利用體外產(chǎn)氣法評價玉米秸稈黃貯與甜菜塊根組合效應(yīng)

冉生斌，劉建華

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物與啤酒原料研究所，甘肅 蘭州 730070）

甜菜(Beta vulgaris)是一種重要的能源作物[1]，甜菜塊根具有豐富的營養(yǎng)價值，碳水化合物含量高，粗纖維含量低，礦物質(zhì)及微量元素豐富，飼用價值較高，國外甜菜已成為反芻動物飼草料的主要來源之一[2-3]。國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)表明，2018 年我國農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量高達8 億 t，北方農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量約4 億 t，占全國產(chǎn)量的50%左右，但由于農(nóng)作物秸稈自身纖維含量高，營養(yǎng)價值低，以及飼用化利用技術(shù)的限制，約40%的農(nóng)作物秸稈被焚燒或丟棄，導致資源嚴重浪費。在我國北方地區(qū)，甜菜是一種普遍的經(jīng)濟作物，生產(chǎn)季節(jié)與枯草期同季，一方面可彌補冬季飼草短缺的問題，另一方面可以和其他農(nóng)作物秸稈組合利用，提高農(nóng)作物秸稈的飼用率。甜菜非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量(non-structural carbohydrate,NSC)較高，在瘤胃內(nèi)環(huán)境中發(fā)酵速率較快，營養(yǎng)物質(zhì)被微生物迅速降解。奶牛飼喂試驗結(jié)果表明，青貯后的甜菜渣可以提高奶牛混合日糧的能量水平，促進瘤胃微生物蛋白的合成[4]。然而，反芻動物在采食少量非結(jié)構(gòu)性碳水化合物后，對唾液的產(chǎn)生及反芻功能的刺激較弱，不能充分消化吸收，非結(jié)構(gòu)性碳水化合物采食過量時，會在微生物作用下過度發(fā)酵，改變瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，影響日糧中營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，甚至導致代謝類疾病的發(fā)生，這種改變對纖維素分解菌的影響最大[5]。但在高水平結(jié)構(gòu)性碳水化合物(structural carbohydrate，SC)日糧中，適量的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物又能增加微生物的活性。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中不同來源的碳水化合物(NSC、SC)比例對家畜干物質(zhì)采食量有顯著影響[6]。王夢芝等[7]研究表明，不同的NSC/SC 飼糧在瘤胃中發(fā)酵時，發(fā)酵特性也各有差異，飼糧中纖維素水平的變化對瘤胃液pH 有顯著影響，瘤胃液pH 隨纖維素水平增加而逐漸升高。結(jié)構(gòu)與非結(jié)構(gòu)性碳水化合物來源的粗飼料最佳組合直接影響動物的生產(chǎn)性能，因此，擬選取不同比例的玉米(Zea mays)秸稈黃貯和甜菜塊根為粗飼料來源，研究體外發(fā)酵組合效應(yīng)，提高甜菜塊根在反芻動物生產(chǎn)中的利用，為反芻動物健康高效養(yǎng)殖提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用玉米秸稈黃貯和甜菜塊根均由甘肅省農(nóng)業(yè)科學院試驗農(nóng)場提供。將風干后的飼草原料粉碎過0.45 mm 篩后測定營養(yǎng)成分[8]。飼草原料營養(yǎng)成分如表1 所列。試驗選取3 只健康且體況相近裝有永久瘤胃瘺管的小尾寒羊公羊，作為瘤胃液供體，供體羊飼糧精粗比為40 ∶ 60，其組成及營養(yǎng)水平如表2 所列。

表1 飼草原料的營養(yǎng)成分Table 1 Nutritional composition of forage material%

表2 飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 2 Composition and nutrient of diet for fistulate sheep (DM basis)

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用單因素完全隨機設(shè)計，將玉米秸稈黃貯和甜菜塊根65 ℃烘干后，通過高速粉碎機(XFB-200)粉碎，過0.45 mm 篩，以100 ∶ 0 (T1)、80 ∶ 20 (T2)、60 ∶ 40 (T3)、50 ∶ 50 (T4)、40 ∶ 60 (T5)、20 ∶ 80、0 ∶ 100(T6)的比例進行組合，每個組合4 個重復。同一批次中設(shè)定空白，作為產(chǎn)氣量校正。不同比例混合后的營養(yǎng)成分如表3 所列。

表3 不同比例混合后的營養(yǎng)成分Table 3 Nutritional composition of the mixture in different proportions%

1.3 體外發(fā)酵及樣品采集

瘤胃液采集及測定均參照周瑞等[9]方法進行，體外產(chǎn)氣裝置采用ANKOM RFS (美國ANKOM Technology Corporation)全自動記錄裝置氣體測量系統(tǒng)，瘤胃緩沖液按Menke 等[10]方法配制。產(chǎn)氣測定時分別統(tǒng)計發(fā)酵時間點(2、4、8、12、12、24 和48 h)的產(chǎn)氣壓力。48 h 后在冰水浴中終止發(fā)酵，收集發(fā)酵液測定發(fā)酵參數(shù)，收集發(fā)酵殘渣測定養(yǎng)分含量。

1.4 測定指標及測定方法

1.4.1 養(yǎng)分測定

干物質(zhì)(dry matter，DM)、粗蛋白(crude protein，CP)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)和中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)參照《飼料分析及飼養(yǎng)質(zhì)量檢測技術(shù)》[8]測定，水溶性碳水化合物(WSC)含量測定采用蒽酮比色法[11]。干物質(zhì)降解率(dry matter degradability，DMD)、中性洗滌纖維降解率(neutral detergent fiber degradability，NDFD)、酸性洗滌纖維降解率(acid detergent fiber degradability，ADFD)由下列公式計算得出。

DMD = (飼糧干物質(zhì)含量 - 殘渣中干物質(zhì)含量)/飼糧干物質(zhì)含量；

ADFD = (飼糧酸性洗滌纖維含量 - 殘渣酸性洗滌纖維含量)/飼糧酸性洗滌纖維含量；

ADFD = (飼糧中性洗滌纖維含量 - 殘渣中性洗滌纖維含量)/飼糧中性洗滌纖維含量。

1.4.2 發(fā)酵參數(shù)及總產(chǎn)氣量測定

發(fā)酵液pH 用pH 計(HAN-NA)測定；NH3-N 濃度使用苯酚–次氯酸鈉比色法測定[12]；微生物蛋白(microbial protein，MCP)采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定；揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)采用氣相色譜儀(日本島津GC-2010 Plus)測定[13]，色譜柱為AT-FFAP 毛細管色譜柱，進樣量為1 μL，分流比為30 ∶ 1，采用程序升溫共16 min，初始溫度為100 ℃，保留2 min，升溫速率6 ℃·min-1，到130 ℃保持1 min，再以10 ℃·min-1的升溫速率，到190 ℃保持2 min，檢測器溫度230 ℃。產(chǎn)氣量(Total gas production)由ANKOM RFS 氣體測量系統(tǒng)記錄的氣體壓力來計算。

式中：Vx為產(chǎn)氣總體積(mL)；Vj為發(fā)酵瓶頂部空間體積(mL)；Ppsi為氣體測量系統(tǒng)自動記錄的壓力(kPa)。

1.4.3 飼草組合效應(yīng)的估算

單項組合效應(yīng)指數(shù)(single-factor associative effects index, SFAEI)和多項組合效應(yīng)綜合指數(shù) (multiple-factors associative effects index, MFAEI)計算公式如下：

式中：實測值為實際測定值(發(fā)酵參數(shù)、揮發(fā)性脂肪酸、養(yǎng)分降解率、總產(chǎn)氣量)；加權(quán)估算值 = 玉米秸稈黃貯實測值 × 玉米秸稈黃貯百分比(%) + 甜菜塊根實測值 × 甜菜塊根百分比(%)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 19.0 軟件進行單因素方差分析(oneway ANOVA)，用LSD 進行多重比較。以P＜ 0.05 作為差異顯著的判斷標準。

2 結(jié)果

2.1 玉米秸稈黃貯與甜菜塊根組合對體外養(yǎng)分降解率的影響

玉米秸稈黃貯與甜菜塊根組合對體外養(yǎng)分降解率的影響結(jié)果(表4)顯示，隨著甜菜塊根比例的增加，體外養(yǎng)分降解率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。T3、T4組DMD 顯著高于T1、T2、T6、T7(P＜ 0.001)；T3組NDFD 顯著高于其他組(P= 0.004)；T3、T4、T5組ADFD 顯著高于其他組(P= 0.016)。

表4 玉米秸稈黃貯與甜菜塊根組合對體外養(yǎng)分降解率的影響Table 4 Effect of ratios of corn straw silage to beet root on nutrition degradability in vitro%

2.2 玉米秸稈黃貯與甜菜塊根組合對體外總產(chǎn)氣量的影響

玉米秸稈黃貯與甜菜塊根組合對體外總產(chǎn)氣量的影響結(jié)果(表5)顯示，隨著發(fā)酵時間的延長，總產(chǎn)氣量逐漸升高，而隨著甜菜塊根比例的增加，在發(fā)酵2～12 h，總產(chǎn)氣量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在發(fā)酵24～48 h，總產(chǎn)氣量(GP)呈現(xiàn)先升高后降低再升高再降低的波動趨勢。時間對總產(chǎn)氣量有顯著效應(yīng)(P＜ 0.001)，且時間和處理互作效應(yīng)顯著(P= 0.006)。發(fā)酵2 h，T3組總產(chǎn)氣量最高(31.60 mL·g-1)，T1組總產(chǎn)氣量最低(23.89 mL·g-1)，T3、T4組總產(chǎn)氣量顯著高于T1、T2、T7組(P= 0.031)，發(fā)酵4、8、12 h，T3組總產(chǎn)氣量均最高(52.13、79.49、101.31 mL·g-1)，T7組總產(chǎn)氣量均最低(39.73、57.52、82.40 mL·g-1)，T3組總產(chǎn)氣量顯著高于T1、T6、T7組(P＜ 0.004)，發(fā)酵24、48 h，T4組總產(chǎn)氣量均最高(132.5、146.53 mL·g-1)，T7組總產(chǎn)氣量均最低(113.74、119.85 mL·g-1)，T4組總產(chǎn)氣量均顯著高于T6、T7組(P＜ 0.008)。

表5 玉米秸稈黃貯與甜菜塊根組合對體外總產(chǎn)氣量的影響Table 5 Effect of ratios of corn straw silage to beet root on total gas production in vitro mL·g-1

2.3 玉米秸稈黃貯與甜菜塊根組合對體外發(fā)酵參數(shù)的影響

玉米秸稈黃貯與甜菜塊根組合對體外發(fā)酵參數(shù)的影響結(jié)果(表6)顯示，隨著甜菜塊根比例的增加，pH 逐漸降低， T1組pH 顯著高于其他組(P＜0.001)；T3、T6組NH3-N 濃度顯著低于其他組(P=0.003)；T3組MCP 濃度顯著高于T1、T2、T6、T7(P＜0.001)。揮發(fā)性脂肪酸總體呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，T3組總揮發(fā)性脂肪酸(TVFAs)、乙酸濃度顯著高于其他組(P＜ 0.05)；T3組丙酸、丁酸濃度以及乙酸/丙酸值顯著高于T1、T2、T6、T7組(P＜ 0.05)；T3組異丁酸、戊酸、異戊酸濃度均顯著高于T6、T7組(P＜ 0.02)。

表6 玉米秸稈黃貯與甜菜塊根組合對體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Table 6 Effect of ratios of corn straw silage to beet root on fermentation parameter in vitro

2.4 玉米秸稈黃貯與甜菜塊根體外發(fā)酵組合效應(yīng)

玉米秸稈黃貯與甜菜塊根組合效應(yīng)結(jié)果(表7)顯示，從單項組合效應(yīng)來看，不同比例組合后，NH3-N濃度為負組合效應(yīng)，T3組MCP、TVFAs、乙酸/丙酸以及各揮發(fā)酸均為最大正組合效應(yīng)，T2、T4組丙酸為負組合效應(yīng)，T3組DMD、NDFD、ADFD 均為最大正組合效應(yīng)，T4組總產(chǎn)氣量為最大正組合效應(yīng)；從多項組合效應(yīng)綜合指數(shù)來看，不同比例組合后，均為正組合效應(yīng)，且T3組綜合指數(shù)最大，T6組綜合指數(shù)最小。

表7 玉米秸稈黃貯與甜菜塊根體外發(fā)酵組合效應(yīng)Table 7 Associative effects of ratios of corn straw silage to beet root on fermentation in vitro

3 討論

3.1 玉米秸稈黃貯與甜菜塊根組合對體外養(yǎng)分降解率的影響

體外養(yǎng)分降解率反映其被動物消化利用的難易程度，同時也反映飼料在發(fā)酵體系中被微生物的降解效果[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，體外瘤胃養(yǎng)分降解率隨玉米秸稈黃貯與甜菜塊根比例的變化而改變。Zhang 等[15]研究表明，玉米秸稈和飼用甜高粱(Sorghum dochna)在不同比例青貯時其體外干物質(zhì)降解率和有機物降解率存在顯著差異，Ponce 等[16]研究表明日糧中玉米秸稈青貯比例的高低顯著影響體外發(fā)酵營養(yǎng)物質(zhì)消化率。隨著甜菜塊根比例的增加，體外瘤胃養(yǎng)分降解率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。吳征敏等[17]在皇竹草(Pennisetum sinese)與噴漿玉米皮組合效應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著組合中噴漿玉米皮比例的增加，山羊體外瘤胃干物質(zhì)降解率顯著升高。本研究表明，組合后的體外瘤胃養(yǎng)分降解率均高于單一粗飼料組，這可能是因為粗飼料自身養(yǎng)分含量不同，導致瘤胃內(nèi)降解特性不同造成的[18-19]，另外秸稈中不同結(jié)構(gòu)的碳水化合物類型也會影響其干物質(zhì)降解率[20]。因此，隨著甜菜塊根比例的增加，瘤胃體外DM、NDF、ADF 降解率先升高后降低，這可能是由于甜菜塊根中的可消化有機物及非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量隨甜菜塊根的比例逐漸升高造成的[21]。甜菜塊根比例的增加，使得組合后粗飼料的NDF、ADF 含量降低，CP 含量升高，這不僅更有利于微生物對粗飼料養(yǎng)分的降解，而且為瘤胃微生物提供充足的能量來源和氮源[9]。因此，在甜菜添加的一定范圍內(nèi)，隨著甜菜添加比例的增大，組合飼料中能氮比例更加協(xié)調(diào)，瘤胃微生物對飼料能氮的循環(huán)利用更高，同時微生物活性增強，養(yǎng)分降解率逐漸升高。但是粗飼料中養(yǎng)分降解率的變化并不是隨著甜菜塊根比例的增加呈線性增加趨勢，當甜菜塊根比例大于50%時，養(yǎng)分降解率又逐漸降低，這可能是由于甜菜塊根過多，導致非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量過高，其在瘤胃中迅速發(fā)酵而改變瘤胃發(fā)酵模式，破壞瘤胃內(nèi)環(huán)境，養(yǎng)分降解率相應(yīng)降低。

3.2 玉米秸稈黃貯與甜菜塊根組合對體外總產(chǎn)氣量的影響

總產(chǎn)氣量是飼料在瘤胃中發(fā)酵程度的直觀表現(xiàn)[22]。飼料在瘤胃中發(fā)酵程度越大則產(chǎn)氣量越大[23]。本研究中，不同比例組合后GP 隨發(fā)酵時間的增加而增加，這是由于發(fā)酵期，GP 不斷累積造成的，同時也說明體外發(fā)酵48 h，微生物對底物仍然有降解作用。當甜菜塊根比例為40%時，GP 最高，此時瘤胃發(fā)酵程度最大。當甜菜塊根比例大于40%時，由于組合飼料非結(jié)構(gòu)性碳水化合物過高，發(fā)酵受到抑制，產(chǎn)氣量逐漸降低。這與本研究中揮發(fā)酸濃度先升高后降低一致。

3.3 玉米秸稈黃貯與甜菜塊根組合對體外發(fā)酵參數(shù)的影響

pH 是瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的反映指標，主要受飼料、唾液和發(fā)酵產(chǎn)物的影響[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨甜菜塊根比例的增加，瘤胃pH 逐漸降低。瘤胃pH 的適宜范圍在6.2～7.0，當pH 過低時，會抑制瘤胃內(nèi)纖維降解菌的活性[25]。當甜菜塊根添加量小于50%時，pH 6.6～6.2，說明瘤胃內(nèi)均可正常發(fā)酵；當甜菜塊根添加量大于50%時，pH 5.7～6.0，因此，甜菜塊根添加過量會導致pH 降低，抑制飼糧中纖維的降解，養(yǎng)分降解率下降[26]。

NH3-N 濃度反映了瘤胃微生物對氨的利用程度[27]。適宜的NH3-N 濃度有利于增強瘤胃微生物活性，而過高會造成養(yǎng)分浪費，過低會降低瘤胃微生物活性[28]。NH3-N 濃度降低意味著瘤胃中蛋白降解率的降低或者瘤胃微生物對NH3-N 利用率的提高[29]。本研究中當甜菜塊根比例為40%時，NH3-N 濃度最低，此時MCP 濃度最高。甜菜塊根比例小于40%時，甜菜塊根比例的增加導致組合飼料中CP 也相應(yīng)升高，同時為微生物提供了充足的氮源，微生物活性增強，微生物利用氨態(tài)氮合成自身蛋白的速度大于發(fā)酵底物產(chǎn)生氨態(tài)氮的速度，導致MCP 濃度升高，NH3-N 濃度降低。

飼糧中的碳水化合物通過瘤胃微生物的代謝作用，最終形成揮發(fā)性脂肪酸，是反芻動物主要的能量來源以及合成乳脂和體脂的重要原料[30]。本研究中當甜菜塊根比例為40%時，TVFAs 和各揮發(fā)性脂肪酸濃度最高，當甜菜塊根比例大于40%時，其濃度又呈現(xiàn)降低趨勢，這主要與飼料中NSC/SC 有關(guān)，瘤胃中日糧的發(fā)酵產(chǎn)物及揮發(fā)酸濃度主要受日糧組成成分的影響[31]。飼糧組成中SC 含量較高時，瘤胃中的纖維降解菌活性增強，主要以乙酸發(fā)酵為主，飼糧組成中NSC 含量較高時，淀粉降解菌活性增強，同時抑制了纖維降解菌活性，主要以丙酸發(fā)酵為主，瘤胃液pH 較低。但是NSC 含量過高時，導致瘤胃內(nèi)環(huán)境破壞，微生物發(fā)酵受到抑制，發(fā)酵產(chǎn)物濃度降低。

3.4 玉米秸稈黃貯與甜菜塊根組合效應(yīng)的綜合評估

飼料組合效應(yīng)是指不同來源的飼料通過營養(yǎng)互補后表現(xiàn)出來的整體效應(yīng)。科學合理的飼料組合，可以最大限度地提高飼料的利用率[32]。因此，在選擇合理的飼料組合時，要綜合考慮消化率、整體發(fā)酵效果好的組合，主要對GP、NH3-N、VFA、MCP等多項指標進行綜合評價，得出最優(yōu)飼料組合[33-34]。本研究中，多項組合效應(yīng)值結(jié)果為T3＞ T5＞ T4＞ T2＞T6，這也表明產(chǎn)生了不同的組合效應(yīng)。當甜菜塊根占組合中的40%時，產(chǎn)生了最大組合效應(yīng)，說明玉米秸稈黃貯和甜菜塊根組合比例為60 ∶ 40 時，整體發(fā)酵水平和消化利用率達到最大，為本研究的最優(yōu)組合。

4 結(jié)論

1)當甜菜塊根比例小于40%時，隨著甜菜塊根比例的增加，體外瘤胃養(yǎng)分降解率、TVFAs、產(chǎn)氣量逐漸升高，促進了瘤胃發(fā)酵。

2)多項組合效應(yīng)指數(shù)來看，結(jié)果為T3＞ T5＞ T4＞T2＞ T6，因此玉米秸稈黃貯與甜菜塊根的最優(yōu)組合為60 ∶ 40。