭狀芽孢桿菌（Clostridium leptum），尤其是普雷沃氏桿菌（Faecalibacterium prausnitzii）下降。但是不同研究的腸道菌群分布差異很大，尤其是腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、擬桿菌屬（Bacteroides）、雙歧桿菌屬（Bifidobacteriasp.）、乳桿菌屬（Lactobacillussp.）以及大腸桿菌（Escherichia coli）[28]。本研究結果并沒有檢測到雙歧桿菌屬（Bifidobacteriasp.）和大腸桿菌。這可能是由取樣部位、樣品是否取自被感染部位、疾病嚴重程度、來源于腸道和糞便之分以及分析腸道菌群所用的方法等差異造成的[29]。腸道菌群的取樣部位和取樣時間對結果影響很大，如糞便和腸黏膜中的腸道菌群組成差異很明顯[30]。黏膜菌群能更準確地反映機體紊亂狀態(tài)[31]，甚至有報道稱IBD患者腸黏膜菌群數(shù)量比健康人多[32]。推測可能是黏膜上的菌群與腸道表面接觸密切，因此，黏膜相關菌群在生理功能上比腸腔內(nèi)菌群影響更大[32]。本研究腸道菌群樣本取自大鼠結腸內(nèi)容物，采用16S rRNA高通量測序，結果表明LF可以恢復患IBD大鼠腸道菌群的種類，提高厚壁菌門數(shù)量，降低擬桿菌門數(shù)量，這和文獻[33-34]一致。研究結果表明DSS組大鼠結腸擬桿菌科豐度增加，DSS組的獨有菌群是促炎菌科Erysipelotrichaceae，這可能是導致腸道炎癥出現(xiàn)的原因之一。Earley等[35]報道S24-7細菌數(shù)量的降低和腸道完整性下降以及腸道菌群移位有關。乳桿菌屬（Lactobacillus）是腸道益生菌的主要菌屬，益生菌可以促進大鼠小腸隱窩上皮細胞增殖、延長上皮細胞的壽命、維護腸黏膜屏障功能的完整性，還可以調(diào)節(jié)結腸黏液層，平衡腸道黏膜免疫[9]。毛螺旋菌（Lachnospiraceae）能將多糖降解為乙酸、丁酸等短鏈脂肪酸，短鏈脂肪酸可以被腸道上皮細胞迅速吸收，并參與細胞增殖和調(diào)節(jié)過程，此外，短鏈脂肪酸還可以調(diào)節(jié)先天免疫和適應性免疫細胞的產(chǎn)生、運輸，影響免疫細胞的功能性。丁酸還可以直接作用于黏膜細胞，增加調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)量并增強其活性，同時抑制中性粒細胞、巨噬細胞、效應T細胞等的活性，產(chǎn)丁酸菌群的減少可以激發(fā)IBD患者菌群失調(diào)，引起腸道黏膜炎性細胞的顯著增加[36]。擬桿菌屬（Bacteroides）的細胞表面脂蛋白BtuG2能結合VB12，并可以從VB12的關鍵轉運蛋白內(nèi)在因子中競爭性結合VB12，這意味著擬桿菌屬可以爭奪腸道中的關鍵維生素；此外，擬桿菌還與多種疾病相關，如結腸直腸癌、肝病[37]。

LF能夠恢復IBD大鼠結腸糞便腸道菌群的α-多樣性分布，提高優(yōu)勢菌厚壁菌門，降低擬桿菌門豐度。同時，LF通過提高有益菌乳桿菌、瘤胃菌科，降低擬桿菌、普雷沃氏菌的豐度，從而正向調(diào)節(jié)患IBD大鼠腸道微生物組成，維持腸穩(wěn)態(tài)。此外，LF還通過降低大鼠腸道菌群與癌癥、感染性疾病等疾病相關信號通路OTU豐度，來降低其他疾病風險。