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    山藥-蛹蟲草雙向發(fā)酵的抗氧化活性增效性

    2021-07-29 03:26:48李慧星周永康方佩琦鄭立霖哈海洋
    食品科學(xué) 2021年13期
    關(guān)鍵詞:蟲草山藥清除率

    李慧星,周永康,方佩琦,鄭立霖,哈海洋,許 彬,*

    (1.南陽理工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,河南 南陽 473004;2.河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點實驗室,河南 南陽 473004)

    山藥(Dioscorea oppositifoliaL.)是傳統(tǒng)的藥食同源食物,是《中華本草》收載的草藥[1],山藥提取物具有抗氧化活性,可用于清除自由基[2-5]。山藥中富含淀粉、纖維素等物質(zhì)[1],可以用作食藥用真菌發(fā)酵底物。楊海龍等[6]以山藥作為碳源通過液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)靈芝,當山藥用量為3%(質(zhì)量分數(shù))時,靈芝菌體生物量可達2.05 g/100 mL。于匯等[7]以山藥等中藥材和糧食原料進行搭配,經(jīng)猴頭菌發(fā)酵后制成飲料,產(chǎn)品的藥用作用明顯。張志才等[8]將蛹蟲草接種于山藥和其他糧食成分組成的基質(zhì)上進行固態(tài)發(fā)酵,生產(chǎn)功能性食品。

    蛹蟲草又名北冬蟲夏草,是一種常用的食藥用真菌,能代謝產(chǎn)生核苷類、多糖類、甾醇、氨基酸等生物活性物質(zhì)[9],且蟲草素含量和抗氧化活性高于冬蟲夏草[10-11]。

    本研究基于莊毅等[12]提出的“雙向發(fā)酵”概念,以山藥為基質(zhì),以蛹蟲草為發(fā)酵真菌進行固態(tài)發(fā)酵。山藥可以為蛹蟲草菌絲生長代謝提供營養(yǎng)物質(zhì),蛹蟲草的酶系能夠改變山藥成分組成和空間結(jié)構(gòu),最終使得發(fā)酵后的山藥可能在某一活性上獲得增效,即發(fā)酵具有“雙向性”,發(fā)酵所得的山藥-蛹蟲草-代謝產(chǎn)物混合物稱為菌質(zhì)。本實驗通過測定菌質(zhì)和山藥的超氧陰離子自由基(O2-?)清除率、2,2-二苯基-1-苦基肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除率和羥自由基(?OH)清除率來評價兩者的抗氧化活性差異,并通過抗氧化活性成分含量的測定、高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)指紋圖譜、掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy,SEM)和傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,F(xiàn)TIR)儀分析研究菌質(zhì)和山藥存在抗氧化活性差異的原因,為將山藥-蛹蟲草菌質(zhì)開發(fā)成相關(guān)抗氧化食品提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    山藥 南陽市萬德隆超市;蛹蟲草14013 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;葡萄糖、水楊酸、無水乙醇、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、連苯三酚、氯仿(均為分析純) 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;VB1北京酷來搏科技有限公司;瓊脂粉北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司;DPPH(分析純)、蟲草素標準品(色譜純)、薯蕷皂苷標準品(色譜純)合肥博美生物科技有限責任公司;乙腈、甲酸(色譜純) 上海麥克林生化科技有限公司;溴化鉀(光譜純) 天津中世沃克科技發(fā)展有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    PHS-3C精密酸度計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;LCD250N超聲波細胞破碎機上海冠森生物科技有限公司;FreeZone?TriadTM2.5L真空冷凍干燥機 美國LABCONCO有限公司;LRHS-300-II恒溫恒濕培養(yǎng)箱、HH.S11-4-S控溫水浴鍋上海躍進醫(yī)療器械有限公司;LDZX-30FB立式滅菌器上海申安醫(yī)療器械有限公司;LC1260 HPLC儀(配有二極管陣列檢測器) 美國安捷倫公司;180EII超聲波清洗器 寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司;RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;Spectrum TWO FTIR儀美國Perkin-Elmer公司;SU8000 SEM 日本日立公司。

    1.3 方法

    1.3.1 山藥-蛹蟲草菌質(zhì)的發(fā)酵

    山藥-蛹蟲草菌質(zhì)的發(fā)酵方法參考文獻[13]。山藥洗凈、切碎,得到邊長2~3 mm左右的正方體顆粒、自然晾干至水分質(zhì)量分數(shù)10%左右。實驗分為接種組和空白對照組,每組3 個平行培養(yǎng)瓶,在每個培養(yǎng)瓶中分裝山藥33.7 g、蒸餾水37.2 mL,拌勻,浸潤2 h。將裝有山藥的培養(yǎng)瓶置于121 ℃下滅菌30 min。蛹蟲草菌種在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基固體平板上于溫度25 ℃、相對濕度75%條件下培養(yǎng)10 d后,從平板上刮取邊長0.8 cm的正方形蛹蟲草菌苔接種于裝有山藥的培養(yǎng)瓶中,每個培養(yǎng)瓶接種13 個邊長0.8 cm的正方形蛹蟲草菌苔。接種后在溫度25 ℃、相對濕度75%的條件下發(fā)酵生產(chǎn)山藥-蛹蟲草菌質(zhì)。實驗以不接種蛹蟲草菌種的山藥作為空白對照。

    1.3.2 提取物的制備

    提取物的制備參考文獻[14]。1)蛹蟲草菌絲提取物的制備:蛹蟲草菌種在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基固體平板培養(yǎng)10 d后,刮取邊長約0.8 cm的正方形菌苔10 塊,用研缽將菌苔研碎,用50 mL乙醇將研碎菌苔洗至圓底燒瓶中,在70 ℃水浴中回流提取1 h,濾去固體后將乙醇蒸干,再加入色譜級乙腈溶解,定容至5.0 mL。采用0.22 μm濾膜過濾溶液后備用。2)菌質(zhì)提取物的制備:山藥-蛹蟲草菌質(zhì)冷凍干燥后稱取1.0 g,加入50 mL乙醇超聲處理(250 W、25 min),然后在70 ℃水浴中回流提取1 h,濾去固體后將乙醇提取液濃縮干燥,加入色譜級乙腈溶解,定容至10 mL。采用0.22 μm濾膜過濾溶液后備用。

    1.3.3 自由基清除率的測定

    以自由基清除率表征菌質(zhì)的抗氧化活性,其中?OH清除率的測定參考文獻[15],DPPH自由基清除率的測定參考文獻[16],O2-?清除率的測定參考文獻[17]。

    1.3.4 抗氧化活性成分含量的測定

    總酚含量的測定參考文獻[18],總黃酮含量的測定參考文獻[19],總皂苷含量的測定參考文獻[20],總多糖含量的測定參考文獻[21]。

    1.3.5 HPLC指紋圖譜分析

    色譜條件:InfinityLab Poroahell C18色譜柱(4.6 mm×100 mm,4 μm);檢測波長260 nm;柱溫35 ℃;進樣量10 μL;流動相A為體積分數(shù)0.1%甲酸-水溶液,流動相B為乙腈;流速0.8 mL/min。梯度洗脫程序見表1。

    表1 HPLC梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of HPLC

    1.3.6 SEM觀察

    樣品在60 ℃下干燥至恒質(zhì)量,粉碎過100 目篩后以SEM觀察分析菌質(zhì)的表面形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

    1.3.7 FTIR分析

    樣品在60 ℃下干燥至恒質(zhì)量,粉碎過100 目篩后采用溴化鉀壓片法制備試樣。FTIR在波數(shù)4 000~450 cm-1范圍內(nèi)分析,掃描16 次,分辨率4 cm-1。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    采用Excel 2016和SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行處理、繪圖和差異顯著性分析,采用最小顯著極差法(least significant ranges,LSR)進行多重比較,P<0.05說明差異顯著。實驗結(jié)果除有特殊說明外,均為3 次實驗平均值±標準偏差。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌質(zhì)的抗氧化活性

    由圖1可知,山藥-蛹蟲草雙向發(fā)酵過程中,菌質(zhì)對各種自由基的清除率隨發(fā)酵時間延長而提高,在發(fā)酵前2 d,菌質(zhì)自由基清除率變化不顯著(P>0.05),而在發(fā)酵2~8 d,菌質(zhì)自由基清除率有明顯提高,在發(fā)酵時間達到8 d以后,菌質(zhì)自由基清除率總體來說變化不顯著(P>0.05)。在發(fā)酵前2 d,菌絲剛萌發(fā),在基質(zhì)中局部分布(圖2A),因此菌質(zhì)整體的抗氧化活性未發(fā)生明顯改變。當發(fā)酵8 d后,菌絲已經(jīng)基本布滿基質(zhì)(圖2B),發(fā)酵接近終點時菌質(zhì)的抗氧化活性基本穩(wěn)定,相對于發(fā)酵初期有顯著提高(P<0.05),說明菌質(zhì)的抗氧化活性與菌絲的生長存在一定相關(guān)性。

    圖1 菌質(zhì)抗氧化活性隨培養(yǎng)時間的變化Fig. 1 Change in antioxidant activity of Chinese yam during fermentation

    圖2 山藥-蛹蟲草菌質(zhì)表觀情況Fig. 2 Apparent situation of Chinese yam fermented with Cordyceps militaris

    發(fā)酵結(jié)束后山藥和菌質(zhì)的抗氧化活性如表2所示。菌質(zhì)的各項自由基清除率均顯著高于山藥的自由基清除率(P<0.05),說明山藥經(jīng)蛹蟲草發(fā)酵后得到的菌質(zhì)其抗氧化活性明顯提高。因此,可以認為山藥-蛹蟲草雙向發(fā)酵在抗氧化活性方面具有增效性。

    表2 山藥和菌質(zhì)的自由基清除率Table 2 Free radical scavenging rates of Chinese yam and Chinese yam fermented with Cordyceps militaris

    2.2 山藥和菌質(zhì)的抗氧化活性成分含量分析結(jié)果

    除總多糖外,菌質(zhì)中各種抗氧化活性成分含量均顯著高于山藥(P<0.05)(表3),這與張志才等[8]的研究結(jié)果一致。山藥-蛹蟲草雙向發(fā)酵后菌質(zhì)總多糖含量降低,這是由于蛹蟲草在發(fā)酵過程中分解利用了山藥中總多糖。山藥-蛹蟲草雙向發(fā)酵后,菌質(zhì)中總酚、總黃酮和總皂苷含量顯著提高(P<0.05),因此菌質(zhì)的抗氧化活性高于山藥的抗氧化活性。

    表3 山藥和菌質(zhì)的抗氧化活性成分含量Table 3 Contents of antioxidants in Chinese yam and Chinese yam fermented with Cordyceps militaris

    2.3 HPLC指紋圖譜分析結(jié)果

    山藥-蛹蟲草菌質(zhì)、蛹蟲草菌絲提取物的HPLC指紋圖譜如圖3所示。蟲草素標準品和薯蕷皂苷標準品的HPLC圖如圖4、5所示。對圖3~5中的特征峰進行統(tǒng)一編號,并將編號標注于各圖中。

    圖3 菌質(zhì)、山藥和蛹蟲草菌絲提取物HPLC指紋圖譜Fig. 3 HPLC fingerprints of the extracts of Chinese yam fermented with Cordyceps militaris, Chinese yam and Cordyceps militaris mycelium

    圖4 蟲草素標準品的HPLC圖Fig. 4 HPLC chromatogram of cordycepin reference substance

    由圖3可知,17號峰在各種樣品的提取物中均存在,該峰分離度較好且穩(wěn)定,因此選擇該峰為參照峰。以其峰面積和保留時間為基準,分別計算各提取物中其他成分的峰面積和保留時間與17號峰面積和保留時間的比值,記為相對峰面積和相對保留時間[22-23],如表4所示。

    表4 HPLC指紋圖譜特征峰的相對保留時間和相對峰面積Table 4 Relative retention times and relative peak areas of characteristic peaks in HPLC fingerprints

    由圖3和表4可知,4、7、11、15號峰在山藥和蛹蟲草菌絲中均未出現(xiàn),參考潘揚等[24]對HPLC圖譜中新物質(zhì)的判定方法,可以認為這4 種物質(zhì)是山藥-蛹蟲草雙向發(fā)酵后生成的新物質(zhì)。3、12、23、24號峰在菌質(zhì)和蛹蟲草菌絲中出現(xiàn),而在山藥中未出現(xiàn),表明這4 種成分是蛹蟲草發(fā)酵后生成的物質(zhì),進一步與圖4對比分析,3號峰對應(yīng)的物質(zhì)為蟲草素。5、8、9、13、14、16號峰在菌質(zhì)、山藥中均有出現(xiàn),但菌質(zhì)中這6 種物質(zhì)的相對峰面積相明顯減小,9、13號峰相對峰面積減小尤為明顯,說明這幾種成分被蛹蟲草代謝分解或轉(zhuǎn)化為其他成分。圖3山藥中的1號峰和10號峰在菌質(zhì)中沒有檢測到,可能是由于蛹蟲草的代謝作用改變了這兩種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。17~22號峰(保留時間為74.3~87.5 min)在菌質(zhì)、山藥、蛹蟲草菌絲中均有出現(xiàn),與圖5對比可知,保留時間在該范圍內(nèi)的物質(zhì)應(yīng)為五環(huán)三萜類化合物。由于蛹蟲草菌絲是以馬鈴薯培養(yǎng)基培養(yǎng)的,而該培養(yǎng)基的主要成分為馬鈴薯提取液。馬鈴薯中含有三糖五環(huán)三萜類化合物,與薯蕷皂苷具有相同的骨架結(jié)構(gòu)[25-26],因此在HPLC指紋圖譜中與薯蕷皂苷的保留時間接近,且相對峰面積也接近。在從馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基斜面上分離蛹蟲草菌絲時有培養(yǎng)基殘留,因此圖3各物質(zhì)提取物中都出現(xiàn)了五環(huán)三萜類化合物的特征峰。由以上分析可知,菌質(zhì)和山藥的成分存在較大差異,菌質(zhì)因蛹蟲草的代謝作用產(chǎn)生了山藥中原本不存在的物質(zhì),并改變了山藥中原有成分的含量,這可能是菌質(zhì)抗氧化活性高于山藥的另一個原因。

    圖5 薯蕷皂苷標準品的HPLC圖Fig. 5 HPLC chromatogram of dioscin reference substance

    2.4 山藥和菌質(zhì)的SEM圖觀察結(jié)果

    由圖6A可知,山藥表面有褶皺,形態(tài)完整、連續(xù)。由圖6B可知,菌質(zhì)的形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,山藥基質(zhì)的表面附著有蛹蟲草菌絲體,表面褶皺減少、形態(tài)不再完整,有碎片分布。說明山藥的完整結(jié)構(gòu)因蛹蟲草菌絲的生長和分解作用而被破壞,活性物質(zhì)更加容易提取,這也是菌質(zhì)抗氧化活性提高的原因之一。

    圖6 山藥(A)和菌質(zhì)(B)的SEM圖Fig. 6 SEM images of Chinese yam (A) and Chinese yam fermented with Cordyceps militaris (B)

    2.5 山藥和菌質(zhì)的FTIR分析結(jié)果

    山藥和菌質(zhì)的FTIR結(jié)果如圖7所示。山藥和菌質(zhì)的FTIR圖在2 000~1 845 cm-1和710~576 cm-1范圍內(nèi)有差異。苯環(huán)上有取代基的物質(zhì)在2 000~1 660 cm-1內(nèi)存在低強度的特征吸收峰,環(huán)醚在該區(qū)域也存在低強度的多個吸收峰[27],結(jié)合多酚類化合物的分子結(jié)構(gòu)以及劉琪[28]關(guān)于橡子果仁多酚研究的紅外光譜圖,推斷圖7中2 000~1 845 cm-1區(qū)域內(nèi)的吸收峰是由多酚中的共軛雙鍵(C=C)和鄰取代芳烴(C-H)結(jié)構(gòu)的伸縮振動產(chǎn)生的。菌質(zhì)相比山藥在2 000~1 845 cm-1區(qū)域的吸收峰更明顯。結(jié)合總酚測定結(jié)果,推斷這種差異可能是由于蛹蟲草發(fā)酵山藥后產(chǎn)生了更多的多酚類物質(zhì)。1 650~500 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰屬于山藥的特征吸收峰[29-30],860~500 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰主要是由多糖、纖維素、皂苷中糖苷鍵振動產(chǎn)生的[30-32]。比較山藥和菌質(zhì)的FTIR圖發(fā)現(xiàn),710~576 cm-1范圍內(nèi)菌質(zhì)的吸收峰數(shù)量減少而吸收強度略有增加,這可能是由于山藥中的多糖、纖維素等作為碳源被菌絲所代謝,而一部分降解產(chǎn)物被菌絲用于合成了更多的皂苷。根據(jù)山藥和菌質(zhì)的FTIR圖變化可以推斷,蛹蟲草能夠分解山藥中的組分供自身生長,而產(chǎn)生的代謝物對菌質(zhì)的抗氧化活性具有貢獻作用,即山藥-蛹蟲草發(fā)酵體系具有雙向性,并對山藥抗氧化活性具有增效作用。

    圖7 山藥和菌質(zhì)的FTIR圖Fig. 7 FTIR spectra of Chinese yam and Chinese yam fermented with Cordyceps militaris

    3 結(jié) 論

    山藥經(jīng)蛹蟲草雙向發(fā)酵后,菌質(zhì)的各項自由基清除率明顯高于山藥,說明菌質(zhì)的抗氧化活性優(yōu)于山藥,山藥-蛹蟲草雙向發(fā)酵體系在抗氧化活性方面具有增效性。菌質(zhì)成分的種類和含量變化、菌質(zhì)結(jié)構(gòu)變化是產(chǎn)生抗氧化活性增效性的主要原因。由活性成分含量分析可知,山藥-蛹蟲草菌質(zhì)中總酚、總黃酮和總皂苷含量明顯高于山藥;由HPLC指紋圖譜分析結(jié)果可知,山藥-蛹蟲草菌質(zhì)提取物的HPLC指紋圖譜與山藥提取物圖譜有明顯不同,不僅產(chǎn)生了一些山藥中不存在的新成分,而且山藥中原有成分的含量也發(fā)生明顯變化。由SEM分析結(jié)果可知,蛹蟲草對山藥的空間結(jié)構(gòu)有分解破壞作用,利于蛹蟲草利用山藥基質(zhì)生成活性物質(zhì)。由FTIR分析結(jié)果可知,蛹蟲草代謝了山藥中的多糖、纖維素等碳源物質(zhì),生成了多酚類物質(zhì)等。結(jié)果表明菌質(zhì)成分的種類和含量變化、菌質(zhì)結(jié)構(gòu)變化是產(chǎn)生抗氧化活性增效性的主要原因。

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