黑果枸杞葉片膜透性和膜保護系統(tǒng)對不同歷時凈風和風沙流吹襲的響應(yīng)

侍新萍，魏林源，馬 瑞，馬彥軍，張瑩花，楊永義

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學林學院，甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅省治沙研究所 荒漠化與風沙災(zāi)害防治重點實驗室，甘肅 蘭州 730070）

風和風沙流在風大沙多的干旱、半干旱荒漠區(qū)頻繁發(fā)生，破壞性極強[1]。由風力作用攜帶的沙粒運動過程中對植物頂芽、葉片、莖干造成擊打、斷稍、磨損等機械損傷，因而對其表觀特征[2]、光合生理[3]、解剖結(jié)構(gòu)[4-6]等產(chǎn)生明顯影響。強風和風沙流甚至會導(dǎo)致植物幼嫩表皮細胞組織受損，膜透性增大，細胞液外流而死亡，且在風沙活動劇烈地區(qū)植物的分布、生長繁衍及其物種多樣性受到抑制，加劇了土地荒漠化[2,7-8]。而植物在干旱、風沙等環(huán)境因子脅迫時，一般通過各種保護措施或自身修復(fù)能力緩解或抵抗脅迫造成的危害[9]。

不同植物在風沙環(huán)境中表現(xiàn)出來的形態(tài)、生理代謝等變化規(guī)律有所不同，反映出各植物抗風沙的能力也不盡相同。已有研究表明，風和風沙流脅迫的機械作用導(dǎo)致草本、灌木和作物幼苗的氣孔關(guān)閉、葉溫和胞間CO2濃度降低、蒸騰加快，使光合作用受抑制，導(dǎo)致植物生長減緩，同時水分利用效率和葉水勢降低增加了對植物的干燥作用，而且風沙流脅迫下的植物葉片會卷曲、脫落，甚至出現(xiàn)斷稍現(xiàn)象，一般灌木較草本具有更強的抗風沙性[10-11]。環(huán)境脅迫影響植物的生長發(fā)育過程，而植物在對環(huán)境的長期適應(yīng)中逐步形成了保護酶系統(tǒng)和滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)。不同強度的風和風沙流脅迫下，植物通過增加酶活性清除體內(nèi)多余活性氧，維持體內(nèi)活性氧代謝的平衡以及增加其滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量降低滲透勢，提高植物組織持水力，對細胞膜起保護作用，反映植物抗風沙逆境能力[10,12]。隨著風和風沙流強度的增大，玉米(Zea mays)幼苗丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量下降，膜透性逐漸增加，過氧化物酶活性(soluble protein, POD)逐漸增強，過氧化氫酶(catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、可溶性糖和脯氨酸含量呈波動變化[13]。不同風速持續(xù)吹襲下，樟子松(Pinus sylvestris)幼苗氣孔導(dǎo)度和胞間CO2濃度的降低或增加是其光合速率和蒸騰速率降低或增加的主要原因，而水分利用效率卻隨風速增強呈先升高后降低趨勢[14-15]。這些研究為揭示植物適應(yīng)風沙環(huán)境的生理響應(yīng)機制提供了一定的理論依據(jù)，也進一步說明植物對風沙逆境的耐受力以及其響應(yīng)特征因植物種類、脅迫強度、持續(xù)時間而異。

黑果枸杞(Lycium ruthenicum)為茄科(Solanceae)枸杞屬多棘刺灌木，適應(yīng)性較強，主要以灌叢狀分布在我國西北的干旱、鹽堿的荒漠和半荒漠地區(qū)，是中國荒漠區(qū)特有的抗鹽堿、耐旱，同時具有耐寒、耐沙埋、耐高溫、繁殖速度快、生態(tài)幅寬、抗風固沙、保持水土等優(yōu)點的生態(tài)樹種[16-17]，也是集藥用、經(jīng)濟、營養(yǎng)價值為一體的野生優(yōu)良植物，藥用、營養(yǎng)價值遠遠高于普通紅枸杞，被譽為植物“軟黃金”[18]。常生長于鹽堿地、沙荒地或渠路兩旁，干旱、鹽堿、高溫以及風沙等多重脅迫因子的影響是限制其生長發(fā)育的關(guān)鍵因素。目前，對黑果枸杞的研究主要集中在栽培技術(shù)[19]、耐鹽堿、果實色素和多糖[20-21]等方面，而關(guān)于黑果枸杞在不同歷時風和風沙流持續(xù)吹襲下的應(yīng)急響應(yīng)機制以及其是否可以通過調(diào)整生理指標的變化去適應(yīng)風沙環(huán)境的抗逆性研究還很少。因此，本研究以民勤種源的二年生黑果枸杞盆栽苗為試驗材料，采用風沙環(huán)境模擬試驗，開展不同歷時風和風沙流脅迫對黑果枸杞葉片膜透性影響及其膜保護系統(tǒng)響應(yīng)的研究，分析測定不同歷時風和風沙流脅迫下二年生黑果枸杞葉片的膜透性、保護酶活性、MDA 及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化規(guī)律，旨在揭示黑果枸杞適應(yīng)風沙脅迫的生理調(diào)節(jié)機制，為荒漠區(qū)黑果枸杞植被恢復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

民勤荒漠區(qū)位于河西走廊東部，石羊河流域下游，地理坐標為101°49′ - 104°12′ E、38°3′ - 39°27′ N，海拔1 298～1 936 m。研究區(qū)屬典型的溫帶大陸性干旱荒漠氣候，年均氣溫8.0 ℃，年均降水量165 mm，年均蒸發(fā)量2 623 mm，無霜期162 d，晝夜溫差較大。該區(qū)風沙大，沙塵天氣頻發(fā)，全年盛行西北風，5.0 m·s-1以上起沙風日數(shù)占全年有風日數(shù)的13.8%，年平均有風記錄占99.23%，年均最大風速8.4 m·s-1，年均揚沙時間16 d。

1.2 試驗設(shè)計

以二年生黑果枸杞盆栽實生苗為試驗材料，其種子采自民勤縣青土湖區(qū)的野生黑果枸杞。2018 年3 月將種子播種在拌有適量羊糞和荒漠風沙土的育苗缽中，待幼苗高度為10 cm 左右時，擇優(yōu)帶土移栽到口徑22 cm 的塑料花盆中繼續(xù)培養(yǎng)，每盆1 株。在試驗前一年(2018 年)秋季將花盆埋入試驗地中，盆口與地表齊平，花盆之間留有適當?shù)木嚯x，避免苗木間互相干擾，影響生長，并通過適時適量澆水、做好冬季防凍措施等保證苗木安全越冬。風和風沙流吹襲試驗前測定其株高、冠幅等生物學特性，然后選擇株高25 cm 左右，生長均勻、長勢較好、無病蟲害且生物學特征無顯著差異的二年生黑果枸杞植株作為試驗材料。

風和風沙流模擬試驗于2019 年8 月20 日在甘肅省治沙研究所武威綠洲站的風沙環(huán)境風洞實驗室完成。該風洞為直流下吹式，軸線風速在4～30 m·s-1連續(xù)可調(diào)，洞口橫截面為1.2 m × 1.2 m，洞體總長38.9 m，試驗段長16 m。依據(jù)民勤季節(jié)性平均風速范圍及以往風吹研究報道中不同強度的凈風和風沙流對植物葉片的損害程度，選擇能夠引起脅迫效應(yīng)但又不至于造成嚴重損傷甚至致死的中等強度的凈風和風沙流脅迫[1-2,12,22-24]，即12 m·s-1的凈風，以及相應(yīng)的63.28 g·(cm·min)-1風沙流強度對黑果枸杞進行10、20 和30 min 的脅迫。試驗前等量澆水一次，在風洞實驗段內(nèi)鋪設(shè)厚度為10 cm 左右的沙漠沙，測定風洞實驗室內(nèi)實時溫度和實時壓強錄入主控系統(tǒng)，每個脅迫時間分別選擇長勢一致的6 盆苗。進行凈風脅迫試驗前，將花盆呈兩排三列擺放在試驗段中間段位置；風沙流脅迫試驗前，將花盆呈兩排三列擺放在試驗段下風向，且花盆均與洞口保持同一高度，保證苗在風沙流吹襲范圍內(nèi)。另外，考慮到不同植物種會因脅迫因子的差異形成不同的適應(yīng)機制和響應(yīng)方式，其膜結(jié)構(gòu)完整性與膜保護系統(tǒng)主要生理指標的變化幅度及所起作用的大小也具有一定的差異性。為揭示黑果枸杞對不同歷時凈風和風沙流逆境脅迫的適應(yīng)機制，于吹襲結(jié)束后，選擇葉片膜透性和膜保護系統(tǒng)主要生理指標進行測定。即先將受脅迫植株放置在通風、陰涼的地方靜置30 min，之后快速、隨機剪取適量植株中上部葉片，部分葉片即刻帶回實驗室測定電導(dǎo)率，另一部分葉片用錫紙包裹經(jīng)液氮罐轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱保存，用于抗氧化酶活性、丙二醛和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的測定，每個處理6 個重復(fù)，以未受脅迫的植株作為對照(CK)。

1.3 指標測定

膜透性采用電導(dǎo)率法，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸比色法測定，過氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性分別采用氯化硝基四氮唑藍(NBT)光還原法、愈創(chuàng)木酚法和過氧化氫碘量法測定，脯氨酸(Pro)、可溶性糖(SS)和可溶性蛋白(SP)含量分別采用酸性茚三酮比色法、蒽酮比色法和考馬斯亮藍G-250 溶液測定[25-28]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

應(yīng)用Excel 2010 和SPSS 24.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用雙因素方差分析，不同處理間多重比較采用LSD 法(P＜ 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 凈風和風沙流脅迫對黑果枸杞葉片生理指標的影響

如表1 所列，脅迫時間對黑果枸杞葉片MDA 含量無顯著影響但對膜透性、SOD、POD 和CAT 活性及Pro、SS 和SP 含量間均存在極顯著影響(P＜0.01)；凈風和風沙流處理對膜透性和MDA、Pro 含量無顯著影響，但對SOD、POD 和CAT 活性及SS 和SP 含量均存在極顯著影響(P＜ 0.01)；時間 × 凈風和風沙流處理對膜透性和MDA、Pro 和SS 含量無顯著影響，但對SOD、POD 和 CAT 活性及可溶性蛋白含量具有極顯著影響(P＜ 0.01)。需對上述存在極顯著的指標進行多重比較。

表1 黑果枸杞葉片生理生化指標的方差分析Table 1 Variance analysis of Lycium ruthenicum leaf physiological and biochemical indices

2.2 丙二醛含量和膜透性變化

如圖1 所示，在各脅迫時間下，凈風和風沙流處理的MDA 含量均無顯著差異(P＞ 0.05)；由表1可知，各個脅迫時間 × 凈風和風沙流交互作用間亦無顯著差異(P＞ 0.05)。12 m·s-1凈風處理下，MDA含量隨脅迫時間增加呈先降后升趨勢，僅在30 min處理下較CK 增加了17.05%，差異均不顯著(P＞ 0.05)。10、20 和30 min 風沙流處理的MDA 含量較CK分別增加了6.78%、33.94%和1.46%，僅在20 min 脅迫下存在顯著差異(P＜ 0.05)。

圖1 黑果枸杞葉片丙二醛含量和膜透性對凈風、風沙流脅迫時間的響應(yīng)Figure 1 The MDA content and membrane permeability of Lycium ruthenicum leaf response to net-wind and wind-sand flow with different time durations

脅迫時間 × 凈風和風沙流交互作用對葉片膜透性均無顯著差異(P＞ 0.05) (表1)。隨著脅迫時間的增加，凈風和風沙流處理的膜透性呈波動增加趨勢，且各脅迫時間下凈風和風沙流處理間均無顯著差異(P＞ 0.05) (圖1)。在10、20 和30 min 凈風處理下，膜透性分別較CK 顯著增加了71.82%、105.27%和79.38% (P＜ 0.05)；在10、20 和30 min 風沙流處理下，膜透性與CK 相比顯著增加了82.85%、77.37%和87.44% (P＜ 0.05)。

2.3 抗氧化酶活性變化

如圖2 所示，10、20、30 min 脅迫下，凈風和風沙流處理的SOD、CAT 活性均存在顯著差異(P＜0.05)，而POD 活性則均無顯著差異(P＞ 0.05)。除CK外，脅迫時間 × 凈風和風沙流交互作用對葉片的SOD 和CAT 活性均存在顯著差異(P＜ 0.05) (表1)。隨吹襲時間的增加，凈風脅迫下的SOD 活性總體呈下降趨勢，在10 min 處理下，SOD 活性較CK 增加了2.24%，與CK 無顯著差異(P＞ 0.05)，20 和30 min處理下SOD 活性均較CK 顯著降低(P＜ 0.05)。POD活性總體呈增加趨勢，10、20 和30 min 脅迫下的POD 活性分別較CK 顯著上升69.35%、82.35%和56.13% (P＜ 0.05)。CAT 活性隨吹襲時間增加呈先升后降趨勢，脅迫時間為10 min 時CAT 活性略高于CK，20 min 處理下較CK 顯著增加34.49%，30 min處理下較CK 顯著降低39.15% (P＜ 0.05)。

圖2 黑果枸杞葉片抗氧化酶活性對凈風、風沙流脅迫時間的響應(yīng)Figure 2 The antioxidant enzyme activity of Lycium ruthenicum leaf responses to net-wind and wind-sand flow with different time durations

在風沙流脅迫下，隨吹襲時間延長，SOD 活性呈先降后升趨勢(圖2)，10 min 脅迫處理較CK 顯著降低34.98%，20 和30 min 脅迫處理較CK 顯著增加了44.04%和30.32% (P＜ 0.05)。POD 活性呈先升后降趨勢，但均大于CK，POD 活性在10、20 和30 min吹襲下分別較CK 顯著增加了70.72%、122.35%和73.63% (P＜ 0.05)。CAT 活性呈波動式增加，10 min風沙流脅迫下CAT 活性最強，較CK 顯著增加了54.74% (P＜ 0.05)，脅迫時間為20 和30 min 時CAT活性減弱，但仍較CK 有所增加，且30 min 處理與20 min 處理相近，與CK 無顯著差異(P＞ 0.05)。

2.4 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量變化

在各個時間脅迫下，凈風和風沙流處理的Pro含量均無顯著差異(P＞ 0.05) (圖3)；凈風和風沙流處理的SS 含量在20 和30 min 脅迫下差異顯著，而SP 含量在10 和20 min 脅迫下差異顯著(P＜ 0.05)。

圖3 黑果枸杞葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量對凈風、風沙流脅迫時間的響應(yīng)Figure 3 The osmotic regulation substance content Lycium ruthenicum leaf responses to net-wind and wind-sand flow with different time durations

在凈風脅迫下，隨風吹時間增加，Pro 含量呈波動上升趨勢(圖3)，20 min 脅迫下出現(xiàn)峰值，較CK增加了37.56% (P＜ 0.05)，10 和30 min 脅迫下，分別較CK 顯著增加了3.36%和8.23% (P＞ 0.05)。SS 含量也呈波動上升趨勢，10、20 和30 min 處理的SS 含量分別較CK 顯著增加了36.90%、47.04%和21.92%(P＜ 0.05)。SP 含量逐漸下降，與CK 相比，10、20 和30 min 處理的SP 分別顯著降低11.20%、16.82%和21.88% (P＜ 0.05)。

在風沙流脅迫下，隨吹襲時間延長，Pro 含量呈波動增加(圖3)，僅在20 min 脅迫時較CK 顯著增加39.72% (P＜ 0.05)， 脅迫時間為10 和30 min時，Pro 含量減少，但仍較CK 增加了17.53%和19.30%，差異不顯著(P＞ 0.05)。SS 含量呈波動增加趨勢，10、20 和30 min 處理的SS 含量分別較CK 顯著增加了37.69%、97.05%和61.52% (P＜ 0.05)。SP含量呈先降后升趨勢，但均低于CK；與CK 相比，10、20 和30 min 處理的SP 含量分別顯著降低47.92%、25.92%和27.88% (P＜ 0.05)。

3 討論

MDA 含量可表示細胞膜脂過氧化作用的強弱和質(zhì)膜受傷害程度。當植物受到逆境脅迫時，其體內(nèi)活性氧大量積累，導(dǎo)致膜脂過氧化或膜脂脫脂化作用，使細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性遭到破壞[29-30]。本研究表明，12 m·s-1凈風和風沙流脅迫均對黑果枸杞的葉片造成一定程度的機械損傷，使細胞膜透性顯著增大。凈風脅迫時，MDA 含量僅在30 min 脅迫下略高于CK，因為此時僅POD 活性顯著升高，而膜透性在20 min 處理時達到最大值；風沙流脅迫時，MDA 含量總體呈上升趨勢，在20 min 處理下顯著高于CK，10 和30 min 處理均略高于CK，膜透性在30 min 處理時達到最大值。說明12 m·s-1凈風和風沙流持續(xù)吹襲10、20 和30 min 均未導(dǎo)致明顯的膜脂過氧化作用，其細胞膜結(jié)構(gòu)的破壞可能并非源自膜脂過氧化，而是由于膜脂脫脂化或其他因素[31-32]，但在30 min 風沙流處理下的MDA 含量較10 和20 min降低，可能是因為植物在10 和20 min 風沙脅迫下的適應(yīng)能力弱，MDA 含量升高，在30 min 脅迫下黑果枸杞對風沙環(huán)境逐漸形成了適應(yīng)性，MDA 含量呈現(xiàn)降低趨勢，這與李道明等[33]對重度風沙流脅迫后霸王膜透性顯著增大導(dǎo)致MDA 含量下降的研究結(jié)果一致。

植物在遭受逆境環(huán)境脅迫時，隨著體內(nèi)活性氧的增加積累，其體內(nèi)應(yīng)對脅迫的保護酶系統(tǒng)會被激活，SOD、POD 和CAT 等抗氧化酶活性增強，并通過單獨或協(xié)同作用起清除活性氧、保護細胞膜免受氧化損傷，以減輕逆境脅迫對植物的傷害，可以反映植物應(yīng)對逆境脅迫的適應(yīng)性和抵抗能力的強弱[31,34]。相關(guān)研究表明，酶活性的變化幅度及所起作用的大小與植物種類和持續(xù)時間長短、脅迫強度有關(guān)[12,35]。本研究表明，凈風和風沙流脅迫時，SOD、POD 和CAT 活性因脅迫時間不同而表現(xiàn)出一定的差異性，而且這3 種酶在植物體內(nèi)起作用的大小因脅迫時間而異。凈風處理下，SOD、POD 和CAT 活性隨脅迫時間延長均呈先升后降趨勢，僅POD 一種酶活性均高于CK。其中在10 min 脅迫下，MDA 含量降低，SOD、POD 和CAT 活性均增加，起到減緩或避免膜脂過氧化的重要作用，20 min 脅迫時CAT 活性顯著增加，協(xié)同POD 起保護作用，30 min 脅迫下SOD 和CAT 活性降低，MDA 呈上升趨勢，膜透性達到最大值，但POD 活性仍顯著增強[36]。這說明SOD 和CAT 活性減弱，在抵抗風沙脅迫時的保護能力有限，而POD 對黑果枸杞苗木起主要保護作用[35]。風沙流處理下，SOD 活性先減后增，POD和CAT 活性先增后減，但均高于CK，這與在玉米幼苗[37]上的研究結(jié)果一致。從脅迫時間與凈風和風沙流交互作用角度而言，隨著脅迫時間的增加，在整個脅迫過程中，20 min 凈風處理下POD、CAT 活性增幅最大，20 min 風沙流處理下SOD、POD 活性均高于其他脅迫時間。這說明10 min 脅迫時SOD 活性顯著降低可能是導(dǎo)致膜透性顯著增加的原因之一[34]，而POD和CAT 是抵御風沙環(huán)境的主要酶活性，20 和30 min脅迫下3 種酶活性通過協(xié)調(diào)作用降低了風沙流脅迫對黑果枸杞造成的氧化損害，而且20 min 脅迫下的抗風沙能力最強。

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累對提高植物抗逆性有重要作用，植物在受到逆境脅迫時，可通過增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量保持細胞內(nèi)的滲透勢平衡，增強蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的水合作用，對細胞膜、酶和蛋白質(zhì)活性起保護作用，以提高植物的抗逆性，其滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的升高也可體現(xiàn)植物對逆境的應(yīng)變能力[38]。本研究表明，10、20 和30 min 凈風和風沙流處理下SP 含量均顯著低于CK，而且風沙流脅迫時的下降幅度較大，說明風沙流對SP 含量影響較大，可能是因為此時的脅迫超過了黑果枸杞的耐受力，蛋白質(zhì)水解加快，合成受阻，導(dǎo)致蛋白含量下降[39]。Pro 和SS 含量隨凈風和風沙流脅迫時間增加，均呈先上升后下降趨勢，當脅迫時間為20 min 時Pro 和SS 含量均達到最大值，30 min 處理下均有所降低，但仍高于CK，且風沙流脅迫下的Pro 和SS 含量的上升幅度均高于凈風脅迫，說明風沙流脅迫下SS 和Pro 的滲透調(diào)節(jié)作用更強，這與在樟子松[24]和玉米[34]上的研究結(jié)果一致。在脅迫時間與凈風和風沙流交互作用中，隨著脅迫時間的增加，20 min 凈風和風沙流處理下Pro 和SS 含量均高于其他脅迫時間。說明，SP 未發(fā)揮滲透調(diào)節(jié)作用，Pro 和SS 起到不同程度的滲透調(diào)節(jié)作用，但在20 min 脅迫下的保護作用最強，并隨脅迫時間的延長均表現(xiàn)出降低趨勢，仍能起到一定的保護作用。

4 結(jié)論

綜上所述，黑果枸杞膜系統(tǒng)在30 min 以內(nèi)的風沙脅迫下表現(xiàn)出不同程度的應(yīng)急響應(yīng)，在20 min脅迫下的抗風沙能力最強，對荒漠植被的恢復(fù)具有一定的指導(dǎo)意義。表明未來黑果枸杞的種植，應(yīng)結(jié)合干旱、高溫以及風和風沙流等環(huán)境因子的綜合影響，將其種植在較適宜的風沙環(huán)境中使荒漠植被的恢復(fù)和管理方面取得較好的生態(tài)和經(jīng)濟效益。