豬流感的實(shí)驗(yàn)室診斷研究進(jìn)展

高原

（遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，沈陽 110000）

豬流感（SI）是一種具有高度傳染性的重要呼吸道疾病，主要病原體是H1N1、H3N2 和H1N2。SI 感染的診斷目前是基于臨床體征觀察，經(jīng)鑒定確認(rèn)的感染源（PCR，分離）。然而，感染比疾病更頻繁。感染豬流感病毒（SIV）通常是亞臨床的，典型的癥狀通常只出現(xiàn)在25%～30%的豬群中。盡管應(yīng)用程序的反應(yīng)已經(jīng)被記錄在一系列臨床感染中，但應(yīng)用程序在亞臨床感染識(shí)別中的潛在用途仍有待確定。亞臨床感染豬在豬-豬疾病傳播中起著重要作用。此外，這些動(dòng)物不僅對(duì)未感染的動(dòng)物，而且對(duì)農(nóng)民或屠宰場的工人都是一種危害。

1 血清學(xué)診斷

血清學(xué)診斷是一種用于檢測血清中豬流感病毒抗體的常規(guī)傳統(tǒng)方法，由于同屬A 型流感病毒，其病毒皆有血凝特性，主要方法過程與禽流感血清學(xué)檢測基本相同，包括HA-HI 試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、瓊脂凝膠擴(kuò)散、中和試驗(yàn)、神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)等。其中HA-HI 試驗(yàn)與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)由于其操作相對(duì)簡單省時(shí)，經(jīng)常用于大量樣品的實(shí)驗(yàn)室檢測。

1.1 血凝- 血凝抑制試驗(yàn)HA- HI

SI 病毒表面由HA 基因編碼的HA蛋白具有識(shí)別和吸附紅細(xì)胞表面受體的特定結(jié)構(gòu)，SI 病毒抗體能與該結(jié)構(gòu)結(jié)合抑制其與受體紅細(xì)胞結(jié)合，由此而產(chǎn)生這種針對(duì)流感病毒凝血特性的SI 病毒檢測方法。研究表明，HA-HI 試驗(yàn)對(duì)SIV 的分型是可行的，但由于流感病毒的變異性，要最終確定病毒亞型仍需要進(jìn)一步的分型試驗(yàn)。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是目前應(yīng)用范圍相對(duì)最廣的SIV 檢測手段，已經(jīng)建立如雙抗體夾心，間接法等多種試驗(yàn)方法。實(shí)踐表明，該方法是一種應(yīng)用于群體檢測SIV 的有效檢測方法，利用酶來對(duì)抗原抗體進(jìn)行標(biāo)記，通過顯色反應(yīng)來判斷結(jié)果。具有敏感性高，可檢測抗原和抗體，可標(biāo)準(zhǔn)化檢測，結(jié)果簡單易于分析的特點(diǎn)。

1.3 神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)（NI）

NI 試驗(yàn)主要被用來對(duì)SIV 表面NA蛋白亞型進(jìn)行分型的檢測，與HA-HI 試驗(yàn)一同可最終鑒定出被檢SIV 病毒的亞型。1983 年常量NI 法得以改進(jìn)，建立了微量NI 法，該方法已被美國國家獸醫(yī)研究所定為確定鑒別NA 抗體的常規(guī)方法。

1.4 中和試驗(yàn)（SN）

通過中和試驗(yàn)鑒定或者滴定豬流感病毒時(shí)，通常選用對(duì)流感病毒相對(duì)敏感的組織培養(yǎng)細(xì)胞或雞胚。中和試驗(yàn)的特異性和敏感性都相對(duì)較強(qiáng)，與病毒表面抗原相配時(shí)，特別是已吸附宿主細(xì)胞的病毒，才會(huì)有明顯的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象結(jié)果產(chǎn)生。由于試驗(yàn)時(shí)間較長，操作繁雜等原因，并未被大量應(yīng)用到實(shí)驗(yàn)室SIV 檢測中。

1.5 瓊脂糖凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)（AGID）

AGID 是一種在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行的SIV 抗原抗體沉淀反應(yīng)，具有方便快捷并且不易發(fā)生變異的特點(diǎn)。試驗(yàn)所用的抗原或抗體必須經(jīng)過純化方可使用，否則結(jié)果易出現(xiàn)假陽性。該試驗(yàn)敏感性相對(duì)較差，經(jīng)過改進(jìn)后的免疫雙擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)對(duì)此不足加以調(diào)整，并相比之前的AGID 試驗(yàn)更加便捷省時(shí)。國內(nèi)已建立了相應(yīng)的診斷技術(shù)及試劑盒。

2 分子生物學(xué)診斷

血清學(xué)方法由于其操作復(fù)雜繁瑣，用時(shí)較長，對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境因素敏感導(dǎo)致結(jié)果的重復(fù)性無法保證，但此類傳統(tǒng)方法在初步分離鑒定SIV 病毒上還是發(fā)揮著一定作用。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，利用分子生物學(xué)手段快速診斷SIV已經(jīng)成為了最為重要的診斷途徑。

2.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

PCR 已廣泛應(yīng)用于各類實(shí)驗(yàn)室的流感病毒診斷當(dāng)中，其檢測快速，結(jié)果準(zhǔn)確，檢測敏感度可達(dá)pg 標(biāo)準(zhǔn)。該方法是一種DNA 體外擴(kuò)增技術(shù)，最早于1985 年由Maliss 建立，且于1987 年實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)，此項(xiàng)技術(shù)的建立是分子生物學(xué)史上的重要里程碑，加快了分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展腳步。臨床檢測中，待檢病原通常是病毒RNA 分子，因此人們通過反轉(zhuǎn)錄方式先將其翻譯成cDNA，也就是RT-PCR 技術(shù)。國內(nèi)PCR與RT-PCR 的檢測技術(shù)與試劑盒的建立也已經(jīng)發(fā)展相對(duì)成熟，檢測見過較為準(zhǔn)確穩(wěn)定。

2.2 熒光定量PCR 反應(yīng)

熒光定量PCR 反應(yīng)是一種在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上逐漸發(fā)展起來的PCR定量反應(yīng)。將熒光團(tuán)加入到反應(yīng)體系當(dāng)中，通過螢光信號(hào)的積累對(duì)整個(gè)PCR 反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測。它有效地解決了常規(guī)PCR 產(chǎn)物污染問題，可以對(duì)其實(shí)模板準(zhǔn)確定量，且自動(dòng)化程度相對(duì)較高，準(zhǔn)確性更強(qiáng)，并具有實(shí)時(shí)性。不可否認(rèn)，其成本較普通PCR 高出許多，但由于其諸多優(yōu)點(diǎn)，目前仍較為廣泛的應(yīng)用于醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究領(lǐng)域。另外，該方法還可以同時(shí)進(jìn)行多種螢光信號(hào)的識(shí)別，因此可同時(shí)檢測多種疾病，為疾病的全面快速診斷提供重要的依靠。經(jīng)臨床實(shí)踐表明，該方法的建立奠定了豬流感病毒早期診斷，定量分析的基礎(chǔ)。

2.3 依賴核酸序列的擴(kuò)增法（NASBA）

依賴核酸序列的擴(kuò)增法是一種擴(kuò)增RNA 分子的新技術(shù)，一對(duì)引物作為引導(dǎo)，作連續(xù)均勻速度的恒溫體外酶促反應(yīng)，可在2 小時(shí)左右擴(kuò)增模板RNA 至109 倍，與傳統(tǒng)PCR 相比更加高效穩(wěn)定，準(zhǔn)確率高。目前國內(nèi)尚無NASBA 用于豬流感病毒檢測的相關(guān)研究報(bào)道，但由于其準(zhǔn)確高效的特性，對(duì)于其應(yīng)用于A 型流感病毒的檢測仍有著相當(dāng)廣泛的前景。

2.4 基因芯片檢測技術(shù)

基因芯片檢測法是指在支持物上固定好大量的探針分子后，同標(biāo)記好的樣品雜交，以雜交之后信號(hào)強(qiáng)弱來獲得待檢測分子序列等相關(guān)信息。該技術(shù)污染少，高通量化，可同時(shí)進(jìn)行多組基因的檢測，因而較為廣泛的應(yīng)用于基因表達(dá)檢測，基因突變型檢測以及疾病診斷與檢測等多項(xiàng)研究中。國內(nèi)對(duì)于基因芯片引物的設(shè)計(jì)方面，不同檢測方法的建立已經(jīng)有十分豐富的成果，對(duì)于SI 防控也有著十分積極的意義。