基于乙醇注入-高壓均質(zhì)的蛋清肽脂質(zhì)體制備及體內(nèi)外緩釋效果

張 婷，溫鶴迪，宋敬一，葛慧芳，王明華，陳 艷，劉博群，劉靜波

（吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林省營養(yǎng)與功能食品重點實驗室，吉林 長春 130062）

活性肽是指蛋白質(zhì)經(jīng)過水解后產(chǎn)生的生物活性片段，由2～20 個氨基酸通過不同排列組合構(gòu)成[1]。由于其特殊的結(jié)構(gòu)，活性肽具有多種生物活性[2]。在過去的20 年里，人們隨著研究的加深，對活性肽的認知也越來越全面[3]。但是，肽在胃腸道及小腸上皮細胞的轉(zhuǎn)運能力較弱。由于胃液較強的酸性、蛋白酶以及小腸上皮細胞中的酶會使肽在吸收轉(zhuǎn)運、發(fā)揮生理活性之前即被降解，即使少數(shù)肽可以實現(xiàn)完整轉(zhuǎn)運，但依然不能實現(xiàn)全部轉(zhuǎn)運，導(dǎo)致肽的生物利用度較低。Ding Long等[4]通過研究肽RVPSL發(fā)現(xiàn)，即使肽可以完整轉(zhuǎn)運，但依然存在（36.31±1.22）%的部分會被小腸緣膜降解。因此，如何獲得高效且完整的肽運載方式吸引了國內(nèi)外研究者關(guān)注。包埋活性肽具有諸多優(yōu)點：控制和減緩活性肽在體內(nèi)的提前降解；促進活性肽的吸收；增強藥代動力學(xué)，延長肽在機體的保留時間，提高吸收利用率[5-7]。目前已知的運載體系種類廣泛，脂質(zhì)體、納米乳液、納米顆粒等運載體系均可以實現(xiàn)肽在生物體內(nèi)輸送[8]。

Gregoriadis[8]、Lasic[9]等提出將脂質(zhì)體作為一種新型的藥物傳遞系統(tǒng)進行研究。脂質(zhì)體主要原料為磷脂和膽固醇，結(jié)構(gòu)類似于生物膜，其安全性高[10]。脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)上具有親水頭部和疏水尾部，親水性物質(zhì)進入親水性內(nèi)核中，而疏水性物質(zhì)則進入磷脂雙分子層中，因此脂質(zhì)體同時具有包埋親水和疏水物質(zhì)的能力。另外，脂質(zhì)體可以避免包埋的藥物被提前降解，延長藥物在體內(nèi)的保留時間[11-12]。目前脂質(zhì)體已經(jīng)成功應(yīng)用于蛋白質(zhì)、酶、抗氧化劑、抗菌劑等活性物質(zhì)的包埋，并表現(xiàn)出良好的發(fā)展前景[13]。近年來，隨著研究人員對活性肽了解的逐步深入，脂質(zhì)體負載活性肽的研究也逐步展開。龔魁杰[5]通過薄膜分散法制得花生短肽納米脂質(zhì)體，結(jié)果表明脂質(zhì)體具有高包封率、良好的酸堿穩(wěn)定性以及緩釋效果和抗消化能力。Maherani等[14]通過薄膜水化法實現(xiàn)納米脂質(zhì)體包封天然二肽抗氧化劑（L-肌肽），脂質(zhì)體的包封可以改善抗氧劑肽的穩(wěn)定性低、活性易降低的缺陷，促進抗氧化劑肽在食品工業(yè)中的應(yīng)用。吳琦[15]以逆向旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法制得抗氧化蛋清肽脂質(zhì)體，并通過體外模擬消化實驗證實脂質(zhì)體對抗氧化蛋清肽具有一定的保護作用，可以延緩蛋清肽的釋放并提高抗氧化肽的貯藏穩(wěn)定性。

然而由于活性肽的強親水性，肽更易存在于外水相或者假內(nèi)水相中，從而可能出現(xiàn)包埋率較低、釋放速率過快、包埋效果差等問題。這些問題需要通過不斷調(diào)整脂質(zhì)體制備工藝來解決。乙醇注入法優(yōu)點在于能比較快速形成脂質(zhì)體，在實驗操作上比較簡單，且方法柔和、對藥物影響較小。Shaker[16]、Zou Liqiang[17]、Hashemi[18]等均通過乙醇注入法制得粒徑較小、包埋率較高且具有良好緩釋效果的脂質(zhì)體。而高壓均質(zhì)法所制備脂質(zhì)體具有重現(xiàn)性好、可大規(guī)模生產(chǎn)、微粒均勻且穩(wěn)定性好等優(yōu)點[19-20]。因此本研究采用乙醇注入法結(jié)合高壓均質(zhì)機制備脂質(zhì)體，并優(yōu)化工藝條件。另外，有關(guān)活性肽脂質(zhì)體的延緩釋放實驗?zāi)壳岸嗉杏隗w外胃腸道模擬消化實驗，體內(nèi)消化實驗研究較少，本研究通過體外胃腸道模擬消化實驗以及小鼠模型分析了蛋清肽脂質(zhì)體在體外以及體內(nèi)的對蛋清肽緩釋效果。研究可為功能肽的活性保護提供綠色、高效的技術(shù)支持，并為開發(fā)功能性食品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

雄性KM小鼠（7～8 周齡，生產(chǎn)許可證：SCXK（京）2016-0011） 北京維通利華公司。

蛋黃卵磷脂（純度≥95%） 北京索萊寶科技有限公司；膽固醇（純度≥98%） 上海艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司；吐溫20（Tween 20，T-20）、吐溫-80（Tween-80，T-80）、酪蛋白酸鈉（sodium casein phosphate，Scp）、辛烯基琥珀酸酐（octenyl succinic anhydride，Osa） 上海麥克林生化科技有限公司；蛋清肽（200 Da～1 kDa）由實驗室自制；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓均質(zhì)機 上海綿竹機械設(shè)備有限公司；FJ300-SH高速分散機 上海標本模型廠；納米激光粒度儀 美國貝克曼庫爾特有限公司；HYQ-3110渦旋混合器賽伯樂（上海）儀器有限公司；Cence湘儀離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；紫外分光光度計 島津國際貿(mào)易（上海）公司；酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；GCMS-QP2010 Ultra氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀 日本島津公司；H-7650透射電子顯微鏡 日本日立公司；ACQUITY TQD液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（liquid chromatography-tandem mass spectrometer，LC-MS/MS）沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 空白脂質(zhì)體的制備

稱取一定量的蛋黃卵磷脂和膽固醇溶解在50 ℃的無水乙醇中，蛋黃卵磷脂質(zhì)量濃度為0.5～20 mg/mL，膽固醇質(zhì)量濃度為蛋黃卵磷脂的1/5。首先利用高速分散機在19 000 r/min條件下剪切均質(zhì)5 min，然后使用高壓均質(zhì)機在0～40 MPa條件下高壓均質(zhì)3～11 min。在磁力攪拌器上，通過注射器針頭將蛋黃卵磷脂/膽固醇-乙醇溶液緩慢勻速地滴加到去離子水中，并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，制得空白脂質(zhì)體，并測定空白脂質(zhì)體的粒徑和多分散性指數(shù)（polydispersity index，PDI）。單因素試驗時分別控制蛋黃卵磷脂質(zhì)量濃度為10 mg/mL，高壓均質(zhì)壓力為20 MPa，時間為7 min。

1.3.2 脂質(zhì)體穩(wěn)定劑的篩選

分別將蛋黃卵磷脂質(zhì)量1%的酪蛋白酸鈉、T-20、T-80、Osa與空白脂質(zhì)體溶解在50 ℃的乙醇中，制得含穩(wěn)定劑的空白脂質(zhì)體，每間隔5 d測定一次脂質(zhì)體的粒徑和PDI。通過觀察常溫貯藏條件下，脂質(zhì)體粒徑和PDI在30 d內(nèi)的變化情況來衡量脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，并篩選出最佳穩(wěn)定劑。

1.3.3 粒徑和PDI的測定

將制備好的空白脂質(zhì)體稀釋100 倍，用納米激光粒度儀進行粒徑及PDI測定。

1.3.4 負載蛋清肽脂質(zhì)體的制備

將蛋清肽溶解在去離子水中，質(zhì)量濃度與空白脂質(zhì)體中蛋黃卵磷脂相同。在磁力攪拌器上，將空白脂質(zhì)體通過注射器針頭緩慢勻速地滴加到蛋清肽溶液中，混合后進行超聲處理，并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，最終得到負載蛋清肽的脂質(zhì)體顆粒。

根據(jù)上述步驟，考察脂質(zhì)體中肽與壁材的體積比（1∶10、1∶5、3∶5、5∶5、5∶3、5∶1）、超聲時間（0、30、60、90、120、150 s）和超聲功率（0、100、200、300、400、500 W）對脂質(zhì)體包埋率、負載率以及粒徑、PDI的影響。單因素試驗優(yōu)化某一參數(shù)時，分別控制芯壁體積比為5∶5，超聲時間為60 s，超聲功率為100 W。

1.3.5 蛋清肽脂質(zhì)體包埋率和負載率的測定

采用間接法測定蛋清肽脂質(zhì)體的包埋率[21]。將蛋清肽脂質(zhì)體放置于截留分子質(zhì)量5 kDa的超濾離心管內(nèi)襯管中，3 500 r/min條件下離心15 min，濾過液即為未被包埋的蛋清肽液，用磷酸鹽緩沖液（0.01 mmol/L、pH 7.2）將其稀釋10 倍后測定其在220 nm波長處的吸光度，根據(jù)蛋清肽標準曲線計算得到游離蛋清肽質(zhì)量濃度。蛋清肽標準曲線：配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的蛋清肽溶液，隨后用磷酸鹽緩沖液將蛋清肽溶液依次稀釋至0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2 mg/mL，檢測蛋清肽溶液在220 nm波長處的吸光度，并擬合得到標準曲線。蛋清肽包埋率和負載率分別按公式（1）、（2）計算。

1.3.6 脂質(zhì)體乙醇殘留率的測定

利用自動頂空-GC-MS法測定脂質(zhì)體中殘留的乙醇質(zhì)量[22]。

GC條件：Rxi-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為氦氣，流速為1 mL/min，進樣口溫度為150 ℃，分流進樣，分流比為1∶30，柱溫60 ℃，保持5 min。

MS條件：離子源溫度250 ℃，電離方式為電子轟擊，電離能70 eV，傳輸線溫度250 ℃，掃描模式選擇離子檢測模式，掃描間隔0.1 s，掃描質(zhì)量范圍29～150 amu。頂空條件：頂空瓶體積20 mL，進樣體積5 mL，水浴溫度60 ℃，平衡20 min。

對照溶液配制：精確稱量107.26 mg無水乙醇，用超純水定容至10 mL，配制對照儲備液。分別量取0.1、0.2、0.5、1、2 mL儲備液，用超純水定容至10 mL，混勻后作為對照溶液備用。按照頂空條件處理后進行測定，記錄峰面積，將峰面積和質(zhì)量濃度擬合得到標準曲線。

樣品溶液：將脂質(zhì)體溶液稀釋8 倍，混勻后備用。按照對照處理方法，記錄峰面積，通過標準曲線確定乙醇質(zhì)量濃度，計算得到殘留的乙醇質(zhì)量，并按公式（3）計算得到脂質(zhì)體乙醇殘留率[23]。

1.3.7 蛋清肽脂質(zhì)體形態(tài)學(xué)觀察

將脂質(zhì)體稀釋10 倍，滴在專用銅網(wǎng)上，用體積分數(shù)1%磷鎢酸染色1 min，自然晾干后，利用H-7650透射電子顯微鏡在80 kV電壓下觀察蛋清肽脂質(zhì)體的微觀形貌。

1.3.8 蛋清肽脂質(zhì)體體外模擬緩釋實驗

體外模擬緩釋實驗利用透析袋構(gòu)建了模擬胃液（stimulated gastric fluid，SGF）和模擬腸液（simulated intestinal fluid，SIF）環(huán)境[24]，比較蛋清肽脂質(zhì)體和游離蛋清肽在SGF和SIF中的蛋清肽釋放率。

SGF配制：500 mL容量瓶中依次加入6.9 mL KCl（0.5 mol/L）、0.9 mL KH2PO4（0.5 mol/L）、12.5 mL NaHCO3（1 mol/L）、11.8 mL NaCl（2 mol/L）、0.4 mL MgCl2·6H2O（0.15 mol/L）、10.5 mL(NH4)2CO3（0.5 mol/L），用蒸餾水定容，備用。

SIF配制：500 mL容量瓶中依次加入6.8 mL KCl（0.5 mol/L）、0.8 mL KH2PO4（0.5 mol/L）、42.5 mL NaHCO3（1 mol/L）、9.6 mL NaCl（2 mol/L）、1.1 mL MgCl2·6H2O（0.15 mol/L），用蒸餾水定容，備用。

分別將2 mL蛋清肽脂質(zhì)體和2 mL同質(zhì)量濃度的未包埋的蛋清肽放置到預(yù)先浸泡的透析袋中（截留分子質(zhì)量5 kDa）。分別將每個透析袋懸浮在50 mL離心管中，離心管中含有20 mL pH 2的SGF溶液，扣緊離心管的蓋子。然后放置在恒溫培養(yǎng)箱（120 r/min，37 ℃）中溫育。每隔20 min取樣，每次取樣0.2 mL。隨即加入等體積的SGF（0.2 mL）。2 h后，加入20 mL SIF與SGF消化液混合，并將pH值調(diào)整為7.4。SIF取樣方式與SGF相同，分別在3、4、5、7、9、24、48 h時取樣0.2 mL，再加入0.2 mL的SIF。取出的樣品置于超濾離心管中，離心（3 500 r/min、15 min）后，測定濾過液中蛋清肽的質(zhì)量濃度，即得到蛋清肽的累積釋放質(zhì)量。按式（4）計算蛋清肽釋放率。

1.3.9 蛋清肽體內(nèi)緩釋實驗

小鼠于飼養(yǎng)室（溫度22～25 ℃、相對濕度65%）適應(yīng)環(huán)境一周，期間自由進食、飲水。一周后對實驗鼠進行禁食，并隨機分為3 組：空白對照組、蛋清肽組、蛋清肽脂質(zhì)體組，每組36 只。其中，空白對照組灌胃生理鹽水（0.25 mL/20 gmb），蛋清肽組根據(jù)100 mg/kgmb的給藥劑量灌胃蛋清抗氧化肽溶液，蛋清肽脂質(zhì)體組灌胃蛋清抗氧化肽脂質(zhì)體生理鹽水溶液，灌胃劑量根據(jù)蛋清肽脂質(zhì)體的包埋率確定以保證蛋清肽的最終劑量為100 mg/kgmb。采血時間點為給藥后0.5、1、2、4、6 h，每個時間點分別取6 只小鼠進行眼眶取血，采血完成后，實驗鼠進行頸部脫臼處死。血液置于1.5 mL離心管中，室溫靜置1～2 h后，4 000 r/min條件離心10 min，上清液即為血清樣品[25]。

血清樣品按照體積比1∶3加入乙腈，漩渦混勻后超聲15 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液。上清液中加入0.03 g NaCl，再次離心（10 000 r/min、10 min），取上清液400 μL，分別加入400 μL碳酸鹽緩沖液和400 μL Fmoc-Cl衍生試劑，充分混合后在室溫下反應(yīng)20 min，樣品過0.22 mm水系微孔濾膜，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

利用LC-MS/MS對血清中多種氨基酸含量進行檢測。檢測條件：流動相A：體積分數(shù)0.1%甲酸溶液；流動相B：乙腈；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量10 μL。洗脫程序：0～20 min，20%～100%流動相B。電噴霧離子源參數(shù)：霧化器氣體（N2）壓力50 psi；干燥氣體（N2）流速12 L/min，干燥氣體溫度350 ℃[26]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗設(shè)3 個平行，結(jié)果以平均值±標準差表示，并利用SPSS 19軟件進行單因素方差分析，運用t檢驗在P＜0.05水平進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同條件對空白脂質(zhì)體粒徑和PDI的影響

由圖1A可知，蛋黃卵磷脂質(zhì)量濃度會對空白脂質(zhì)體粒徑和PDI產(chǎn)生顯著影響（P＜0.05）。隨著蛋黃卵磷脂質(zhì)量濃度增加，粒徑先減小后增大。獲得更加穩(wěn)定的脂質(zhì)體，應(yīng)盡量選擇粒徑較小的脂質(zhì)體[27]。同時考慮到后續(xù)的蛋清肽負載效果，選擇蛋黃卵磷脂質(zhì)量濃度10 mg/mL進行后續(xù)實驗，此時粒徑為（95.0±0.8）nm，PDI為0.210±0.009。由圖1B可知，未加壓力時空白脂質(zhì)體粒徑為（259.1±2.5）nm，隨著均質(zhì)壓力增加，空白脂質(zhì)體粒徑呈下降趨勢。在均質(zhì)壓力達到最高（40 MPa）時粒徑最?。ǎ?6.0±0.6）nm）?？紤]到高壓均質(zhì)機的參數(shù)限制，選擇40 MPa為最佳實驗條件。由圖1C可知，脂質(zhì)體的粒徑隨著均質(zhì)時間的延長先減小后增大，均質(zhì)7 min時可以得到粒徑最小的脂質(zhì)體，此時粒徑為（78.6±13.1）nm，PDI為0.28±0.13。雖然高壓均質(zhì)可以顯著降低脂質(zhì)體粒徑，但是隨著均質(zhì)時間延長，過小的脂質(zhì)體會在表面張力的作用下重新聚合，從而出現(xiàn)粒徑增大、PDI增大的現(xiàn)象[28]。此外，隨著均質(zhì)時間的延長，樣品溫度的升高也會導(dǎo)致粒徑增大。對比發(fā)現(xiàn)，高壓均質(zhì)輔助制備得到的脂質(zhì)體具有更小的粒徑，邰克東[28]和丁麗燕[29]等的實驗也得到相似的結(jié)論。綜上，最終選擇2 mg/mL膽固醇、10 mg/mL蛋黃卵磷脂、40 MPa高壓均質(zhì)7 min作為空白脂質(zhì)體的制備條件，用于后續(xù)實驗。

圖1 不同制備條件對空白脂質(zhì)體粒徑和PDI的影響Fig. 1 Effect of different preparation conditions on the particle size and PDI of blank liposomes

2.2 不同穩(wěn)定劑對空白脂質(zhì)體粒徑和PDI的影響

穩(wěn)定劑的選擇對運載體系的穩(wěn)定性至關(guān)重要。適宜穩(wěn)定劑的加入可以通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)體的表面電荷以及表面親水親脂性等來達到提高包埋率、穩(wěn)定性等目的。穩(wěn)定劑的種類對脂質(zhì)體的作用有很大影響，選擇常見的4 種表面活性劑（Scp、T-20、T-80、Osa）進行篩選實驗。如圖2A所示，未加穩(wěn)定劑的空白脂質(zhì)體隨著貯存時間的延長粒徑逐漸增大；加入Scp后，空白脂質(zhì)體粒徑明顯增加，加入Osa的空白脂質(zhì)體與未加穩(wěn)定劑的空白脂質(zhì)體粒徑變化趨勢相似，但粒徑大于空白脂質(zhì)體，出現(xiàn)這種變化的原因可能是Scp、Osa的加入引起脂質(zhì)體聚集，從而導(dǎo)致粒徑增加；加入T-20與T-80后，空白脂質(zhì)體粒徑在0～20 d內(nèi)隨貯存時間的延長逐漸降低，可能是因為表面活性劑可以增大脂質(zhì)體表面電荷密度，并具有增強脂質(zhì)體間靜電斥力的作用，引起粒子粒徑減小并且趨于穩(wěn)定[30-31]。由圖2B可以看出，空白脂質(zhì)體隨貯存時間的延長PDI整體呈上升趨勢，相較而言，添加T-80的空白脂質(zhì)體在貯存期間PDI較為穩(wěn)定，且小于未加穩(wěn)定劑組，說明T-80可以保證脂質(zhì)體在30 d內(nèi)具有良好的貯藏穩(wěn)定性，因此選擇T-80為脂質(zhì)體穩(wěn)定劑。

圖2 不同穩(wěn)定劑對空白脂質(zhì)體粒徑（A）和PDI（B）的影響Fig. 2 Effect of different stabilizers on the particle size (A) and the PDI (B)of blank liposomes

2.3 不同因素對脂質(zhì)體負載蛋清肽的影響

蛋清源活性肽是親水性物質(zhì)，可隨水分子進入脂質(zhì)體內(nèi)水相，從而實現(xiàn)脂質(zhì)體對蛋清肽的負載以及保護。由于蛋清肽的親水性極強，極易分散在外水相中，因此芯壁體積比的選擇對脂質(zhì)體的包埋率和負載率有重要意義。由圖3A1可以看出，隨著芯壁體積比的變化，抗氧化肽包埋率和負載率均呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，當芯壁體積比達到3∶5時，包埋率（（49.71±1.6）%）和負載率（（17.1±0.5）%）達到最大值，此時外水相蛋清肽、卵磷脂質(zhì)量濃度適宜，利于脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的形成，且具有最高的包埋能力。而隨著芯壁體積比的進一步增大，外水相蛋清肽濃度逐漸增加，已經(jīng)包埋于脂質(zhì)體內(nèi)部的親水性蛋清肽又重新轉(zhuǎn)移至外水相中，從而導(dǎo)致包埋率和負載率降低。進一步觀察芯壁體積比對脂質(zhì)體的粒徑的影響（圖3A2），當芯壁體積比在1∶5～5∶3時，體系具有良好的粒徑分布和穩(wěn)定性，因此確定最佳芯壁體積比為3∶5。

圖3 不同因素對包埋率、負載率、粒徑和PDI的影響Fig. 3 Influence of different factors on encapsulation efficiency,loading rate, particle size and PDI

超聲輔助能夠增加分散相體積、減小液滴尺寸，進而輔助脂質(zhì)體包埋蛋清肽。由圖3B1、B2可以看出，包埋率隨超聲時間延長先增大后降低，超聲時間過長可能不利于脂質(zhì)體的形成，從而降低了其對蛋清肽的包埋率。在超聲30 s時脂質(zhì)體的包埋能力最高（包埋率（63.8±2.0）%、負載率（14.3±1.0）%），此時蛋清肽脂質(zhì)體粒徑為（220±1）nm，PDI為0.24±0.02，因此確定30 s為最佳超聲時間。

由圖3C1、C2可知，超聲處理可以明顯提升脂質(zhì)體對蛋清抗氧化肽的包埋率和負載率，但超聲功率在100～500 W范圍內(nèi)對二者的影響無明顯差異。超聲功率為100 W時，包埋率為（61.3±1.1）%，負載率為（13.7±0.4）%，粒徑為（230±5）nm，PDI為0.350±0.014。因此選擇超聲功率100 W進行后續(xù)實驗。

綜上，確定蛋清肽與空白脂質(zhì)體的體積比3∶5、100 W超聲30 s為最佳實驗條件，制得的蛋清肽脂質(zhì)體，包埋率為（65.7±3.6）%，粒徑為（89.4±2.4）nm。

2.4 脂質(zhì)體的乙醇殘留率

采用乙醇注入法制備脂質(zhì)體，會出現(xiàn)大量乙醇殘留的現(xiàn)象?！吨袊幍洹分幸笠掖嫉臍埩袈什坏贸^0.5%，新版《中國藥典》要求脂質(zhì)體制劑必須對有機溶劑殘留量進行檢查。為了保證脂質(zhì)體的安全性及穩(wěn)定性，需要測定脂質(zhì)體中乙醇的殘留量。通過對照溶液的測定，得到標準曲線：y＝350.08x－25 388，R2＝0.998 9。計算得到乙醇殘留率為（0.430±0.056）%，在規(guī)定范圍內(nèi)，表明脂質(zhì)體中乙醇殘留率殘留較低，安全性較高。

2.5 脂質(zhì)體形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

由圖4可知，蛋清肽脂質(zhì)體多呈現(xiàn)球形或類球形，且顆粒均勻分散。粒徑約為100～200 nm，與粒徑分析結(jié)果基本一致。

圖4 蛋清肽脂質(zhì)體的透射電子顯微鏡圖（×7 000）Fig. 4 Transmission electron micrograph of egg white peptide liposomes (× 7 000)

2.6 蛋清肽脂質(zhì)體的體外釋放特性

良好的體外釋放性能是脂質(zhì)體的重要特征，納米脂質(zhì)體具有良好的聚集包埋能力，因而能夠減緩內(nèi)水相中親水性短肽遷移到介質(zhì)中的速度[5]。如圖5所示，在SGF中（前2 h），游離蛋清肽快速釋放到介質(zhì)中，2 h時釋放率達到（64±7）%。而脂質(zhì)體中蛋清肽的釋放率較低，為（48±6）%。在SGF環(huán)境下，脂質(zhì)體具有延遲肽釋放的功效，體現(xiàn)出良好的緩釋效果。在SIF中（2 h以后），蛋清肽脂質(zhì)體在1 h內(nèi)，蛋清肽釋放率明顯增加，可見蛋清肽脂質(zhì)體對pH值具有一定的敏感性，當環(huán)境由胃液（酸性）向腸液（弱堿性）變化，會促進釋放內(nèi)容物，出現(xiàn)突釋現(xiàn)象。在3～5 h內(nèi)，蛋清肽脂質(zhì)體釋放率趨于穩(wěn)定，5 h后開始逐漸釋放，但仍低于同時間游離肽的釋放率。在模擬胃、腸環(huán)境中50 h后，脂質(zhì)體中的蛋清肽和游離蛋清肽均完全釋放。由于脂質(zhì)體的壁材中磷脂成分不會被酶促降解，因此有效保護了包封的藥物，實現(xiàn)了蛋清肽的延緩釋放[32]。

圖5 蛋清肽脂質(zhì)體和游離蛋清肽的體外緩釋效果Fig. 5 In vitro release efficiency of egg white peptides liposomes and free egg white peptides

2.7 蛋清肽脂質(zhì)體的體內(nèi)釋放特性

在體內(nèi)緩釋實驗中，由于動物體內(nèi)內(nèi)源性肽等本底因素對混合肽含量測定存在較大干擾，選擇血液中賴氨酸、色氨酸、苯 丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸和蛋氨酸6 種標志性必需氨基酸作為檢測標志物，通過其質(zhì)量濃度間接考察蛋清肽在小鼠體內(nèi)的緩釋情況，結(jié)果如表1所示。

表1 血清中6 種必需氨基酸質(zhì)量濃度變化Table 1 Changes in the concentration of six essential amino acids in blood

隨灌胃時間延長，血清中6 種標志性必需氨基酸質(zhì)量濃度均出現(xiàn)明顯變化，其中蛋清肽組小鼠血清中賴氨酸和蘇氨酸質(zhì)量濃度先升高再降低，在4 h時達到峰值，分別為（136.92±102.63）ng/L和（51.28±38.93）ng/L，而色氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸在0.5 h和2 h具有較高的質(zhì)量濃度，其最大質(zhì)量濃度峰出現(xiàn)時間分別為0.5、2、2 h和2 h。脂質(zhì)體組氨基酸質(zhì)量濃度峰值出現(xiàn)延后的現(xiàn)象，其中色氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸和蛋氨酸的最大質(zhì)量濃度峰值出現(xiàn)時間延遲至4 h，最大質(zhì)量濃度分別提升為（3 850.08±2 674.37）、（1 239.90±938.93）、（974.58±753.65）、（1 576.20±1 131.25）ng/L。并且脂質(zhì)體組氨基酸的最大質(zhì)量濃度均明顯高于蛋清肽組的最大的質(zhì)量濃度，賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸的最大質(zhì)量濃度分別提高523.53%、156.72%、132.13%、326.29%、345.97%和109.31%。

對比蛋清肽組、空白組可以發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體可以有效延緩蛋清肽的釋放，劇烈性釋放時間大約在4 h，這與體外釋放結(jié)果基本一致。并且對比其他兩組可以發(fā)現(xiàn)，氨基酸質(zhì)量濃度在峰值時，脂質(zhì)體組的氨基酸質(zhì)量濃度明顯高于蛋清肽組。由于檢測對象為必需氨基酸，必須通過外界補充蛋白質(zhì)獲得，因此可以猜測，脂質(zhì)體在發(fā)揮緩釋效果的同時，可能具有一定促進蛋清肽吸收的作用。

3 結(jié) 論

本實驗以蛋清肽包埋率、粒徑為主要評價指標，通過單因素試驗確定了蛋清肽脂質(zhì)體的最優(yōu)工藝參數(shù)為：膽固醇質(zhì)量濃度2 mg/mL、蛋黃卵磷脂質(zhì)量濃度10 mg/mL、高壓均質(zhì)壓力40 MPa、均質(zhì)時間7 min、芯壁體積比3∶5、超聲功率100 W、超聲時間30 s、穩(wěn)定劑T-80。最終可以得到包埋率（65.7±3.6）%、粒徑（89.4±2.4）nm、乙醇殘留率（0.430±0.056）%的蛋清肽脂質(zhì)體。并通過體內(nèi)、體外的緩釋實驗證實，脂質(zhì)體在發(fā)揮緩釋效果的同時，可能具有一定促進蛋清肽吸收的作用。本研究以蛋清抗氧化肽為切入點，通過構(gòu)建蛋清肽脂質(zhì)體運載體系，優(yōu)化蛋清肽脂質(zhì)體生產(chǎn)工藝，并通過體外/體內(nèi)實驗探索其緩釋作用，最終獲得了一種粒徑較小、包埋率較高、緩釋效果較好的蛋清肽脂質(zhì)體，結(jié)果能為蛋清肽脂質(zhì)體產(chǎn)品開發(fā)提供一定技術(shù)支持。