工業(yè)大麻發(fā)育早期雌雄株鑒定方法的研究

孫哲王金娥喬永剛

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.靈石縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山西 靈石 031300)

大麻(Cannabis Sativa L.)是?？?Moraceae)大麻屬(Cannabis)一年生直立草本植物[1]，為雌雄異株異花授粉植株。大麻起源于中國(guó)，是地球上最古老的作物之一，栽培歷史超過(guò)一萬(wàn)年[2]，其中工業(yè)大麻又名漢麻，是指四氫大麻酚含量低于0.3%的大麻品種[3]。大麻種子富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸，具有降壓調(diào)脂、改善消化系統(tǒng)等功效[4]；其莖稈所含的大麻纖維具有吸濕、散濕、透氣等特點(diǎn)，是很好的紡織、造紙和建筑原材料[5]；其花、葉中的活性物質(zhì)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域[6]。

工業(yè)大麻植株多為雌雄異株，偶有雌雄同株現(xiàn)象，雌雄株比例一般為1∶1，但外界環(huán)境條件會(huì)影響雌雄株比例[7]。工業(yè)大麻的雌雄株有各自的特點(diǎn)，一般來(lái)說(shuō)，工業(yè)大麻雄株的纖維質(zhì)量高于雌株，雌株可以收獲種子。但是，目前尚無(wú)準(zhǔn)確鑒定工業(yè)大麻種子和幼苗期性別的方法，且工業(yè)大麻的性別表達(dá)受多種因素影響，如溫度、光周期、激素、重金屬鹽等都能誘導(dǎo)大麻性別表達(dá)[8]。

工業(yè)大麻早期性別鑒定的方法主要有性狀鑒定和分子鑒定，在工業(yè)大麻性別分化研究中，《齊民要術(shù)》等古書籍記載，顏色較黑、籽粒飽滿的種子多為雌麻；顏色較淺，粒重較輕的種子多為雄麻[9]。王殿奎[10]等提出,工業(yè)大麻植株在10cm左右時(shí)，會(huì)出現(xiàn)紫心紫莖植株，為花麻，即雄麻。彭子模[11]等人的研究顯示，工業(yè)大麻幼苗提取液在甲基紅染色后水浴20～23h后顏色會(huì)發(fā)生明顯差異，混合液呈黃褐色的為雄性，呈黃綠色的為雌性。姜穎[12]等人篩選出1條大小為869bp的工業(yè)大麻雄性特異性序列。

根據(jù)不同的生產(chǎn)目標(biāo)需要合理配置雌雄株，在種子和幼苗期對(duì)大麻植株進(jìn)行性別鑒定是必要的，為探索一種簡(jiǎn)單易行的工業(yè)大麻發(fā)育早期雌雄株鑒定方法，本試驗(yàn)利用雄株特異性序列、種子特征性狀、苗期性狀對(duì)工業(yè)大麻雌雄株進(jìn)行鑒定與研究，以期得到在種子和苗期判斷工業(yè)大麻性別的方法，為工業(yè)大麻的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用工業(yè)大麻材料來(lái)自20個(gè)不同產(chǎn)地，經(jīng)山西農(nóng)業(yè)大學(xué)喬永剛副教授鑒定，均種植于太谷區(qū)申奉村試驗(yàn)田，見表1。隨機(jī)均勻選取各產(chǎn)地的工業(yè)大麻雌雄株葉片適量，用酒精擦拭后裝于自封袋中，于-80℃保存?zhèn)溆?。另隨機(jī)選取DM19幼苗和種子若干，分別用于紫心紫莖幼苗鑒定、甲基紅染色鑒定、種子形態(tài)鑒定試驗(yàn)和DNA提取。

表1 工業(yè)大麻種質(zhì)資源產(chǎn)地信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工業(yè)大麻植株的分子鑒定

取20個(gè)產(chǎn)地的已知性別的工業(yè)大麻葉片利用改良CTAB法提取樣本基因組DNA，使用Nanodrop 2000c測(cè)定DNA濃度和純度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取DNA的質(zhì)量，并于4℃保存?zhèn)溆?。所選的工業(yè)大麻雄性特異性序列引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，信息見表2。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(10μL)及擴(kuò)增程序信息見表3。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，利用凝膠成像儀檢測(cè)。20個(gè)產(chǎn)地工業(yè)大麻雄株進(jìn)行單株鑒定，每個(gè)產(chǎn)地雄株單獨(dú)鑒定10株，20個(gè)產(chǎn)地工業(yè)大麻雌株進(jìn)行混樣鑒定。

表2 工業(yè)大麻雄性特異性序列引物信息

表3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序

1.2.2 工業(yè)大麻種子形態(tài)觀察與分子鑒定

選取DM19工業(yè)大麻種子，稱重并描述種子形態(tài)，按重量與顏色對(duì)種子進(jìn)行分類后利用1.2.1分子鑒定方法進(jìn)行性別鑒定。

1.2.3 工業(yè)大麻幼苗外觀形態(tài)觀察與分子鑒定

選取DM19工業(yè)大麻紫心紫莖與綠心綠莖幼苗觀察記錄，并選用20株紫心紫莖工業(yè)大麻幼苗進(jìn)行分子鑒定。

1.2.4 工業(yè)大麻幼苗甲基紅染色與分子鑒定

隨機(jī)選取DM19工業(yè)大麻幼苗30株，分別取葉片各0.1g，加2mL蒸餾水研磨成勻漿，室溫浸提1h后，4000r·min-1離心5min，取上清液1mL，加入2mL配好的甲基紅染料，水浴20h后觀察顏色并記錄[11]，同時(shí)對(duì)所有植株進(jìn)行分子鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 工業(yè)大麻雄性特異性引物的驗(yàn)證

本試驗(yàn)所用基因組DNA的A260/A280值均在1.7～2.0，A260/A230值均>2.0，說(shuō)明提取的DNA純度較高，無(wú)蛋白質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽污染。利用姜穎[12]等人研究的雄性特異性序列對(duì)20個(gè)產(chǎn)地的工業(yè)大麻雌雄株進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果如圖1所示，所有雄性植株葉片材料在869bp處均出現(xiàn)特異性條帶，雌株混池H1、H2未出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，說(shuō)明此引物可以用于鑒定工業(yè)大麻雌雄株。

2.2 工業(yè)大麻種子對(duì)雄性特異性引物的驗(yàn)證

為驗(yàn)證雄性特異性序列是否可以鑒定種子雌雄，隨機(jī)取10粒工業(yè)大麻種子，利用OPV-08引物進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果如圖2所示，Z2、Z3、Z5、Z8、Z9在869bp處出現(xiàn)特異性條帶，為雄性種子，其余未出現(xiàn)條帶，為雌性種子，說(shuō)明該方法可以用于鑒定工業(yè)大麻種子雌雄。

圖2 工業(yè)大麻種子對(duì)雄性特異性引物的驗(yàn)證

2.3 種子形態(tài)特征與性別鑒定

為驗(yàn)證種子形態(tài)鑒定工業(yè)大麻雌雄的準(zhǔn)確性，對(duì)DM19工業(yè)大麻種子稱量及觀測(cè)后，可以將種子分為6類，如表4、圖3所示。每類種子各取10粒提取單粒種子DNA，以O(shè)PV-08為引物進(jìn)行分子鑒定。結(jié)果如圖4所示，DS種子中有5粒出現(xiàn)特異性條帶，XS種子中有7粒出現(xiàn)特異性條帶；DQ種子中有1粒出現(xiàn)特異性條帶，XQ種子中有3粒出現(xiàn)特異性條帶；DB種子中4粒出現(xiàn)特異性條帶，XB種子中有2粒出現(xiàn)特異性條帶，為雄性工業(yè)大麻種子。

圖3 工業(yè)大麻種子形態(tài)分類

圖4 不同類型工業(yè)大麻種子分子鑒定結(jié)果

表4 工業(yè)大麻種子形態(tài)特征信息

2.4 工業(yè)大麻幼苗紫心紫莖與性別鑒定

為驗(yàn)證紫心紫莖工業(yè)大麻是否全為雄株，對(duì)采挖的20株紫心紫莖的工業(yè)大麻植株進(jìn)行觀察，并提取葉片DNA，以O(shè)PV-08為引物進(jìn)行分子鑒定。紫心紫莖工業(yè)大麻以及綠心綠莖工業(yè)大麻幼苗的顏色對(duì)比見圖5，分子鑒定結(jié)果顯示，20株紫心紫莖大麻中有11株出現(xiàn)特異性條帶，為雄性工業(yè)大麻，見圖6。

圖5 工業(yè)大麻幼苗紫心紫莖與綠心綠莖特征示意圖

圖6 紫心紫莖工業(yè)大麻植株分子鑒定結(jié)果

2.5 工業(yè)大麻甲基紅染色特征與性別鑒定

為驗(yàn)證甲基紅染色鑒定雌雄株的可行性，對(duì)選取的DM19的30株工業(yè)大麻幼苗進(jìn)行染色試驗(yàn)，結(jié)果顯示，32℃水浴20h后，混合液出現(xiàn)2種不同顏色，其中13個(gè)為紫紅色，17個(gè)為黃褐色，如圖7所示。對(duì)其葉片提取DNA，以O(shè)PV-08為引物進(jìn)行分子鑒定。結(jié)果顯示，13個(gè)呈紫紅色的樣本中有5個(gè)出現(xiàn)特異性條帶，17個(gè)呈黃褐色樣本中有8個(gè)出現(xiàn)特異性條帶，驗(yàn)證為雄株。測(cè)量32℃水浴20h后混合液的pH值，結(jié)果如表5所示。

圖7 工業(yè)大麻幼苗甲基紅鑒定結(jié)果示意圖

表5 工業(yè)大麻甲基紅染色前后pH值

3 討論與結(jié)論

大麻早期性別鑒定的方法有許多種，主要分為性狀鑒定和分子鑒定，性狀鑒定分為種子鑒定和苗期鑒定，多為經(jīng)驗(yàn)鑒定。分子鑒定是利用特異性引物進(jìn)行標(biāo)記的一種方法，Mandolino等[13]利用RAPD技術(shù)從大麻中獲得1個(gè)400bp與雄性表型相關(guān)的標(biāo)記。Shao等[14]利用15個(gè)RAPD隨機(jī)引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物OPA-04和OPF-05擴(kuò)增得到3個(gè)雌性相關(guān)片段。李仕金等[15]利用200條RAPD隨機(jī)引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物S208擴(kuò)增得到1條大小為429bp與大麻雄性相關(guān)的特異條帶。呂佳淑等[16]利用AFLP分子標(biāo)記發(fā)現(xiàn)了1條348bp的大麻性別連鎖雄性特異條帶。郭麗等[17]獲得了大麻雄性連鎖AFLP片段，大小為734bp。陳其軍等[18]利用S401引物擴(kuò)增得到長(zhǎng)度約為2.5kb的雄性相關(guān)片段。

本試驗(yàn)用20個(gè)不同產(chǎn)地的已知雌雄的工業(yè)大麻葉片對(duì)姜穎等[12]開發(fā)的RAPD工業(yè)大麻雄性特異性引物進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，雄性葉片均在869bp處出現(xiàn)特異性條帶，雌性葉片混池均未出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，說(shuō)明此引物可以用來(lái)鑒定工業(yè)大麻雌雄株。對(duì)于工業(yè)大麻種子雌雄的鑒定，前人多是通過(guò)種子外觀形態(tài)進(jìn)行鑒定，未曾用分子標(biāo)記的方法鑒定過(guò)大麻種子雌雄。本試驗(yàn)通過(guò)提取單粒大麻種子基因組DNA，利用特異性引物OPV-08進(jìn)行分子鑒定，在869bp處出現(xiàn)特異性條帶，說(shuō)明可以通過(guò)分子標(biāo)記的方法鑒定出種子雌雄。

種子形態(tài)驗(yàn)證時(shí)，按照種子外觀形態(tài)，將種子分為6類，古籍描述的種皮顏色較黑、籽粒飽滿的種子多為雌麻，顏色較淺，粒重較輕的種子多為雄麻。本試驗(yàn)通過(guò)人眼識(shí)別出的外觀形態(tài)可能有所差別，也有可能生長(zhǎng)后期會(huì)出現(xiàn)性別誘導(dǎo)，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果不一致。種皮帶斑與否為種子外觀形態(tài)的明顯性狀，通過(guò)驗(yàn)證也無(wú)法鑒定出種子雌雄。與宋湛江[19]在《我國(guó)古代的大麻生產(chǎn)》提到的“古代這種說(shuō)法有矛盾，因?yàn)槿鐔畏N白麻子或斑黑麻子,都無(wú)法繁殖后代。再說(shuō)現(xiàn)在大麻也有灰白、斑黑和其他顏色的種子，而在生產(chǎn)上也未有能根據(jù)種子顏色不同而區(qū)別性別的方法”的結(jié)果相一致。

紫心紫莖的大麻驗(yàn)證結(jié)果顯示，有11株紫心紫莖工業(yè)大麻為雄性，與紫心紫莖工業(yè)大麻全部為雄株的預(yù)期結(jié)果不符。甲基紅染色試驗(yàn)結(jié)果顯示，染色后混合液32℃水浴20h后，出現(xiàn)紫紅色和黃褐色2種顏色，測(cè)試其pH值后，與甲基紅的變色范圍值一致[20]，但是2種顏色中均存在雌性和雄性，與雄性植株為黃褐色，雌性植株為黃綠色的預(yù)期結(jié)果不一致。

這些試驗(yàn)結(jié)果均表明，前人僅從種子以及幼苗外觀、顏色等形態(tài)特征對(duì)工業(yè)大麻雌雄進(jìn)行鑒定的方法不可靠，工業(yè)大麻雄性特異性序列可以準(zhǔn)確鑒定出大麻種子和葉片的雌雄。