• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    杜仲葉茯磚茶加工過程中活性成分及微生物多樣性

    2021-07-29 03:26:50邊文文余鄭綠楊文娟呂生華
    食品科學(xué) 2021年13期
    關(guān)鍵詞:磚茶杜仲群落

    曾 橋,段 潔,邊文文,劉 靜,余鄭綠,胡 歆,楊文娟,呂生華

    (1.陜西科技大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院,陜西 西安 710021;2.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,陜西 西安 710021;3.陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,陜西 西安 710048;4.陜西樸道茶業(yè)股份有限公司,陜西 西安 713700;5.咸陽涇渭茯茶有限公司,陜西 咸陽 712000)

    茯磚茶為黑茶類全發(fā)酵茶[1],傳統(tǒng)上主要以黑毛茶為原料,經(jīng)原料篩選、渥堆、氣蒸、壓制成型、發(fā)花干燥和陳化等一系列復(fù)雜工藝制作而成,為所有黑茶中加工工藝最復(fù)雜、最獨(dú)特的產(chǎn)品[2-3]。其中發(fā)花是以冠突散囊菌為主的多菌群發(fā)酵過程,為決定茯磚茶品質(zhì)的關(guān)鍵制作工序,對于形成茯磚茶金花普茂、菌香濃郁、湯色紅濃、口感醇厚的獨(dú)特特征和風(fēng)味具有重要作用。研究表明,茯磚茶具有降脂減肥、抗氧化、抗腫瘤和抑菌等[4-7]多種保健作用,近年來受到消費(fèi)者的青睞。

    杜仲為杜仲科杜仲屬植物,為我國特有樹種。杜仲可利用程度高,其皮和葉為名貴中藥材,杜仲雄花、杜仲籽為新資源食品。《中國藥典》記載杜仲樹皮性甘、溫,而杜仲葉微辛、溫,二者歸肝、腎經(jīng),具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的功能,常用于治療肝腎不足、腰膝酸痛、筋骨無力、頭暈?zāi)垦?。傳統(tǒng)上杜仲主要以皮入藥,對葉的利用相對較少。研究表明,杜仲葉含有豐富的黃酮、綠原酸、多糖、氨基酸、木質(zhì)素、環(huán)烯醚萜類、多酚等[8-12]活性成分,具有降血壓、降血脂、抗疲勞、降血糖、抗氧化、抗腫瘤、抗炎和抗骨質(zhì)疏松等作用[13-17],早在2002年就被列入保健食品物品名單。2019年11月25日,國家衛(wèi)生健康委發(fā)布公告,對杜仲葉等9 種物質(zhì)開展按照藥食同源物質(zhì)生產(chǎn)經(jīng)營試點(diǎn)工作,進(jìn)一步擴(kuò)大了杜仲葉的應(yīng)用范圍,這對于促進(jìn)杜仲產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義。杜仲葉作為可再生資源,在我國分布廣泛,產(chǎn)量巨大,但仍有待于開發(fā)和利用。

    當(dāng)前,杜仲葉的開發(fā)主要以杜仲葉茶為主,包括杜仲葉綠茶、杜仲葉普洱茶、杜仲茶粉、杜仲茶飲料以及以杜仲葉為主的拼配茶等[18],然而現(xiàn)有杜仲葉茶普遍青辛味較重,茶湯發(fā)綠或發(fā)黑,滋味略苦,口感較差,因而未得到市場廣泛認(rèn)可。茯磚茶加工工藝復(fù)雜,其獨(dú)特的發(fā)花工藝不僅賦予了茯磚茶金花普茂的特征,而且可有效改善其風(fēng)味和口感,從而大幅提升產(chǎn)品品質(zhì),為此,本課題組前期以采摘于陜西漢中略陽的杜仲葉為原料,經(jīng)殺青、揉捻、干燥等工藝制成杜仲葉茶,進(jìn)一步采用茯磚茶加工工藝制作成杜仲葉茯磚茶,不僅豐富了茯磚茶產(chǎn)品類型,而且為促進(jìn)杜仲葉的高值化利用提供了新的途徑和方法。本實(shí)驗(yàn)在杜仲葉茯磚茶成功制作基礎(chǔ)上,對杜仲葉茯磚茶加工過程中主要活性成分以及微生物群落結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了研究,并對兩者相關(guān)性進(jìn)行分析,旨在揭示杜仲葉茯磚茶的品質(zhì)形成機(jī)制,為生產(chǎn)高品質(zhì)的杜仲葉茯磚茶提供一定的理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    杜仲葉于2019年5月采于陜西省略陽縣。

    綠原酸、梔子苷、桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、葡萄糖、蘆丁、咖啡因、谷氨酸、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司;乙腈、乙酸、甲醇、磷酸(均為色譜純) 德國Fisher公司;濃硫酸、濃鹽酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、乙二胺四乙酸二鈉、茚三酮(均為分析純)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;氫氧化鈉、堿式乙酸鉛、碳酸鈉、福林-酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化亞錫(均為分析純) 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;苯酚、無水乙醇、甲醇(均為分析純) 天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

    土壤基因組DNA提取試劑盒 美國MP Biomedicals公司;瓊脂糖 西班牙Biowest公司;FastPfuDNA聚合酶北京全式金生物技術(shù)有限公司;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司;NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit建庫試劑盒 美國Bioo Scientific公司;測序試劑盒 美國Illumina公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    U3000高效液相色譜儀(配有二極管陣列檢測器和Chromeleon 7.10色譜工作站) 美國Thermo-Fisher Scientific公司;UV-1100紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;FA2004電子分析天平 上海精科天平有限公司;EX125DZH電子天平 奧豪斯儀器(常州)有限公司;GZX-GF101-2-BS-II電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;KH5200DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;HH-2電熱恒溫水浴鍋 金壇市江南儀器廠;DW-86L486超低溫冰箱青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司;TD5A大容量低速離心機(jī) 長沙英泰儀器有限公司;FD5-2.5冷凍干燥機(jī)美國SIM公司;ELx800酶標(biāo)儀 美國BioTek公司;QuantusTMFluorometer微型熒光計(jì) 美國Promega公司;GeneAmp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀 美國ABI公司;Illumina Miseq測序儀 美國Illumina公司。

    1.3 方法

    1.3.1 杜仲葉茯磚茶的制作工藝

    以同一批次杜仲葉茶(陜西略陽)為原料,經(jīng)篩選、渥堆、氣蒸、壓制成型、發(fā)花干燥、陳化等工藝制成。分別于加工過程中的原料篩選、渥堆、氣蒸與壓制成型(即發(fā)花0 d),發(fā)花4、8、12、18、25 d及陳化1 年這9 個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣,依次編號(hào)為S0~S8,所有樣品分別取樣約200 g,無菌包裝袋密封后貯藏于-80 ℃條件下待用。

    1.3.2 杜仲葉茯磚茶中活性成分分析

    將貯存于-80 ℃下各樣品冷凍干燥后進(jìn)行活性成分分析。水浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)參考GB/T 8305—2013《茶 水浸出物測定》進(jìn)行測定;多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)參考文獻(xiàn)[19]進(jìn)行測定;總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)參照文獻(xiàn)[20]進(jìn)行測定;咖啡堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)參考GB/T 8312—2013《茶 咖啡堿測定》進(jìn)行測定;游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)參考GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量的測定》進(jìn)行測定;多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)參考GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》進(jìn)行測定;綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)參考文獻(xiàn)[21]進(jìn)行測定;京尼平苷、京尼平苷酸和桃葉珊瑚苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)參考文獻(xiàn)[22]進(jìn)行測定。

    1.3.3 杜仲葉茯磚茶中微生物的DNA提取和PCR擴(kuò)增

    采用土壤基因組DNA提取試劑盒分別提取S0~S8階段樣品總DNA,使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量,使用NanoDrop 2000測定DNA質(zhì)量濃度和純度。提取后的各樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,細(xì)菌16S rDNA V3~V4區(qū)引物為338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT),真菌ITS擴(kuò)增區(qū)引物為ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA)和ITS2R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)。PCR程序:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,27 個(gè)循環(huán);72 ℃穩(wěn)定延伸10 min,最后在10 ℃保持至停止。

    1.3.4 杜仲葉茯磚茶中微生物的16S rDNA和ITS序列高通量測序

    將1.3.3節(jié)得到的PCR產(chǎn)物混合后使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行回收產(chǎn)物純化,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并用QuantusTMFluorometer微型熒光計(jì)對回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測定量,使用NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫,在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司基于Illumina平臺(tái)對細(xì)菌V3~V4和真菌ITS1區(qū)序列進(jìn)行高通量測序分析。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    各不同加工階段杜仲葉茯磚茶樣活性成分檢測均重復(fù)3 次,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,活性成分實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用Graph Pad Prism軟件進(jìn)行分析,采用t檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較,相關(guān)性分析采用SPSS Statistics 20軟件處理。原始測序數(shù)據(jù)分別使用Trimmomatic和FLASH軟件進(jìn)行質(zhì)控和拼接[23],進(jìn)一步使用UPARSE軟件根據(jù)97%的相似度對序列進(jìn)行可操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)聚類分析[24],利用RDP Classifier對每條序列進(jìn)行物種分類注釋,16S細(xì)菌和ITS真菌分別使用Silva數(shù)據(jù)庫和Unite真菌數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,確定生物分類信息[25]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 杜仲葉茯磚茶不同加工階段活性成分變化

    杜仲葉茯磚茶加工過程中水浸出物、多糖、總黃酮、咖啡堿、游離氨基酸、多酚、綠原酸、京尼平苷、京尼平苷酸以及桃葉珊瑚苷等活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化見表1。

    表1 杜仲葉茯磚茶不同加工階段活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析Table 1 Analysis of bioactive components content of samples from the manufacturing process of Fuzhuan tea from Eucommia ulmoides leaves%

    由表1可知,杜仲葉茯磚茶中活性成分較為豐富,其中水浸出物、多糖、總黃酮等常見活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于傳統(tǒng)茯磚茶[26]。在S0~S8階段,檢測的所有活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈下降趨勢,其中與S0階段相比,S8階段的水浸出物、咖啡堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別下降6.68%和24.00%,差異顯著,但未達(dá)到極顯著水平(P>0.01)。多糖、總黃酮、游離氨基酸、多酚、綠原酸、京尼平苷、京尼平苷酸和桃葉珊瑚苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在加工過程中明顯下降,和S0階段相比,S8階段上述活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別下降29.60%、32.79%、26.19%、30.71%、62.91%、65.63%、10.83%和30.61%,差異均極顯著(P<0.01)。

    進(jìn)一步對各主要活性成分分析可以發(fā)現(xiàn):在杜仲葉茯磚茶加工程中,水浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)主要在發(fā)花中期(S4~S5)以及陳化過程中(S7~S8)下降較快,分別下降2.29%和2.91%,上述兩個(gè)階段水浸出物下降量占總下降量的76.02%,這可能是由于S4~S5階段冠突散囊菌生長旺盛,消耗了大量的營養(yǎng)成分,而S7~S8階段下降較快可能是間隔時(shí)間較長導(dǎo)致的。杜仲葉茯磚茶中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高,和其他活性成分不同的是,多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在S0~S6階段逐步下降,而在發(fā)花后期及陳化階段(S6~S8)多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)又逐漸上升。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),S5~S6階段下降最為明顯,多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異顯著(P<0.05),這可能是由于一方面冠突散囊菌的生長繁殖利用多糖作為碳源;另一方面糖類物質(zhì)自身在發(fā)酵所產(chǎn)生的較高溫度作用下發(fā)生了脫水、縮合、聚合等焦糖化反應(yīng),從而產(chǎn)生令人愉快的湯色和焦糖香[27]。而S6~S8階段多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升可能是由于冠突散囊菌等微生物所產(chǎn)生的胞外酶將茶磚中的粗纖維降解為可溶性糖,從而使多糖含量有所增加[28]??傸S酮、游離氨基酸和多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)在杜仲葉茯磚茶加工過程中變化趨勢類似,S0、S1和S2階段中總黃酮、游離氨基酸和多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈下降趨勢,但差異未達(dá)到極顯著水平(P>0.01)。從S3階段開始,樣品中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)與S0階段相比,差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01),而多酚、游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)從S4階段起,與S0階段相比差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。綠原酸為杜仲葉中重要活性成分,在杜仲葉茯磚茶加工前期S0~S3階段含量變化不大,而S3~S8階段,綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)大幅下降,除S6和S7兩個(gè)階段質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異未達(dá)到極顯著水平外(P>0.01),其余各階段相互之間綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。京尼平苷和桃葉珊瑚苷在杜仲葉茯磚茶中質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較低,其中,京尼平苷在加工過程中變化較桃葉珊瑚苷明顯,且京尼平苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降主要集中于S3~S6階段。京尼平苷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降主要為S1~S2階段,S2較S1階段質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降5.88%,占整個(gè)加工過程中下降總量的53.85%,這可能由于京尼平苷酸熱穩(wěn)定性不高,因而在氣蒸時(shí)使其部分降解造成質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降較快。

    2.2 杜仲葉茯磚茶加工過程中微生物群落結(jié)構(gòu)

    2.2.1 不同加工階段真菌群落結(jié)構(gòu)

    由圖1A可知,S0~S8階段樣品的真菌群落基于門分類水平注釋到明確分類地位的有3 個(gè)門,其他相對豐度較低的合并為一類(其他)。子囊菌門(Ascomycota)在所有樣品中均為優(yōu)勢菌,相對豐度介于67.52%~100%。從各樣品來看,S0階段樣品中子囊菌門的相對豐度為91.63%,其次是相對豐度為8.07%的擔(dān)子菌門(Basidiomycota)以及少數(shù)未知分類地位的unclassified_k_Fungi及其他的真菌。而經(jīng)過渥堆處理,子囊菌門的相對豐度下降至67.52%,至S2階段,其相對豐度逐漸上升,特別是從S4階段起,子囊菌門在各樣品中的相對豐度均在99.99%以上,占絕對優(yōu)勢。

    圖1 基于門(A)和屬(B)水平不同加工階段杜仲葉茯磚茶真菌群落結(jié)構(gòu)Fig. 1 Fungal community structure of samples collected from the manufacturing process of Fuzhuan tea from Eucommia ulmoides leaves at phylum (A) and genus (B) levels

    由圖1B可知,S0~S8階段樣品的真菌群落在屬分類水平上注釋到明確分類地位的有23 個(gè)屬,其他相對豐度較低的合并為一類(其他)。其中相對豐度較高的有曲霉屬(Aspergillus)、毛孢子菌屬(Trichosporon)、Cutaneotrichosporon、Apiotrichum、德巴利酵母屬(Debaryomyces)、節(jié)擔(dān)菌屬(Wallemia)、枝孢屬(Cladosporium)、念珠菌屬(Candida)、青霉屬(Penicillium)和Cyberlindnera等,曲霉屬在所有樣品中的相對豐度均較高,在各不同加工階段相對豐度介于56.34%~100%,為杜仲葉茯磚茶中的優(yōu)勢菌群。通過對不同加工階段分析可以發(fā)現(xiàn),S0~S2階段,曲霉屬相對豐度逐步下降,Cutaneotrichosporon相對豐度逐步上升,毛孢子菌屬相對豐度呈先上升后下降趨勢,微生物多樣性發(fā)生了較明顯的變化。隨著發(fā)花的進(jìn)行,至S3階段,曲霉屬相對豐度大幅上升,達(dá)到了95.58%,而在S4~S8階段,其相對豐度均在99.99%以上,為杜仲葉茯磚茶中的絕對優(yōu)勢菌群。

    2.2.2 不同加工階段細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

    由圖2A可知,在門分類水平上,不同加工階段杜仲葉茯磚茶樣品的細(xì)菌群落共注釋到7 個(gè)明確分類地位的門,分別為放線菌門(Actinobacteriota)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、Bacteroidota、Acidobacteriota和綠彎菌門(Chloroflexi)。不同加工階段樣品在門水平上微生物的組成有較大差異,在S0~S2階段,藍(lán)細(xì)菌門為優(yōu)勢菌,其相對豐度介于73.73%~93.19%,其次為變形菌門,相對豐度為3.97%~20.16%。而在發(fā)花初期的S3、S4階段,變形菌門為優(yōu)勢菌,相對豐度分別為60.68%和66.53%,其次為藍(lán)細(xì)菌門、厚壁菌門和放線菌門。在發(fā)花中后期及陳化階段,即S5~S8階段,各樣品在門水平上的菌群結(jié)構(gòu)較相似,放線菌門在各樣品中均為優(yōu)勢菌,相對豐度均在83.35%以上,其次為變形菌門,在各樣品中相對豐度介于10.92%~13.31%,說明門水平上細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。

    圖2 基于門(A)和屬(B)水平不同加工階段杜仲葉茯磚茶細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig. 2 Bacterial community structure of samples collected from the manufacturing process of Fuzhuan tea from Eucommia ulmoides leaves at phylum (A) and genus (B) levels

    由圖2B可知,基于屬水平的S0~S8階段樣品的細(xì)菌群落共注釋到明確分類地位的屬有47 個(gè),其余相對豐度較低的合并為一類(其他),其中相對豐度較高的為紅球菌屬(Rhodococcus)、雷爾氏菌屬(Ralstonia)、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、norank_f_Mitochondria、泛菌屬(Pantoea)、屬級(jí)分類地位未知的黃色桿菌屬(unclassified_f_Xanthobacteraceae)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、Terrisporobacter、魏斯氏菌屬(Weissella)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)和叢毛單胞菌屬(Comamonas)等。在S0~S4階段,雷爾氏菌屬為各樣品中的優(yōu)勢菌,其相對豐度介于29.45%~55.74%,其次為紅球菌屬(4.31%~6.83%)和Burkholderia-Caballeronia Paraburkholderia(4.01%~7.79%)。從S5階段起,雷爾氏菌屬在此后各樣品中的相對豐度大幅下降,S5~S8階段,雷爾氏菌屬在各樣品中的相對豐度為8.43%~9.90%,紅球菌屬從S5階段起,在各樣品中的相對豐度則大幅上升,在S5~S8階段,其相對豐度84.70%~88.02%,為優(yōu)勢菌群。整體來看,杜仲葉茯磚茶加工過程中,S0~S4階段各樣品細(xì)菌群落多樣性明顯高于S5~S8階段,而S4~S5階段為杜仲葉茯磚茶中細(xì)菌群落多樣性發(fā)生變化的關(guān)鍵階段。

    2.2.3 主成分分析和OTU聚類分析結(jié)果

    2.2.3.1 真菌主成分分析和維恩圖分析結(jié)果

    通過主成分分析(principal component analysis,PCA)杜仲葉茯磚茶不同加工階段茶樣的OTU組成來反映樣品間的差異和距離,樣品組成越相似,則反映在PCA圖中的距離越近。由圖3A可以看出,PC1和PC2的主要貢獻(xiàn)之和為99.46%,說明該P(yáng)CA結(jié)果可以較好地反映不同茶樣間真菌群落結(jié)構(gòu)差異的影響因素。S0、S1、S2階段各樣品相互之間距離均較遠(yuǎn),說明真菌群落結(jié)構(gòu)差異較大,S3~S8階段的各樣品在PCA圖上聚集在一起,說明S3~S8階段各樣品真菌群落結(jié)構(gòu)相似,而與S0、S1、S2階段各樣品間距離較遠(yuǎn),表明S0、S1、S2階段和S3~S8階段樣品相互間真菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。

    將S0、S1、S2階段樣品分別記為Group1、Group2和Group3,而S3~S8階段的各樣品因群落結(jié)構(gòu)相似而歸為一組,記為Group4,進(jìn)一步對97%相似水平下的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析并繪制維恩圖。從圖3B可以看出,所有4 組樣品可以劃分為156 個(gè)OTU,S0、S1、S2和S3~S8組樣品OTU分別為69、77、61 個(gè)和63 個(gè)。其中,S0~S1、S2、S3~S8組中OTU分別為28、25 個(gè)和18個(gè),S1與S2、S3~S8組共有OTU分別為44 個(gè)和31 個(gè),而S2與S3~S8組共有OTU為32 個(gè)。S0、S1、S2和S3~S8組各自獨(dú)有的OTU分別為37、25、10 個(gè)和22 個(gè),分別占各自O(shè)TU總數(shù)的53.62%、32.47%、16.39%和34.92%,而S0、S1、S2和S3~S8組4 組樣品共有的OTU為12 個(gè),占所有4組樣品OTU總數(shù)的7.69%,說明4 組樣品真菌群落組成有明顯的不同。

    圖3 杜仲葉茯磚茶不同加工階段真菌群落PCA(A)和OTU的維恩圖分析(B)Fig. 3 Principal component analysis (A) and Venn diagram analysis of OTU distribution (B) of fungal communities in samples collected from the manufacturing process of Fuzhuan tea from Eucommia ulmoides leaves

    2.2.3.2 細(xì)菌PCA和維恩圖分析結(jié)果

    由圖4A可知,不同加工階段細(xì)菌群落PCA圖中PC1為93.55%,PC2為6.33%,合計(jì)為99.88%,說明該P(yáng)CA結(jié)果可以較好地反映不同茶樣間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異的影響因素。S0、S1和S2階段樣品在PCA圖上距離較近,說明組成上較為相似,而S3和S4階段樣品距離較近,說明S3和S4階段樣品細(xì)菌群落組成相似,同時(shí)S3和S4與S0、S1、S2階段樣品呈明顯的分離狀態(tài),說明細(xì)菌群落組成與S0、S1、S2階段樣品有較明顯的差異。S5、S6、S7和S8階段樣品在PCA圖上聚集在一起,說明S5~S8階段各樣品細(xì)菌群落組成相似,同時(shí)與其他樣品距離較遠(yuǎn),說明與其他階段樣品細(xì)菌群落組成有明顯的差異。

    圖4 杜仲葉茯磚茶不同加工階段細(xì)菌群落PCA(A)和OTU的維恩圖分析(B)Fig. 4 Principal component analysis (A) and Venn diagram analysis of OTU distribution (B) of bacterial communities in samples collected from the manufacturing process of Fuzhuan tea from Eucommia ulmoides leaves

    為便于進(jìn)行OTU分析,將在PCA圖上距離較近的樣品分為一組,即S0、S1、S2階段樣品合并為Group1,S3和S4階段樣品合并為Group2,S5、S6、S7和S8階段樣品歸為Group3,進(jìn)一步對97%相似水平下的OTU進(jìn)行生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì)分析并繪制維恩圖。由圖4B可知,3 組樣品一共可以劃分為1 250 個(gè)OTU,Group1、Group2和Group3各組樣品OTU分別為555、885 個(gè)和542 個(gè)。其中,Group1和Group2共有的OTU為359 個(gè),和Group3共有的OTU為253 個(gè),Group2和Group3共有的OTU為341 個(gè)。Group1、Group2和Group3各組獨(dú)有的OTU為164、406 個(gè)和169 個(gè),分別占各自O(shè)TU總數(shù)的29.55%、45.88%和31.18%,而3 組共有的OTU為221 個(gè),占所有組OTU總數(shù)的17.68%,說明杜仲葉茯磚茶加工過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化。

    2.3 屬水平主要菌群與活性成分相關(guān)性分析結(jié)果

    表2為S0~S8階段杜仲葉茯磚茶活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)與屬水平上相對豐度較高菌群之間相關(guān)性分析,由表2可知,曲霉屬相對豐度與多糖、總黃酮、游離氨基酸、多酚、綠原酸、京尼平苷和桃葉珊瑚苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),Apiotrichum相對豐度與多糖、游離氨基酸、多酚、綠原酸、京尼平苷和桃葉珊瑚苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著正相關(guān)(P<0.05),與總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),節(jié)擔(dān)菌屬相對豐度與多糖、總黃酮、游離氨基酸、多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著正相關(guān)(P<0.05),紅球菌屬相對豐度與水浸出物、多糖、總黃酮、游離氨基酸、多酚、綠原酸、京尼平苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),與京尼平苷酸、桃葉珊瑚苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),雷爾氏菌屬和Burkholderia-Caballeronia Paraburkholderia相對豐度均與水浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),二者相對豐度與綠原酸和京尼平苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著正相關(guān)(P<0.05),芽孢桿菌屬相對豐度與多糖、游離氨基酸、京尼平苷酸和桃葉珊瑚苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著正相關(guān)(P<0.05)。此外,毛孢子菌屬、Cutaneotrichosporon、德巴利酵母屬、不動(dòng)桿菌屬和乳桿菌屬相對豐度與主要活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)相關(guān)性均不顯著(P>0.05),咖啡堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)與屬水平上主要菌群相對豐度相關(guān)性均不顯著(P>0.05)。

    表2 不同加工階段杜仲葉茯磚茶活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)與屬水平主要菌群相對豐度Pearson相關(guān)性分析Table 2 Pearson’s correlation between the relative abundance of important genera and bioactive components of samples collected from the manufacturing process of Fuzhuan tea from Eucommia ulmoides leaves

    3 討 論

    杜仲葉茯磚茶加工過程中活性成分分析結(jié)果表明,主要活性成分在加工過程中均呈下降趨勢,比較S8和S0兩個(gè)階段活性成分含量可以發(fā)現(xiàn),除水浸出物和咖啡堿差異未達(dá)到極顯著外,其余活性成分含量下降差異均達(dá)到極顯著水平(P<0.01),這與以黑毛茶為原料加工的傳統(tǒng)茯磚茶類似。然而,Li Qin等[29]認(rèn)為,盡管茯磚茶加工和儲(chǔ)藏過程中主要功能成分含量呈下降趨勢,但茯磚茶仍具有較好的保健作用,這是由于茯磚茶生產(chǎn)過程中產(chǎn)生了其他新的成分或茯磚茶中原有的一些成分含量增加的緣故,由于本研究過程中所檢測的活性成分種類有限;因此,杜仲葉茯磚茶是否也存在類似的情況還有待于通過后續(xù)深入研究來證實(shí)。冠突散囊菌是茯磚茶中的優(yōu)勢金花菌,屬于曲霉屬真菌[30],通過對杜仲葉茯磚茶加工過程中屬水平上真菌群落結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),曲霉屬在S0階段即開始大量存在,渥堆和氣蒸降低了曲霉屬在樣品中相對豐度,而杜仲葉茯磚茶進(jìn)入發(fā)花階段后,由于環(huán)境溫度和濕度適中,金花菌大量生長繁殖,因此在S2~S3階段曲霉屬豐度大幅上升,從S4階段起,曲霉屬在樣品中的相對豐度已達(dá)到了99.99%以上。由于冠突散囊菌是衡量茯磚茶品質(zhì)的重要指標(biāo),因此,曲霉屬在杜仲葉茯磚茶中的豐度高,間接說明工藝控制良好,產(chǎn)品質(zhì)量較高。Li Qin等[29]對以黑毛茶為原料加工茯磚茶過程中真菌群落變化進(jìn)行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在以黑毛茶為原料加工茯磚茶過程中曲霉屬相對豐度在渥堆和氣蒸階段呈上升趨勢,而在進(jìn)入發(fā)花室后的0~3 d,曲霉屬相對豐度呈下降趨勢,這與杜仲葉茯磚茶有明顯不同,說明原料不同對茯磚茶加工前期樣品中的真菌群落結(jié)構(gòu)有一定影響,但進(jìn)入發(fā)花中期后,曲霉屬在兩種茯磚茶中均為絕對優(yōu)勢菌群,在中后期及最終產(chǎn)品中各不同原料茯磚茶真菌群落結(jié)構(gòu)差異不大[31]。相關(guān)性分析結(jié)果表明,曲霉屬相對豐度與杜仲葉茯磚茶加工過程中多數(shù)活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),節(jié)擔(dān)菌屬相對豐度與多糖、總黃酮、游離氨基酸和多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著正相關(guān)(P<0.05),這與以黑毛茶為原料加工的傳統(tǒng)茯磚茶類似,而在杜仲葉茯磚茶加工過程中豐度較高的Apiotrichum在傳統(tǒng)茯磚茶中未發(fā)現(xiàn)[29]。細(xì)菌是茯磚茶加工過程中非常重要的菌群,但由于發(fā)酵過程中細(xì)菌數(shù)量相對于真菌處于劣勢地位,因而沒有受到研究者重視[32]。紅球菌屬、雷爾氏菌屬、Burkholderia-Caballeronia Paraburkholderia、不動(dòng)桿菌屬、芽孢桿菌屬和乳桿菌屬是杜仲葉茯磚茶加工過程中主要的細(xì)菌屬,其中,紅球菌屬相對豐度僅與所檢測活性成分中的咖啡堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)相關(guān)性不顯著(P>0.05),而與其余9 種活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)負(fù)相關(guān),雷爾氏菌屬、Burkholderia-Caballeronia Paraburkholderia相對豐度與水浸出物、綠原酸和京尼平苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)正相關(guān),而芽孢桿菌屬相對豐度與多糖、游離氨基酸、京尼平苷酸和桃葉珊瑚苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著正相關(guān)(P<0.05),這說明細(xì)菌在杜仲葉茯磚茶加工過程中可能發(fā)揮了重要的作用,在后續(xù)研究中應(yīng)予以重視。

    綜上,杜仲葉茯磚茶中水浸出物、多糖、總黃酮、咖啡堿、游離氨基酸、多酚、綠原酸、京尼平苷、京尼平苷酸以及桃葉珊瑚苷10 種活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)在加工過程中呈逐步下降趨勢。杜仲葉茯磚茶在加工前期(S0~S4階段)真菌和細(xì)菌屬菌群均較加工后期(S5~S8階段)豐富,發(fā)花后期以及陳化階段,杜仲葉茯磚茶中微生物菌群逐漸趨于穩(wěn)定。屬水平上主要菌群相對豐度與活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相關(guān)性分析結(jié)果表明,杜仲葉茯磚茶加工過程中細(xì)菌和真菌豐度與多樣性均可能對活性成分的變化產(chǎn)生影響。研究結(jié)果可為進(jìn)一步通過定向調(diào)控菌群結(jié)構(gòu)提高杜仲葉茯磚茶發(fā)花質(zhì)量和產(chǎn)品品質(zhì)提供理論依據(jù)。

    猜你喜歡
    磚茶杜仲群落
    大學(xué)生牙齦炎齦上菌斑的微生物群落
    合成微生物群落在發(fā)酵食品中的應(yīng)用研究
    HPLC法同時(shí)測定杜仲-當(dāng)歸藥對中5種成分
    中成藥(2018年8期)2018-08-29 01:28:14
    略陽杜仲
    涇陽茯磚茶
    殃及池魚
    周末
    磚茶型氟鋁聯(lián)合應(yīng)用對大鼠牙齒和骨代謝生化指標(biāo)的影響
    春季和夏季巢湖浮游生物群落組成及其動(dòng)態(tài)分析
    茯磚茶中優(yōu)勢微生物在不同培養(yǎng)基的差異性比較
    中國釀造(2014年9期)2014-03-11 20:21:07
    久久99热6这里只有精品| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 99热精品在线国产| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 中文资源天堂在线| 久久鲁丝午夜福利片| 99久久九九国产精品国产免费| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 一本久久精品| 国产黄色视频一区二区在线观看 | av免费观看日本| 亚洲伊人久久精品综合 | 亚洲人成网站高清观看| 在线播放国产精品三级| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 成人欧美大片| 天天一区二区日本电影三级| 最近中文字幕2019免费版| 国产爱豆传媒在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 高清日韩中文字幕在线| 成人特级av手机在线观看| av在线播放精品| 国产精品熟女久久久久浪| 精品一区二区三区视频在线| 99热6这里只有精品| 欧美丝袜亚洲另类| 高清毛片免费看| 免费观看精品视频网站| 高清视频免费观看一区二区 | 午夜日本视频在线| 看非洲黑人一级黄片| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 听说在线观看完整版免费高清| 91精品伊人久久大香线蕉| 99在线视频只有这里精品首页| 日本黄色片子视频| 高清在线视频一区二区三区 | 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲av.av天堂| 听说在线观看完整版免费高清| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 免费av毛片视频| 丰满乱子伦码专区| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产亚洲精品久久久com| 久久99热6这里只有精品| 老女人水多毛片| 尾随美女入室| 高清午夜精品一区二区三区| 国产三级在线视频| av免费在线看不卡| 亚洲av一区综合| 在现免费观看毛片| 国产精品久久久久久久久免| 中文字幕免费在线视频6| 啦啦啦啦在线视频资源| 啦啦啦啦在线视频资源| 成年免费大片在线观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 国产免费又黄又爽又色| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲欧美精品专区久久| 国产男人的电影天堂91| 国产高清有码在线观看视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 老司机福利观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 久久亚洲国产成人精品v| 成人亚洲欧美一区二区av| 2022亚洲国产成人精品| 高清日韩中文字幕在线| 视频中文字幕在线观看| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产单亲对白刺激| 精品久久久噜噜| 亚洲国产精品合色在线| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲伊人久久精品综合 | 亚洲美女搞黄在线观看| 午夜视频国产福利| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产亚洲91精品色在线| 亚洲国产精品成人综合色| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲国产精品国产精品| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 黄片wwwwww| 国产一区二区亚洲精品在线观看| av卡一久久| 日韩一区二区三区影片| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 一级二级三级毛片免费看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 晚上一个人看的免费电影| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 高清毛片免费看| 麻豆成人av视频| 国产高潮美女av| 日韩制服骚丝袜av| 一个人免费在线观看电影| 日本一二三区视频观看| 中文字幕制服av| 亚洲成av人片在线播放无| 免费观看在线日韩| 在线观看一区二区三区| 舔av片在线| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 亚洲最大成人av| 一本久久精品| 高清毛片免费看| 伊人久久精品亚洲午夜| 日韩精品青青久久久久久| 国产成人免费观看mmmm| 久久精品久久精品一区二区三区| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲人成网站高清观看| 黄色日韩在线| 日韩欧美精品v在线| 丰满乱子伦码专区| 好男人在线观看高清免费视频| 久久久久久久久久久丰满| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 97超视频在线观看视频| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲av福利一区| 午夜老司机福利剧场| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲,欧美,日韩| 国产三级中文精品| 国产成人精品婷婷| 性色avwww在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 麻豆成人av视频| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲内射少妇av| 国产亚洲精品久久久com| 99久久成人亚洲精品观看| 看免费成人av毛片| 欧美日韩在线观看h| 综合色av麻豆| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 老女人水多毛片| 在线观看66精品国产| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 天天一区二区日本电影三级| 久久99蜜桃精品久久| 91久久精品国产一区二区三区| 国产真实乱freesex| 久久久久久久亚洲中文字幕| 色网站视频免费| 婷婷六月久久综合丁香| 狠狠狠狠99中文字幕| 日本黄色片子视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 精品人妻偷拍中文字幕| 变态另类丝袜制服| 2021少妇久久久久久久久久久| 午夜久久久久精精品| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 亚洲精品,欧美精品| 男女国产视频网站| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产精品久久久久久久久免| 国产高清三级在线| 美女脱内裤让男人舔精品视频| www.色视频.com| 免费搜索国产男女视频| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产乱人视频| 成年女人永久免费观看视频| 麻豆成人午夜福利视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲自偷自拍三级| 午夜精品在线福利| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产极品精品免费视频能看的| 免费播放大片免费观看视频在线观看 | 国产精品久久久久久av不卡| 午夜福利成人在线免费观看| 九草在线视频观看| 少妇丰满av| 日日摸夜夜添夜夜爱| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲国产精品合色在线| 最新中文字幕久久久久| 日日摸夜夜添夜夜爱| 免费黄网站久久成人精品| 看免费成人av毛片| 最新中文字幕久久久久| 天天躁日日操中文字幕| 久久久久久久久久久丰满| 日本熟妇午夜| av国产免费在线观看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 18禁动态无遮挡网站| 少妇熟女aⅴ在线视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 岛国在线免费视频观看| 91精品国产九色| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 日本午夜av视频| 国产免费视频播放在线视频 | 国产日韩欧美在线精品| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲自偷自拍三级| 国产真实乱freesex| 国产在线男女| 亚洲精品,欧美精品| 日本爱情动作片www.在线观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产成人一区二区在线| 亚洲真实伦在线观看| 有码 亚洲区| 最近的中文字幕免费完整| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 免费观看在线日韩| 国产成人福利小说| 免费在线观看成人毛片| 欧美日韩国产亚洲二区| 日本色播在线视频| 丝袜美腿在线中文| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲电影在线观看av| 国产成人福利小说| 99热这里只有是精品在线观看| 国产免费男女视频| 免费播放大片免费观看视频在线观看 | 久久久国产成人免费| 少妇的逼水好多| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 天美传媒精品一区二区| 老司机福利观看| 一级黄色大片毛片| 亚洲精品色激情综合| 国产真实乱freesex| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产黄色小视频在线观看| 中文字幕亚洲精品专区| 最近中文字幕2019免费版| 欧美精品国产亚洲| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 欧美日韩国产亚洲二区| 色噜噜av男人的天堂激情| 久久午夜福利片| 亚洲人成网站高清观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 青春草亚洲视频在线观看| 日本午夜av视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 三级国产精品欧美在线观看| 国国产精品蜜臀av免费| 青春草国产在线视频| 天天一区二区日本电影三级| 日韩制服骚丝袜av| 99在线视频只有这里精品首页| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 91在线精品国自产拍蜜月| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产极品精品免费视频能看的| a级毛片免费高清观看在线播放| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲最大成人中文| 我的女老师完整版在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 国产午夜精品论理片| 男女下面进入的视频免费午夜| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲三级黄色毛片| 日韩av不卡免费在线播放| 一夜夜www| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 久久久亚洲精品成人影院| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产大屁股一区二区在线视频| 在线观看av片永久免费下载| 我要搜黄色片| 直男gayav资源| 国产爱豆传媒在线观看| 久久99热这里只频精品6学生 | 国产免费一级a男人的天堂| 嫩草影院精品99| 内地一区二区视频在线| 亚洲欧美精品自产自拍| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 成年av动漫网址| 国产免费一级a男人的天堂| 一级毛片久久久久久久久女| 国产在线一区二区三区精 | 听说在线观看完整版免费高清| 成年av动漫网址| av在线蜜桃| 国产黄色小视频在线观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 又粗又爽又猛毛片免费看| 69av精品久久久久久| 国产成人a区在线观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 97热精品久久久久久| av专区在线播放| 日本午夜av视频| 99久国产av精品国产电影| 色5月婷婷丁香| 亚洲伊人久久精品综合 | 国产成人freesex在线| 国产精品,欧美在线| 少妇人妻精品综合一区二区| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲18禁久久av| 麻豆av噜噜一区二区三区| 插逼视频在线观看| 亚洲最大成人av| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 久久久亚洲精品成人影院| 99久久无色码亚洲精品果冻| 久久这里有精品视频免费| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 日韩精品青青久久久久久| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产激情偷乱视频一区二区| eeuss影院久久| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 国产一区有黄有色的免费视频 | 大话2 男鬼变身卡| 日本爱情动作片www.在线观看| 天堂网av新在线| 少妇人妻一区二区三区视频| 午夜福利视频1000在线观看| 色5月婷婷丁香| 亚洲av免费在线观看| 韩国高清视频一区二区三区| 白带黄色成豆腐渣| 精品久久久久久久久av| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲精品aⅴ在线观看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 免费人成在线观看视频色| 午夜a级毛片| 1024手机看黄色片| 少妇高潮的动态图| 精品久久久久久久久av| 日本三级黄在线观看| 婷婷色麻豆天堂久久 | 国产精品久久久久久久电影| 免费看美女性在线毛片视频| 天堂网av新在线| 在线观看一区二区三区| 热99re8久久精品国产| 九九在线视频观看精品| 一级毛片久久久久久久久女| 精品久久久噜噜| 欧美bdsm另类| 国产精品一区www在线观看| 国产精品.久久久| 国产精品日韩av在线免费观看| 久久精品国产亚洲av天美| 日本五十路高清| 男插女下体视频免费在线播放| 国产精品99久久久久久久久| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产91av在线免费观看| 久久久午夜欧美精品| 亚洲va在线va天堂va国产| 日韩国内少妇激情av| 成年女人永久免费观看视频| 级片在线观看| 久久国产乱子免费精品| 精品人妻熟女av久视频| 99视频精品全部免费 在线| 欧美一区二区亚洲| 黄色欧美视频在线观看| 久久亚洲精品不卡| 日本黄色片子视频| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产成人a∨麻豆精品| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产成人精品婷婷| 国产在线一区二区三区精 | 精品久久久久久久末码| 国产亚洲精品av在线| 天堂√8在线中文| av线在线观看网站| 久久99蜜桃精品久久| 成人性生交大片免费视频hd| 久久久久国产网址| 中国国产av一级| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲综合色惰| 特大巨黑吊av在线直播| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 丰满少妇做爰视频| 搞女人的毛片| 成人特级av手机在线观看| 99热这里只有是精品50| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 欧美精品国产亚洲| 三级国产精品片| 99久久九九国产精品国产免费| 99在线人妻在线中文字幕| 麻豆乱淫一区二区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 成年免费大片在线观看| 久久久久久九九精品二区国产| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 天天一区二区日本电影三级| 国产亚洲最大av| 亚洲三级黄色毛片| 免费电影在线观看免费观看| 中文字幕亚洲精品专区| av播播在线观看一区| 国产真实乱freesex| 欧美三级亚洲精品| 一区二区三区免费毛片| 免费看光身美女| 国产精品精品国产色婷婷| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | av免费观看日本| 国产视频内射| 精品人妻偷拍中文字幕| 日本欧美国产在线视频| 夫妻性生交免费视频一级片| 欧美激情在线99| 内射极品少妇av片p| 久久久精品欧美日韩精品| 久久这里有精品视频免费| 国产成年人精品一区二区| 国产精品永久免费网站| 少妇被粗大猛烈的视频| 又爽又黄无遮挡网站| 午夜日本视频在线| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产成人精品久久久久久| 免费观看性生交大片5| 亚洲精品一区蜜桃| 久久久亚洲精品成人影院| 能在线免费看毛片的网站| 国产在线男女| 午夜a级毛片| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲国产精品sss在线观看| 99热6这里只有精品| 久久热精品热| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产成人精品久久久久久| 日本一二三区视频观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 久久精品影院6| 成人美女网站在线观看视频| 美女黄网站色视频| 99久久人妻综合| 久久精品国产自在天天线| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲自拍偷在线| 久久精品夜色国产| 国产乱人视频| 最近2019中文字幕mv第一页| 欧美精品一区二区大全| 男人和女人高潮做爰伦理| 永久网站在线| 亚洲综合精品二区| 熟女电影av网| 丰满少妇做爰视频| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产精品.久久久| 免费搜索国产男女视频| 成年版毛片免费区| 久久韩国三级中文字幕| 成年版毛片免费区| 国产成人a∨麻豆精品| 久久久久久久久久久免费av| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲成色77777| videossex国产| 99视频精品全部免费 在线| 插阴视频在线观看视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 在线观看66精品国产| 一区二区三区免费毛片| 夫妻性生交免费视频一级片| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 久久精品久久精品一区二区三区| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲国产欧美人成| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 有码 亚洲区| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 日韩强制内射视频| 看片在线看免费视频| 国产精品三级大全| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 床上黄色一级片| 黄色欧美视频在线观看| 国产av不卡久久| 中文字幕久久专区| 亚洲国产欧美在线一区| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 午夜久久久久精精品| av免费在线看不卡| 日本一本二区三区精品| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 精品国内亚洲2022精品成人| 有码 亚洲区| 日韩欧美在线乱码| 乱人视频在线观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| av在线天堂中文字幕| 欧美激情国产日韩精品一区| 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲色图av天堂| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产黄片美女视频| 日韩欧美精品免费久久| 日本免费在线观看一区| 最近手机中文字幕大全| 永久网站在线| 亚洲欧美一区二区三区国产| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 成人二区视频| 日韩精品有码人妻一区| 精品人妻一区二区三区麻豆| 黑人高潮一二区| 国产探花在线观看一区二区| 天堂√8在线中文| 久久久欧美国产精品| 日本av手机在线免费观看| 亚洲最大成人中文| 嫩草影院入口| 国内精品一区二区在线观看| 国产精品久久视频播放| 国产免费福利视频在线观看| 欧美色视频一区免费| 久久精品人妻少妇| 久久人人爽人人片av| 国产一区二区三区av在线| 中文字幕制服av| 七月丁香在线播放| 久久久久久久亚洲中文字幕| 精品久久国产蜜桃| 国产乱人偷精品视频| 亚洲精品色激情综合| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 亚洲欧美清纯卡通| 三级国产精品欧美在线观看| 免费黄色在线免费观看| 村上凉子中文字幕在线| 欧美极品一区二区三区四区| 丰满人妻一区二区三区视频av| 可以在线观看毛片的网站| 听说在线观看完整版免费高清| 大香蕉久久网| 久久久久九九精品影院| 边亲边吃奶的免费视频| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产精品av视频在线免费观看| 久久久a久久爽久久v久久| 一级毛片电影观看 | 亚洲av.av天堂| av专区在线播放| 一个人免费在线观看电影| 激情 狠狠 欧美| 国产毛片a区久久久久| 一区二区三区乱码不卡18| 身体一侧抽搐| 久久99热6这里只有精品| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产成人a区在线观看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 成人无遮挡网站| 中文天堂在线官网| 嘟嘟电影网在线观看| 色吧在线观看| 国产精品人妻久久久久久| 两个人视频免费观看高清| 精品国产露脸久久av麻豆 | 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 午夜福利网站1000一区二区三区| 青春草国产在线视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 啦啦啦韩国在线观看视频| 天美传媒精品一区二区| 国产av码专区亚洲av| 秋霞在线观看毛片| 草草在线视频免费看| 国产色婷婷99| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 黄片wwwwww| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 插逼视频在线观看| 人妻系列 视频|