基于乙醇注入-高壓均質(zhì)的蛋清肽脂質(zhì)體制備及體內(nèi)外緩釋效果

張 婷，溫鶴迪，宋敬一，葛慧芳，王明華，陳 艷，劉博群，劉靜波

（吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林省營(yíng)養(yǎng)與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130062）

活性肽是指蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)水解后產(chǎn)生的生物活性片段，由2～20 個(gè)氨基酸通過(guò)不同排列組合構(gòu)成[1]。由于其特殊的結(jié)構(gòu)，活性肽具有多種生物活性[2]。在過(guò)去的20 年里，人們隨著研究的加深，對(duì)活性肽的認(rèn)知也越來(lái)越全面[3]。但是，肽在胃腸道及小腸上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)能力較弱。由于胃液較強(qiáng)的酸性、蛋白酶以及小腸上皮細(xì)胞中的酶會(huì)使肽在吸收轉(zhuǎn)運(yùn)、發(fā)揮生理活性之前即被降解，即使少數(shù)肽可以實(shí)現(xiàn)完整轉(zhuǎn)運(yùn)，但依然不能實(shí)現(xiàn)全部轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致肽的生物利用度較低。Ding Long等[4]通過(guò)研究肽RVPSL發(fā)現(xiàn)，即使肽可以完整轉(zhuǎn)運(yùn)，但依然存在（36.31±1.22）%的部分會(huì)被小腸緣膜降解。因此，如何獲得高效且完整的肽運(yùn)載方式吸引了國(guó)內(nèi)外研究者關(guān)注。包埋活性肽具有諸多優(yōu)點(diǎn)：控制和減緩活性肽在體內(nèi)的提前降解；促進(jìn)活性肽的吸收；增強(qiáng)藥代動(dòng)力學(xué)，延長(zhǎng)肽在機(jī)體的保留時(shí)間，提高吸收利用率[5-7]。目前已知的運(yùn)載體系種類廣泛，脂質(zhì)體、納米乳液、納米顆粒等運(yùn)載體系均可以實(shí)現(xiàn)肽在生物體內(nèi)輸送[8]。

Gregoriadis[8]、Lasic[9]等提出將脂質(zhì)體作為一種新型的藥物傳遞系統(tǒng)進(jìn)行研究。脂質(zhì)體主要原料為磷脂和膽固醇，結(jié)構(gòu)類似于生物膜，其安全性高[10]。脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)上具有親水頭部和疏水尾部，親水性物質(zhì)進(jìn)入親水性內(nèi)核中，而疏水性物質(zhì)則進(jìn)入磷脂雙分子層中，因此脂質(zhì)體同時(shí)具有包埋親水和疏水物質(zhì)的能力。另外，脂質(zhì)體可以避免包埋的藥物被提前降解，延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的保留時(shí)間[11-12]。目前脂質(zhì)體已經(jīng)成功應(yīng)用于蛋白質(zhì)、酶、抗氧化劑、抗菌劑等活性物質(zhì)的包埋，并表現(xiàn)出良好的發(fā)展前景[13]。近年來(lái)，隨著研究人員對(duì)活性肽了解的逐步深入，脂質(zhì)體負(fù)載活性肽的研究也逐步展開(kāi)。龔魁杰[5]通過(guò)薄膜分散法制得花生短肽納米脂質(zhì)體，結(jié)果表明脂質(zhì)體具有高包封率、良好的酸堿穩(wěn)定性以及緩釋效果和抗消化能力。Maherani等[14]通過(guò)薄膜水化法實(shí)現(xiàn)納米脂質(zhì)體包封天然二肽抗氧化劑（L-肌肽），脂質(zhì)體的包封可以改善抗氧劑肽的穩(wěn)定性低、活性易降低的缺陷，促進(jìn)抗氧化劑肽在食品工業(yè)中的應(yīng)用。吳琦[15]以逆向旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法制得抗氧化蛋清肽脂質(zhì)體，并通過(guò)體外模擬消化實(shí)驗(yàn)證實(shí)脂質(zhì)體對(duì)抗氧化蛋清肽具有一定的保護(hù)作用，可以延緩蛋清肽的釋放并提高抗氧化肽的貯藏穩(wěn)定性。

然而由于活性肽的強(qiáng)親水性，肽更易存在于外水相或者假內(nèi)水相中，從而可能出現(xiàn)包埋率較低、釋放速率過(guò)快、包埋效果差等問(wèn)題。這些問(wèn)題需要通過(guò)不斷調(diào)整脂質(zhì)體制備工藝來(lái)解決。乙醇注入法優(yōu)點(diǎn)在于能比較快速形成脂質(zhì)體，在實(shí)驗(yàn)操作上比較簡(jiǎn)單，且方法柔和、對(duì)藥物影響較小。Shaker[16]、Zou Liqiang[17]、Hashemi[18]等均通過(guò)乙醇注入法制得粒徑較小、包埋率較高且具有良好緩釋效果的脂質(zhì)體。而高壓均質(zhì)法所制備脂質(zhì)體具有重現(xiàn)性好、可大規(guī)模生產(chǎn)、微粒均勻且穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[19-20]。因此本研究采用乙醇注入法結(jié)合高壓均質(zhì)機(jī)制備脂質(zhì)體，并優(yōu)化工藝條件。另外，有關(guān)活性肽脂質(zhì)體的延緩釋放實(shí)驗(yàn)?zāi)壳岸嗉杏隗w外胃腸道模擬消化實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)消化實(shí)驗(yàn)研究較少，本研究通過(guò)體外胃腸道模擬消化實(shí)驗(yàn)以及小鼠模型分析了蛋清肽脂質(zhì)體在體外以及體內(nèi)的對(duì)蛋清肽緩釋效果。研究可為功能肽的活性保護(hù)提供綠色、高效的技術(shù)支持，并為開(kāi)發(fā)功能性食品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

雄性KM小鼠（7～8 周齡，生產(chǎn)許可證：SCXK（京）2016-0011） 北京維通利華公司。

蛋黃卵磷脂（純度≥95%） 北京索萊寶科技有限公司；膽固醇（純度≥98%） 上海艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司；吐溫20（Tween 20，T-20）、吐溫-80（Tween-80，T-80）、酪蛋白酸鈉（sodium casein phosphate，Scp）、辛烯基琥珀酸酐（octenyl succinic anhydride，Osa） 上海麥克林生化科技有限公司；蛋清肽（200 Da～1 kDa）由實(shí)驗(yàn)室自制；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓均質(zhì)機(jī) 上海綿竹機(jī)械設(shè)備有限公司；FJ300-SH高速分散機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；納米激光粒度儀 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；HYQ-3110渦旋混合器賽伯樂(lè)（上海）儀器有限公司；Cence湘儀離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；紫外分光光度計(jì) 島津國(guó)際貿(mào)易（上海）公司；酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司；GCMS-QP2010 Ultra氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀 日本島津公司；H-7650透射電子顯微鏡 日本日立公司；ACQUITY TQD液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（liquid chromatography-tandem mass spectrometer，LC-MS/MS）沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 空白脂質(zhì)體的制備

稱取一定量的蛋黃卵磷脂和膽固醇溶解在50 ℃的無(wú)水乙醇中，蛋黃卵磷脂質(zhì)量濃度為0.5～20 mg/mL，膽固醇質(zhì)量濃度為蛋黃卵磷脂的1/5。首先利用高速分散機(jī)在19 000 r/min條件下剪切均質(zhì)5 min，然后使用高壓均質(zhì)機(jī)在0～40 MPa條件下高壓均質(zhì)3～11 min。在磁力攪拌器上，通過(guò)注射器針頭將蛋黃卵磷脂/膽固醇-乙醇溶液緩慢勻速地滴加到去離子水中，并通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，制得空白脂質(zhì)體，并測(cè)定空白脂質(zhì)體的粒徑和多分散性指數(shù)（polydispersity index，PDI）。單因素試驗(yàn)時(shí)分別控制蛋黃卵磷脂質(zhì)量濃度為10 mg/mL，高壓均質(zhì)壓力為20 MPa，時(shí)間為7 min。

1.3.2 脂質(zhì)體穩(wěn)定劑的篩選

分別將蛋黃卵磷脂質(zhì)量1%的酪蛋白酸鈉、T-20、T-80、Osa與空白脂質(zhì)體溶解在50 ℃的乙醇中，制得含穩(wěn)定劑的空白脂質(zhì)體，每間隔5 d測(cè)定一次脂質(zhì)體的粒徑和PDI。通過(guò)觀察常溫貯藏條件下，脂質(zhì)體粒徑和PDI在30 d內(nèi)的變化情況來(lái)衡量脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，并篩選出最佳穩(wěn)定劑。

1.3.3 粒徑和PDI的測(cè)定

將制備好的空白脂質(zhì)體稀釋100 倍，用納米激光粒度儀進(jìn)行粒徑及PDI測(cè)定。

1.3.4 負(fù)載蛋清肽脂質(zhì)體的制備

將蛋清肽溶解在去離子水中，質(zhì)量濃度與空白脂質(zhì)體中蛋黃卵磷脂相同。在磁力攪拌器上，將空白脂質(zhì)體通過(guò)注射器針頭緩慢勻速地滴加到蛋清肽溶液中，混合后進(jìn)行超聲處理，并通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，最終得到負(fù)載蛋清肽的脂質(zhì)體顆粒。

根據(jù)上述步驟，考察脂質(zhì)體中肽與壁材的體積比（1∶10、1∶5、3∶5、5∶5、5∶3、5∶1）、超聲時(shí)間（0、30、60、90、120、150 s）和超聲功率（0、100、200、300、400、500 W）對(duì)脂質(zhì)體包埋率、負(fù)載率以及粒徑、PDI的影響。單因素試驗(yàn)優(yōu)化某一參數(shù)時(shí)，分別控制芯壁體積比為5∶5，超聲時(shí)間為60 s，超聲功率為100 W。

1.3.5 蛋清肽脂質(zhì)體包埋率和負(fù)載率的測(cè)定

采用間接法測(cè)定蛋清肽脂質(zhì)體的包埋率[21]。將蛋清肽脂質(zhì)體放置于截留分子質(zhì)量5 kDa的超濾離心管內(nèi)襯管中，3 500 r/min條件下離心15 min，濾過(guò)液即為未被包埋的蛋清肽液，用磷酸鹽緩沖液（0.01 mmol/L、pH 7.2）將其稀釋10 倍后測(cè)定其在220 nm波長(zhǎng)處的吸光度，根據(jù)蛋清肽標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到游離蛋清肽質(zhì)量濃度。蛋清肽標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的蛋清肽溶液，隨后用磷酸鹽緩沖液將蛋清肽溶液依次稀釋至0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2 mg/mL，檢測(cè)蛋清肽溶液在220 nm波長(zhǎng)處的吸光度，并擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋清肽包埋率和負(fù)載率分別按公式（1）、（2）計(jì)算。

1.3.6 脂質(zhì)體乙醇?xì)埩袈实臏y(cè)定

利用自動(dòng)頂空-GC-MS法測(cè)定脂質(zhì)體中殘留的乙醇質(zhì)量[22]。

GC條件：Rxi-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為氦氣，流速為1 mL/min，進(jìn)樣口溫度為150 ℃，分流進(jìn)樣，分流比為1∶30，柱溫60 ℃，保持5 min。

MS條件：離子源溫度250 ℃，電離方式為電子轟擊，電離能70 eV，傳輸線溫度250 ℃，掃描模式選擇離子檢測(cè)模式，掃描間隔0.1 s，掃描質(zhì)量范圍29～150 amu。頂空條件：頂空瓶體積20 mL，進(jìn)樣體積5 mL，水浴溫度60 ℃，平衡20 min。

對(duì)照溶液配制：精確稱量107.26 mg無(wú)水乙醇，用超純水定容至10 mL，配制對(duì)照儲(chǔ)備液。分別量取0.1、0.2、0.5、1、2 mL儲(chǔ)備液，用超純水定容至10 mL，混勻后作為對(duì)照溶液備用。按照頂空條件處理后進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，將峰面積和質(zhì)量濃度擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品溶液：將脂質(zhì)體溶液稀釋8 倍，混勻后備用。按照對(duì)照處理方法，記錄峰面積，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定乙醇質(zhì)量濃度，計(jì)算得到殘留的乙醇質(zhì)量，并按公式（3）計(jì)算得到脂質(zhì)體乙醇?xì)埩袈蔥23]。

1.3.7 蛋清肽脂質(zhì)體形態(tài)學(xué)觀察

將脂質(zhì)體稀釋10 倍，滴在專用銅網(wǎng)上，用體積分?jǐn)?shù)1%磷鎢酸染色1 min，自然晾干后，利用H-7650透射電子顯微鏡在80 kV電壓下觀察蛋清肽脂質(zhì)體的微觀形貌。

1.3.8 蛋清肽脂質(zhì)體體外模擬緩釋實(shí)驗(yàn)

體外模擬緩釋實(shí)驗(yàn)利用透析袋構(gòu)建了模擬胃液（stimulated gastric fluid，SGF）和模擬腸液（simulated intestinal fluid，SIF）環(huán)境[24]，比較蛋清肽脂質(zhì)體和游離蛋清肽在SGF和SIF中的蛋清肽釋放率。

SGF配制：500 mL容量瓶中依次加入6.9 mL KCl（0.5 mol/L）、0.9 mL KH2PO4（0.5 mol/L）、12.5 mL NaHCO3（1 mol/L）、11.8 mL NaCl（2 mol/L）、0.4 mL MgCl2·6H2O（0.15 mol/L）、10.5 mL(NH4)2CO3（0.5 mol/L），用蒸餾水定容，備用。

SIF配制：500 mL容量瓶中依次加入6.8 mL KCl（0.5 mol/L）、0.8 mL KH2PO4（0.5 mol/L）、42.5 mL NaHCO3（1 mol/L）、9.6 mL NaCl（2 mol/L）、1.1 mL MgCl2·6H2O（0.15 mol/L），用蒸餾水定容，備用。

分別將2 mL蛋清肽脂質(zhì)體和2 mL同質(zhì)量濃度的未包埋的蛋清肽放置到預(yù)先浸泡的透析袋中（截留分子質(zhì)量5 kDa）。分別將每個(gè)透析袋懸浮在50 mL離心管中，離心管中含有20 mL pH 2的SGF溶液，扣緊離心管的蓋子。然后放置在恒溫培養(yǎng)箱（120 r/min，37 ℃）中溫育。每隔20 min取樣，每次取樣0.2 mL。隨即加入等體積的SGF（0.2 mL）。2 h后，加入20 mL SIF與SGF消化液混合，并將pH值調(diào)整為7.4。SIF取樣方式與SGF相同，分別在3、4、5、7、9、24、48 h時(shí)取樣0.2 mL，再加入0.2 mL的SIF。取出的樣品置于超濾離心管中，離心（3 500 r/min、15 min）后，測(cè)定濾過(guò)液中蛋清肽的質(zhì)量濃度，即得到蛋清肽的累積釋放質(zhì)量。按式（4）計(jì)算蛋清肽釋放率。

1.3.9 蛋清肽體內(nèi)緩釋實(shí)驗(yàn)

小鼠于飼養(yǎng)室（溫度22～25 ℃、相對(duì)濕度65%）適應(yīng)環(huán)境一周，期間自由進(jìn)食、飲水。一周后對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行禁食，并隨機(jī)分為3 組：空白對(duì)照組、蛋清肽組、蛋清肽脂質(zhì)體組，每組36 只。其中，空白對(duì)照組灌胃生理鹽水（0.25 mL/20 gmb），蛋清肽組根據(jù)100 mg/kgmb的給藥劑量灌胃蛋清抗氧化肽溶液，蛋清肽脂質(zhì)體組灌胃蛋清抗氧化肽脂質(zhì)體生理鹽水溶液，灌胃劑量根據(jù)蛋清肽脂質(zhì)體的包埋率確定以保證蛋清肽的最終劑量為100 mg/kgmb。采血時(shí)間點(diǎn)為給藥后0.5、1、2、4、6 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取6 只小鼠進(jìn)行眼眶取血，采血完成后，實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行頸部脫臼處死。血液置于1.5 mL離心管中，室溫靜置1～2 h后，4 000 r/min條件離心10 min，上清液即為血清樣品[25]。

血清樣品按照體積比1∶3加入乙腈，漩渦混勻后超聲15 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液。上清液中加入0.03 g NaCl，再次離心（10 000 r/min、10 min），取上清液400 μL，分別加入400 μL碳酸鹽緩沖液和400 μL Fmoc-Cl衍生試劑，充分混合后在室溫下反應(yīng)20 min，樣品過(guò)0.22 mm水系微孔濾膜，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

利用LC-MS/MS對(duì)血清中多種氨基酸含量進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)條件：流動(dòng)相A：體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液；流動(dòng)相B：乙腈；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。洗脫程序：0～20 min，20%～100%流動(dòng)相B。電噴霧離子源參數(shù)：霧化器氣體（N2）壓力50 psi；干燥氣體（N2）流速12 L/min，干燥氣體溫度350 ℃[26]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)3 個(gè)平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并利用SPSS 19軟件進(jìn)行單因素方差分析，運(yùn)用t檢驗(yàn)在P＜0.05水平進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同條件對(duì)空白脂質(zhì)體粒徑和PDI的影響

由圖1A可知，蛋黃卵磷脂質(zhì)量濃度會(huì)對(duì)空白脂質(zhì)體粒徑和PDI產(chǎn)生顯著影響（P＜0.05）。隨著蛋黃卵磷脂質(zhì)量濃度增加，粒徑先減小后增大。獲得更加穩(wěn)定的脂質(zhì)體，應(yīng)盡量選擇粒徑較小的脂質(zhì)體[27]。同時(shí)考慮到后續(xù)的蛋清肽負(fù)載效果，選擇蛋黃卵磷脂質(zhì)量濃度10 mg/mL進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，此時(shí)粒徑為（95.0±0.8）nm，PDI為0.210±0.009。由圖1B可知，未加壓力時(shí)空白脂質(zhì)體粒徑為（259.1±2.5）nm，隨著均質(zhì)壓力增加，空白脂質(zhì)體粒徑呈下降趨勢(shì)。在均質(zhì)壓力達(dá)到最高（40 MPa）時(shí)粒徑最?。ǎ?6.0±0.6）nm）?？紤]到高壓均質(zhì)機(jī)的參數(shù)限制，選擇40 MPa為最佳實(shí)驗(yàn)條件。由圖1C可知，脂質(zhì)體的粒徑隨著均質(zhì)時(shí)間的延長(zhǎng)先減小后增大，均質(zhì)7 min時(shí)可以得到粒徑最小的脂質(zhì)體，此時(shí)粒徑為（78.6±13.1）nm，PDI為0.28±0.13。雖然高壓均質(zhì)可以顯著降低脂質(zhì)體粒徑，但是隨著均質(zhì)時(shí)間延長(zhǎng)，過(guò)小的脂質(zhì)體會(huì)在表面張力的作用下重新聚合，從而出現(xiàn)粒徑增大、PDI增大的現(xiàn)象[28]。此外，隨著均質(zhì)時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品溫度的升高也會(huì)導(dǎo)致粒徑增大。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，高壓均質(zhì)輔助制備得到的脂質(zhì)體具有更小的粒徑，邰克東[28]和丁麗燕[29]等的實(shí)驗(yàn)也得到相似的結(jié)論。綜上，最終選擇2 mg/mL膽固醇、10 mg/mL蛋黃卵磷脂、40 MPa高壓均質(zhì)7 min作為空白脂質(zhì)體的制備條件，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同制備條件對(duì)空白脂質(zhì)體粒徑和PDI的影響Fig. 1 Effect of different preparation conditions on the particle size and PDI of blank liposomes

2.2 不同穩(wěn)定劑對(duì)空白脂質(zhì)體粒徑和PDI的影響

穩(wěn)定劑的選擇對(duì)運(yùn)載體系的穩(wěn)定性至關(guān)重要。適宜穩(wěn)定劑的加入可以通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)體的表面電荷以及表面親水親脂性等來(lái)達(dá)到提高包埋率、穩(wěn)定性等目的。穩(wěn)定劑的種類對(duì)脂質(zhì)體的作用有很大影響，選擇常見(jiàn)的4 種表面活性劑（Scp、T-20、T-80、Osa）進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)。如圖2A所示，未加穩(wěn)定劑的空白脂質(zhì)體隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)粒徑逐漸增大；加入Scp后，空白脂質(zhì)體粒徑明顯增加，加入Osa的空白脂質(zhì)體與未加穩(wěn)定劑的空白脂質(zhì)體粒徑變化趨勢(shì)相似，但粒徑大于空白脂質(zhì)體，出現(xiàn)這種變化的原因可能是Scp、Osa的加入引起脂質(zhì)體聚集，從而導(dǎo)致粒徑增加；加入T-20與T-80后，空白脂質(zhì)體粒徑在0～20 d內(nèi)隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，可能是因?yàn)楸砻婊钚詣┛梢栽龃笾|(zhì)體表面電荷密度，并具有增強(qiáng)脂質(zhì)體間靜電斥力的作用，引起粒子粒徑減小并且趨于穩(wěn)定[30-31]。由圖2B可以看出，空白脂質(zhì)體隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)PDI整體呈上升趨勢(shì)，相較而言，添加T-80的空白脂質(zhì)體在貯存期間PDI較為穩(wěn)定，且小于未加穩(wěn)定劑組，說(shuō)明T-80可以保證脂質(zhì)體在30 d內(nèi)具有良好的貯藏穩(wěn)定性，因此選擇T-80為脂質(zhì)體穩(wěn)定劑。

圖2 不同穩(wěn)定劑對(duì)空白脂質(zhì)體粒徑（A）和PDI（B）的影響Fig. 2 Effect of different stabilizers on the particle size (A) and the PDI (B)of blank liposomes

2.3 不同因素對(duì)脂質(zhì)體負(fù)載蛋清肽的影響

蛋清源活性肽是親水性物質(zhì)，可隨水分子進(jìn)入脂質(zhì)體內(nèi)水相，從而實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)體對(duì)蛋清肽的負(fù)載以及保護(hù)。由于蛋清肽的親水性極強(qiáng)，極易分散在外水相中，因此芯壁體積比的選擇對(duì)脂質(zhì)體的包埋率和負(fù)載率有重要意義。由圖3A1可以看出，隨著芯壁體積比的變化，抗氧化肽包埋率和負(fù)載率均呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，當(dāng)芯壁體積比達(dá)到3∶5時(shí)，包埋率（（49.71±1.6）%）和負(fù)載率（（17.1±0.5）%）達(dá)到最大值，此時(shí)外水相蛋清肽、卵磷脂質(zhì)量濃度適宜，利于脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的形成，且具有最高的包埋能力。而隨著芯壁體積比的進(jìn)一步增大，外水相蛋清肽濃度逐漸增加，已經(jīng)包埋于脂質(zhì)體內(nèi)部的親水性蛋清肽又重新轉(zhuǎn)移至外水相中，從而導(dǎo)致包埋率和負(fù)載率降低。進(jìn)一步觀察芯壁體積比對(duì)脂質(zhì)體的粒徑的影響（圖3A2），當(dāng)芯壁體積比在1∶5～5∶3時(shí)，體系具有良好的粒徑分布和穩(wěn)定性，因此確定最佳芯壁體積比為3∶5。

圖3 不同因素對(duì)包埋率、負(fù)載率、粒徑和PDI的影響Fig. 3 Influence of different factors on encapsulation efficiency,loading rate, particle size and PDI

超聲輔助能夠增加分散相體積、減小液滴尺寸，進(jìn)而輔助脂質(zhì)體包埋蛋清肽。由圖3B1、B2可以看出，包埋率隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)先增大后降低，超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能不利于脂質(zhì)體的形成，從而降低了其對(duì)蛋清肽的包埋率。在超聲30 s時(shí)脂質(zhì)體的包埋能力最高（包埋率（63.8±2.0）%、負(fù)載率（14.3±1.0）%），此時(shí)蛋清肽脂質(zhì)體粒徑為（220±1）nm，PDI為0.24±0.02，因此確定30 s為最佳超聲時(shí)間。

由圖3C1、C2可知，超聲處理可以明顯提升脂質(zhì)體對(duì)蛋清抗氧化肽的包埋率和負(fù)載率，但超聲功率在100～500 W范圍內(nèi)對(duì)二者的影響無(wú)明顯差異。超聲功率為100 W時(shí)，包埋率為（61.3±1.1）%，負(fù)載率為（13.7±0.4）%，粒徑為（230±5）nm，PDI為0.350±0.014。因此選擇超聲功率100 W進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

綜上，確定蛋清肽與空白脂質(zhì)體的體積比3∶5、100 W超聲30 s為最佳實(shí)驗(yàn)條件，制得的蛋清肽脂質(zhì)體，包埋率為（65.7±3.6）%，粒徑為（89.4±2.4）nm。

2.4 脂質(zhì)體的乙醇?xì)埩袈?/h3>

采用乙醇注入法制備脂質(zhì)體，會(huì)出現(xiàn)大量乙醇?xì)埩舻默F(xiàn)象?！吨袊?guó)藥典》中要求乙醇的殘留率不得超過(guò)0.5%，新版《中國(guó)藥典》要求脂質(zhì)體制劑必須對(duì)有機(jī)溶劑殘留量進(jìn)行檢查。為了保證脂質(zhì)體的安全性及穩(wěn)定性，需要測(cè)定脂質(zhì)體中乙醇的殘留量。通過(guò)對(duì)照溶液的測(cè)定，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝350.08x－25 388，R2＝0.998 9。計(jì)算得到乙醇?xì)埩袈蕿椋?.430±0.056）%，在規(guī)定范圍內(nèi)，表明脂質(zhì)體中乙醇?xì)埩袈蕷埩糨^低，安全性較高。

2.5 脂質(zhì)體形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

由圖4可知，蛋清肽脂質(zhì)體多呈現(xiàn)球形或類球形，且顆粒均勻分散。粒徑約為100～200 nm，與粒徑分析結(jié)果基本一致。

圖4 蛋清肽脂質(zhì)體的透射電子顯微鏡圖（×7 000）Fig. 4 Transmission electron micrograph of egg white peptide liposomes (× 7 000)

2.6 蛋清肽脂質(zhì)體的體外釋放特性

良好的體外釋放性能是脂質(zhì)體的重要特征，納米脂質(zhì)體具有良好的聚集包埋能力，因而能夠減緩內(nèi)水相中親水性短肽遷移到介質(zhì)中的速度[5]。如圖5所示，在SGF中（前2 h），游離蛋清肽快速釋放到介質(zhì)中，2 h時(shí)釋放率達(dá)到（64±7）%。而脂質(zhì)體中蛋清肽的釋放率較低，為（48±6）%。在SGF環(huán)境下，脂質(zhì)體具有延遲肽釋放的功效，體現(xiàn)出良好的緩釋效果。在SIF中（2 h以后），蛋清肽脂質(zhì)體在1 h內(nèi)，蛋清肽釋放率明顯增加，可見(jiàn)蛋清肽脂質(zhì)體對(duì)pH值具有一定的敏感性，當(dāng)環(huán)境由胃液（酸性）向腸液（弱堿性）變化，會(huì)促進(jìn)釋放內(nèi)容物，出現(xiàn)突釋現(xiàn)象。在3～5 h內(nèi)，蛋清肽脂質(zhì)體釋放率趨于穩(wěn)定，5 h后開(kāi)始逐漸釋放，但仍低于同時(shí)間游離肽的釋放率。在模擬胃、腸環(huán)境中50 h后，脂質(zhì)體中的蛋清肽和游離蛋清肽均完全釋放。由于脂質(zhì)體的壁材中磷脂成分不會(huì)被酶促降解，因此有效保護(hù)了包封的藥物，實(shí)現(xiàn)了蛋清肽的延緩釋放[32]。

圖5 蛋清肽脂質(zhì)體和游離蛋清肽的體外緩釋效果Fig. 5 In vitro release efficiency of egg white peptides liposomes and free egg white peptides

2.7 蛋清肽脂質(zhì)體的體內(nèi)釋放特性

在體內(nèi)緩釋實(shí)驗(yàn)中，由于動(dòng)物體內(nèi)內(nèi)源性肽等本底因素對(duì)混合肽含量測(cè)定存在較大干擾，選擇血液中賴氨酸、色氨酸、苯 丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸和蛋氨酸6 種標(biāo)志性必需氨基酸作為檢測(cè)標(biāo)志物，通過(guò)其質(zhì)量濃度間接考察蛋清肽在小鼠體內(nèi)的緩釋情況，結(jié)果如表1所示。

表1 血清中6 種必需氨基酸質(zhì)量濃度變化Table 1 Changes in the concentration of six essential amino acids in blood

隨灌胃時(shí)間延長(zhǎng)，血清中6 種標(biāo)志性必需氨基酸質(zhì)量濃度均出現(xiàn)明顯變化，其中蛋清肽組小鼠血清中賴氨酸和蘇氨酸質(zhì)量濃度先升高再降低，在4 h時(shí)達(dá)到峰值，分別為（136.92±102.63）ng/L和（51.28±38.93）ng/L，而色氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸在0.5 h和2 h具有較高的質(zhì)量濃度，其最大質(zhì)量濃度峰出現(xiàn)時(shí)間分別為0.5、2、2 h和2 h。脂質(zhì)體組氨基酸質(zhì)量濃度峰值出現(xiàn)延后的現(xiàn)象，其中色氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸和蛋氨酸的最大質(zhì)量濃度峰值出現(xiàn)時(shí)間延遲至4 h，最大質(zhì)量濃度分別提升為（3 850.08±2 674.37）、（1 239.90±938.93）、（974.58±753.65）、（1 576.20±1 131.25）ng/L。并且脂質(zhì)體組氨基酸的最大質(zhì)量濃度均明顯高于蛋清肽組的最大的質(zhì)量濃度，賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸的最大質(zhì)量濃度分別提高523.53%、156.72%、132.13%、326.29%、345.97%和109.31%。

對(duì)比蛋清肽組、空白組可以發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體可以有效延緩蛋清肽的釋放，劇烈性釋放時(shí)間大約在4 h，這與體外釋放結(jié)果基本一致。并且對(duì)比其他兩組可以發(fā)現(xiàn)，氨基酸質(zhì)量濃度在峰值時(shí)，脂質(zhì)體組的氨基酸質(zhì)量濃度明顯高于蛋清肽組。由于檢測(cè)對(duì)象為必需氨基酸，必須通過(guò)外界補(bǔ)充蛋白質(zhì)獲得，因此可以猜測(cè)，脂質(zhì)體在發(fā)揮緩釋效果的同時(shí)，可能具有一定促進(jìn)蛋清肽吸收的作用。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以蛋清肽包埋率、粒徑為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了蛋清肽脂質(zhì)體的最優(yōu)工藝參數(shù)為：膽固醇質(zhì)量濃度2 mg/mL、蛋黃卵磷脂質(zhì)量濃度10 mg/mL、高壓均質(zhì)壓力40 MPa、均質(zhì)時(shí)間7 min、芯壁體積比3∶5、超聲功率100 W、超聲時(shí)間30 s、穩(wěn)定劑T-80。最終可以得到包埋率（65.7±3.6）%、粒徑（89.4±2.4）nm、乙醇?xì)埩袈剩?.430±0.056）%的蛋清肽脂質(zhì)體。并通過(guò)體內(nèi)、體外的緩釋實(shí)驗(yàn)證實(shí)，脂質(zhì)體在發(fā)揮緩釋效果的同時(shí)，可能具有一定促進(jìn)蛋清肽吸收的作用。本研究以蛋清抗氧化肽為切入點(diǎn)，通過(guò)構(gòu)建蛋清肽脂質(zhì)體運(yùn)載體系，優(yōu)化蛋清肽脂質(zhì)體生產(chǎn)工藝，并通過(guò)體外/體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探索其緩釋作用，最終獲得了一種粒徑較小、包埋率較高、緩釋效果較好的蛋清肽脂質(zhì)體，結(jié)果能為蛋清肽脂質(zhì)體產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供一定技術(shù)支持。