中國被毛孢提取物及其主要活性成分的抗腫瘤活性*

劉少靜，秦 蓓**，余麗麗，姚 琳，康冬妮，何曉佳

(1.西安醫(yī)學院 藥學院，陜西 西安 710021；2.西安醫(yī)學院 藥物研究所，陜西 西安 710021)

惡性腫瘤近年來成為嚴重威脅人類健康的重要殺手之一，尋找有效的抗癌藥物成為世界醫(yī)學面臨的重大課題。目前使用的化療藥物多數(shù)存在副作用大、選擇性差、成本高等缺點，針對抗腫瘤藥物的研發(fā)，在提高藥效的同時，應提高選擇性、降低毒副作用[1-2]。目前從中藥中尋找安全、有效的抗腫瘤活性部位及有效單體化合物已成為開發(fā)抗癌新藥的途徑之一[3-5]。中國被毛孢(Hirsutellasinensis)是冬蟲夏草的無性型菌株，被公認為是冬蟲夏草唯一代表性真菌，具有免疫調(diào)節(jié)、降血脂、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤和降血糖等多種生物活性[6-9]。其化學成分與天然冬蟲夏草成分相似，包括腺苷、尿苷、蟲草素等，已有相關(guān)研究表明蟲草素、中國被毛孢菌絲體多糖等均具有抗腫瘤、增強免疫力的活性[10-14]，但未見相關(guān)中國被毛孢提取物及其主要活性成分的抗腫瘤活性進行對比研究的報道。作者采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測中國被毛孢提取物及其主要活性成分蟲草素對人乳腺癌細胞ZR-75-30的抑制率，同時針對樣品對細胞形態(tài)及凋亡情況的影響進行考察。初步對比其抗腫瘤活性，為中國被毛孢制劑及其單體化合物作為癌癥輔助治療手段提供科學依據(jù)與臨床指導。

1 實驗部分

1.1 原料、試劑與儀器

蟲草素標準品：HPLC>98%，上海源葉生物科技有限公司；中國被毛孢菌絲體：杭州眾芝康菇生物技術(shù)有限公司；人乳腺癌細胞ZR-75-30：中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

MTT：批號為M5655，碘化丙啶(PI)：生化試劑，美國Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)液：批號為AAK208935，胎牛血清：批號為NZE1145，美國Hyclone科技有限公司；胰蛋白酶溶液：批號為2016062902，w(胰蛋白酶)=0.25%，w[乙二胺四乙酸(EDTA)]=0.02%，吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；二甲基亞砜(DMSO)、無水乙醇等：均為分析純，市售。

倒置顯微鏡：Ti-u，日本Nikon公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱：MCO-15AC，日本Sanyo公司；自動全波長酶標儀：Multiskan go，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；冷凍干燥機：FD-1000，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：CCA-1111 CE，東京理化器械株式會社；循環(huán)水式真空泵：SHZ-D(Ⅲ)，鞏義市予華儀器有限責任公司；分析天平：ADVENTURER，奧豪斯儀器有限公司；超凈工作臺：SW-CJ-1F，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 樣品的制備

1.2.1 中國被毛孢提取物的制備

稱取中國被毛孢菌粉約20 g，加入φ(乙醇)=75%溶液，于60 ℃回流提取3次，1 h/次。合并3次提取液，減壓濃縮除去乙醇；加適量水于濃縮液中，進行分散后冷凍干燥，制得粉末狀提取物。

(1)提取物溶液的制備：精密稱取1.2.1方法提取物適量，加入DMSO超聲溶解，配置1.5 mg/mL儲備液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，4 ℃儲存?zhèn)溆?。采用RPMI-1640培養(yǎng)基[φ(胎牛血清)=10%]將提取物儲備液稀釋成質(zhì)量濃度為25、50、100、200、400、800 μg/mL溶液。

(2)蟲草素溶液的制備：精密稱取蟲草素適量，配置成1 mg/mL的儲備液，過0.22 μm微孔濾膜除菌，4 ℃儲存?zhèn)溆?。采用RPMI-1640培養(yǎng)液[φ(胎牛血清)=10%]將其稀釋成質(zhì)量濃度為25、50、100、200、400、800 μg/mL溶液。

1.3 細胞培養(yǎng)

將復蘇后的乳腺癌細胞ZR-75-30培養(yǎng)于培養(yǎng)基RPMI-1640[φ(胎牛血清)=10%]中，置于37 ℃，φ(CO2)=5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)生長情況換液或消化，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.4 MTT法檢測樣品對腫瘤細胞活力的影響

將處于對數(shù)生長期的乳腺癌ZR-75-30細胞消化、計數(shù)，接種到96孔板中。細胞貼壁后加入不同質(zhì)量濃度的樣品溶液(25、50、100、200、400、800 μg/mL)，

每組設(shè)4個復孔，作用24 h后終止培養(yǎng)；每孔加入ρ(MTT)=5 g/L溶液20 μL，37 ℃避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，保留結(jié)晶物(甲臜)，每孔加入150 μL DMSO，37 ℃振蕩15 min溶解甲臜，用酶標儀在490 nm處測定每孔的吸光度(OD)。以不加樣品溶液的細胞懸液作為對照組，根據(jù)公式(1)計算樣品對乳腺癌ZR-75-30細胞抑制率，并采用Origin2018軟件進行擬合計算樣品對乳腺癌ZR-75-30細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

(1)

1.5 倒置顯微鏡觀察ZR-75-30細胞的形態(tài)

為了直觀反映中國被毛孢提取物及蟲草素對乳腺癌ZR-75-30細胞的毒性作用，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化。取對數(shù)生長期的乳腺癌ZR-75-30細胞，以每孔1.8 mL(1.8×105個/孔)接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁后，吸棄舊培養(yǎng)基，每孔加入ρ(樣品)：25、50、100、200、400、800 μg/mL，溶液2 mL，培養(yǎng)24 h。以相同體積的DMSO溶液代替樣品溶液作為對照組，于37 ℃，φ(CO2)=5%的條件下培養(yǎng)12 h，采用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。

1.6 PI單染熒光檢測細胞凋亡

在1.5實驗操作的基礎(chǔ)上，向6孔板的每孔中加入1 mLρ(PI)=10 μg/mL溶液，避光孵育30 min，棄去上清液，PBS洗滌3次，置于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。

在對我國各建筑工地進行了多次的走訪與調(diào)查之后，從調(diào)查的結(jié)果中不難看出，我國現(xiàn)階段有部分企業(yè)對于成本的控制缺乏科學性，存在諸多管理問題?？刂品椒ú豢茖W，其主要原因有管理制度的缺失，企業(yè)的實際經(jīng)濟狀況與工程預算相脫節(jié)等問題。部分企業(yè)的成本控制方式僅限于理論，并未能結(jié)合實際，屬于紙上談兵，以至于工程的正常施工受到阻礙，成本資金出現(xiàn)浪費問題[2]。除此之外，在工程項目前期的招、投標階段，相關(guān)企業(yè)未能理清事實，過分追求經(jīng)濟利益的最大化，致使企業(yè)的相關(guān)人員對于成本的管控缺少嚴謹?shù)膽B(tài)度，使之控制缺少科學依據(jù)，會降低企業(yè)經(jīng)濟效益，不利于其經(jīng)營。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品對乳腺癌ZR-75-30細胞生長增殖的影響

配置不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，采用MTT法檢測不同質(zhì)量濃度樣品對乳腺癌ZR-75-30細胞活力的影響，并計算樣品對乳腺癌ZR-75-30細胞抑制率，結(jié)果見圖1。

ρ(樣品)/(μg·mL-1)圖1 不同樣品對乳腺癌ZR-75-30細胞的抑制率

由圖1可知，經(jīng)中國被毛袍提取物、蟲草素處理乳腺癌ZR-75-30細胞24 h后，抑制率均隨著ρ(樣品)的增大呈現(xiàn)升高的趨勢，即抑制率與ρ(樣品)存在依賴關(guān)系。

IC50值是抑制率為50%時的ρ(樣品)值，IC50值越低，其樣品對乳腺癌ZR-75-30細胞的抑制能力越強。采用Origin2018軟件擬合計算蟲草素和中國被毛孢提取物對乳腺癌ZR-75-30細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)，結(jié)果見圖2。

樣品圖2 不同樣品對乳腺癌ZR-75-30細胞作用24h的IC50

由圖2可知，蟲草素和中國被毛孢提取物對乳腺癌ZR-75-30細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為51.38和180.16 μg/mL，可以看出，不同樣品對乳腺癌ZR-75-30細胞的抑制能力大小為蟲草素>中國被毛袍提取物。

2.2 乳腺癌ZR-75-30細胞形態(tài)觀察結(jié)果

不同ρ(樣品)對乳腺癌ZR-75-30細胞形態(tài)的影響見圖3～圖5。

圖3 對照組

a 50 μg/mL

b 200 μg/mL

c 400 μg/mL圖4 不同ρ(提取物)對乳腺癌ZR-75-30細胞形態(tài)的影響

a 50 μg/mL

b 200 μg/mL

c 400 μg/mL圖5 不同ρ(蟲草素)對乳腺癌ZR-75-30細胞形態(tài)的影響

由圖3可知，對照組中的大多數(shù)細胞生長狀態(tài)良好、排列緊密，呈梭形且邊界清晰；由圖4、圖5可知，加藥組細胞的形態(tài)均隨著ρ(藥物)增大而發(fā)生顯著變化，細胞排列逐漸稀疏，出現(xiàn)形態(tài)變圓，細胞固縮、體積縮小，貼壁細胞脫落、數(shù)量逐漸減少等死亡特征，表明中國被毛袍提取物、蟲草素均對乳腺癌ZR-75-30細胞有抑制作用，且呈質(zhì)量濃度依賴性。

2.3 乳腺癌ZR-75-30細胞凋亡結(jié)果

PI熒光染色后呈現(xiàn)的紅色熒光數(shù)量多少代表了凋亡細胞的數(shù)目，不同質(zhì)量濃度樣品對乳腺癌ZR-75-30細胞凋亡影響見圖6、圖7。

由圖6、圖7可知，隨著ρ(藥品)增大，2組凋亡細胞數(shù)目均逐漸增多，說明中國被毛袍提取物、蟲草素均能夠誘導細胞凋亡，且呈質(zhì)量濃度依賴性，ρ(藥品)越大，誘導細胞凋亡能力越強。蟲草素誘導乳腺癌ZR-75-30細胞凋亡能力大于提取物。

a 50 μg/mL

b 200 μg/mL

c 400 μg/mL圖6 不同ρ(提取物)對乳腺癌ZR-75-30細胞凋亡影響

a 50 μg/mL

b 200 μg/mL

c 400 μg/mL圖7 不同ρ(蟲草素)對乳腺癌ZR-75-30細胞凋亡影響

3 結(jié) 論

(1)采用MTT法檢測中國被毛孢提取物、蟲草素對人乳腺癌細胞ZR-75-30的生長抑制作用，其IC50值分別為180.16和51.38 μg/mL；

(2)PI單染熒光拍照檢測發(fā)現(xiàn)2個樣品均以濃度依賴方式誘導人乳腺癌細胞ZR-75-30凋亡，蟲草素誘導能力大于提取物。提示中國被毛孢提取物、蟲草素能夠有效抑制人乳腺癌細胞ZR-75-30的生長增殖。