超高效液相色譜-四極桿/飛行時間質譜檢測豬肉和牛肉中30 種食源性興奮劑類藥物殘留

馬俊美，范素芳，李 強，何亮娜，范力欣，曹梅榮，孫 磊，王 東，孫文毅

（河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊 050091）

在現(xiàn)代畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，一些不法分子長期大量使用各種蛋白同化制劑和人工合成激素類藥物，因此動物源性食品中的藥物殘留成為了食源性興奮劑的來源。利尿劑可促進腎臟排尿功能，具有快速減輕體質量和稀釋尿液的功效，可幫助運動員快速排泄其他禁用物質，從而達到掩蔽劑的效果。世界反興奮劑機構發(fā)布的《2019年禁用清單國際標準》[1]已于2019年1月1日起正式生效，其明確規(guī)定蛋白同化制劑、利尿劑和糖皮質激素類等興奮劑為禁用物質，建立食源性興奮劑的檢測方法不僅為重大賽事的食品安全保駕護航，同時也幫助我國加工和出口企業(yè)規(guī)避貿易壁壘的不利風險，從而減少經(jīng)濟損失。

食源性興奮劑目前常用的檢測方法包括：酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[2]、氣相色譜（gas chromatography，GC）法[3-5]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[6]、高效液相色譜-串聯(lián)質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法[7-9]等。ELISA法由于抗體理化性質不穩(wěn)定、容易出現(xiàn)假陽性；GC法檢測涉及衍生操作，因此步驟較為繁瑣、適用性窄；HPLC法僅依靠保留時間定性、且一次進樣分析化合物數(shù)目有限；HPLC-MS/MS法已廣泛應用于獸藥殘留的檢測[10-12]，目前我國現(xiàn)行有效的食源性興奮劑檢測標準方法大多采用HPLC-MS/MS法[13-15]，雖然靈敏度高，但分辨率和質量數(shù)準確度較低[16-18]、不適用于高通量篩選分析的要求、基質干擾嚴重、化合物裂解碎片信息量少[19]，隨著質譜技術的發(fā)展，具有能夠獲得化合物一級精確質量數(shù)、豐富的碎片離子和同位素比率信息、分辨率高、采集速率快等優(yōu)點的Q-TOF/MS法越來越受到人們的關注[20-22]。

目前有關食源性興奮劑的檢測研究報道大多限于常見的克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺等β-受體激動劑的研究[23-24]。蛋白同化制劑、利尿劑和糖皮質激素類興奮劑的研究報道較少，其存在前處理繁瑣、靈敏度不高、檢測藥物單一、重復性不好等問題[25]，難以滿足重大賽事和應急過程中違禁藥物檢測的時效性要求，因此建立基于高分辨質譜的食源性興奮劑類藥物的快速檢測技術顯得尤為必要。本實驗采用超高效液相色譜-四極桿/飛行時間質譜（ultra-high performance liquid chromatographyquadrupole-time of flight mass spectrometry，UPLC-QTOF/MS）的檢測方法，建立快速篩查和確證豬肉和牛肉中16 種蛋白同化制劑、8 種利尿劑、6 種糖皮質激素的工作流程及30 種食源性興奮劑的質譜數(shù)據(jù)庫，以期在準確定量、提高定性可信度的同時，能夠降低對標準品的依賴程度，由此保證檢測工作的可信度，為檢測動物源性食品中興奮劑的多種殘留物質提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉和牛肉基質均購自河北石家莊農(nóng)貿市場。

康力龍、17α-甲基睪丸酮、睪丸酮、勃地酮、美雄酮、丙酸睪酮、丙酸諾龍、苯丙酸諾龍、氨苯蝶啶、乙酰唑胺、呋塞米、氫氯噻嗪、氯噻嗪、氯噻酮、4-氨基-6-氯-1,3-苯二磺酰胺、芐氟噻嗪 德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；潑尼松、潑尼松龍、甲基潑尼松、地塞米松、倍氯米松、氫化可的松群勃龍、諾龍、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮（均為分析純）北京曼哈格生物科技有限公司。

乙腈、甲醇、叔丁基甲醚、乙酸乙酯、無水乙醚美國Fisher公司；超純水（25 ℃、電阻率為18.2 MΩ·cm） 美國Millipore公司；β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶（含β-葡萄糖醛苷酶111 000 U/mL、芳基硫酸酯酶1 079 U/mL）、甲酸（色譜純） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

UPLC-Triple TOFTM5600+超高效液相色譜-四極桿/飛行時間質譜儀 美國SCIEX公司；CR22N高速冷凍離心機日本Hitachi公司；Elmasonic P300H超聲波清洗器 德國Elma公司；SHA-B恒溫水浴振蕩搖床 常州潤華電器有限公司；Vortex Genius 3旋渦混合器 德國IKA公司；有機尼龍微孔濾膜（0.22 μm） 天津艾杰爾公司；Analyst?（Version 1.6，AB SCIEX）、Peak View（Version 2.1，AB SCIEX）、MultiQuant（Version 2.1，AB SCIEX）軟件 上海SCIEX分析儀器貿易有限公司；Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱、Waters XBridge BEH C18柱、Waters Oasis PRiME HLB固相萃取柱（6 mL/500 mg）美國Waters公司；Thermo Accucore aQ C18色譜柱、Hypersil Gold C18色譜柱 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

稱取適量乙酰唑胺、氨苯蝶啶、呋塞米、氫氯噻嗪、氯噻嗪、氯噻酮、4-氨基-6-氯-1,3-苯二磺酰胺、芐氟噻嗪的標準品于100 mL容量瓶中，氨苯喋啶需先用甲酸溶解，后用甲醇溶解并定容至刻度，得到質量濃度為100 μg/mL的混合標準儲備溶液，于－20 ℃保存，有效期6 個月。分別稱取適量康力龍、17α-甲基睪丸酮、睪丸酮、勃地酮、美雄酮、丙酸睪酮、丙酸諾龍、苯丙酸諾龍、潑尼松、潑尼松龍、甲基潑尼松、地塞米松、倍氯米松、氫化可的松標準品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到質量濃度為1 mg/mL的標準儲備溶液，于－20 ℃保存，有效期6 個月。

取適量的乙酰唑胺、氨苯蝶啶、呋塞米、氫氯噻嗪、氯噻嗪、氯噻酮、4-氨基-6-氯-1,3-苯二磺酰胺、芐氟噻嗪混合標準儲備溶液和康力龍、17α-甲基睪丸酮、睪丸酮、勃地酮、美雄酮、丙酸睪酮、丙酸諾龍、苯丙酸諾龍、潑尼松、潑尼松龍、甲基潑尼松、地塞米松、倍氯米松、氫化可的松標準儲備溶液和諾龍、群勃龍、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮標準物質溶液，用甲醇稀釋成10 μg/mL的30 種興奮劑混合標準中間溶液，于－4 ℃保存，有效期1 個月。

1.3.2 樣品前處理

稱取5 g（精確至0.001 g）試樣置于50 mL聚丙烯離心管中，加入20 mL 0.2 mol/L乙酸銨緩沖溶液，再加入β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶50 μL，旋渦混勻1 min，于37 ℃振蕩酶解16 h。取出冷卻至室溫，加入20 mL 體積分數(shù)1.0%甲酸-乙腈溶液，超聲提取10 min后，加入8 g氯化鈉，旋渦混勻1 min，于室溫、9 000 r/min離心5 min，取上清液以待凈化。

吸取待凈化液11 mL，流速不高于1.0 mL/min通過PRiME HLB固相萃取柱，收集10 mL流出液，于40 ℃氮吹至近干，加入1 mL體積分數(shù)50%乙腈溶液，旋渦混勻。復溶液經(jīng)有機尼龍濾膜過濾以待下一步的檢測。

1.3.3 色譜條件

Waters XBridge BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）；流動相A為含2 mmol/L甲酸銨的體積分數(shù)0.01%甲酸溶液，B為含2 mmol/L甲酸銨的0.01%甲酸-甲醇溶液；流速為0.3 mL/min；進樣量為5 μL。梯度洗脫程序：0.0～1.0 min，95% A、5% B；1.0～1.6 min，95%～80% A、5%～20% B；1.6～2.5 min，80%～50% A、20%～50% B；2.5～10.0 min，50%～5% A、50%～95% B；10.0～15.0 min，5% A、95% B；15.0～15.1 min，5%～95% A、95%～5% B；15.1～20.0 min，95% A、5% B。

1.3.4 質譜條件

離子源參數(shù)：電噴霧電離，正/負離子模式（positive dependent acquisition electron spray ionization/negative electron spray ionization，ESI+/ESI－）；噴霧電壓5 500 V；離子源溫度400 ℃；氣簾氣壓力35 psi；霧化氣壓力50 psi；輔助氣壓力55 psi。一級質譜的飛行時間質譜（time of flight-tandem mass spectrometry，TOF-MS）參數(shù)：掃描范圍50～1 000 Da；采樣時間20 min；累計時間0.15 s；去簇電壓80 V。二級質譜信息依賴采集-串聯(lián)質譜（information dependent acquisition-tandem mass spectrometry，IDA-MS/MS）參數(shù)：累計時間0.05 s；高靈敏度模式；響應值的閾值100 cps；排除同位素范圍4 Da；離子排除邏輯Never；去簇電壓80 V；碰撞電壓40 V；碰撞能量動態(tài)變量20 eV。每次實驗前，通過色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)（chromatography data system，CDS）對儀器進行質譜模式和聯(lián)用質譜模式的質量精度校正，實驗過程中，每運行3 針樣品，自動進行一次質量精度校正。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 精確質量數(shù)數(shù)據(jù)庫的建立

在1.3.3、1.3.4節(jié)的儀器條件，通過分析興奮劑標準物溶液獲得每個化合物的保留時間、一級精確質量數(shù)、同位素分布和離子化方式等信息，將30 種興奮劑名稱、分子式、保留時間和離子化方式等編入篩查列表中，結果見表1。

表1 30 種興奮劑的MRM參數(shù)Table 1 MRM parameters for 30 stimulants

1.4.2 二級碎片離子譜圖庫的建立

實驗通過1 個高分辨母離子和二級譜圖的匹配度、母離子與碎片離子之間的質量數(shù)偏差均小于等于5×10－6的標準進行確證。在質譜的子離子掃描模式下，目標物在保留時間窗口的響應值超過閾值后，自動分別采集在20、40、60 eV碰撞能量的數(shù)據(jù)并疊加二級碎片譜圖，由此建立該化合物的二級譜圖庫，導入Analyst軟件的數(shù)據(jù)庫Library模塊中，進而創(chuàng)建30 種興奮劑的二級譜圖庫。

2 結果與分析

2.1 前處理條件的優(yōu)化

部分興奮劑在動物體內以結合態(tài)存在，酶解可促進興奮劑水解成游離態(tài)，從而提高樣品中興奮劑的提取效率。蛋白同化制劑、利尿劑和糖皮質激素屬于極性較弱、難溶于水、易溶于極性有機溶劑的脂溶性化合物，據(jù)文獻報道[26-27]，其常用的提取溶劑為無水乙醚、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、甲醇、乙腈等，實驗考察了上述5 種試劑對30 種興奮劑的提取效果。圖1表明：無水乙醚、乙酸乙酯和叔丁基甲醚作為提取溶劑的回收率分別低至37.6%～88.7%、47.6%～88.0%、30.5%～89.0%，提取效果均不及甲醇和乙腈。甲醇作為提取溶劑的提取溶液渾濁。乙腈作為提取溶劑的回收率高達76.0%～96.2%的同時可有效去除豬肉和牛肉基質中的蛋白質，降低了提取液中基質的干擾，因此選用乙腈作為提取溶劑。在此基礎上，實驗考察了乙腈和體積分數(shù)分別為0.5%、1.0%、2.0%甲酸-乙腈溶液作為提取溶劑的效果。實驗結果表明：1.0%甲酸-乙腈溶液作為提取溶劑的效果最好，因此選擇1.0%甲酸-乙腈溶液為提取溶劑。

圖1 不同溶劑對30 種興奮劑回收率的影響Fig.1 Effect of different solvents on the recoveries of 30 stimulants

豬肉和牛肉樣品中存在大量的脂肪和蛋白質等物質，因此會干擾目標化合物的分析、損耗色譜柱壽命進而增加儀器系統(tǒng)的維護成本和難度。實驗采用PRiME HLB新型固相萃取小柱，不需要活化、平衡和洗脫等步驟，直接將豬肉和牛肉基質中的磷脂等非極性干擾物吸附在填料內，將待測物過濾到收集瓶中，在不影響回收率的前提下，既簡化了操作步驟，還節(jié)省了前處理時間，適用于檢測大批量豬肉和牛肉樣品中興奮劑。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

實驗考察30 種待測物在Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100.0 mm，1.8 μm）、Thermo Accucore aQ C18色譜柱（2.1 mm×100.0 mm，2.6 μm）、Hypersil Gold C18色譜柱（2.1 mm×100.0 mm，1.9 μm）和Waters XBridge BEH C18色譜柱（2.1 mm×100.0 mm，2.5 μm）上的分離效果，實驗結果表明：采用Waters XBridge BEH C18色譜柱得到的待測物峰形最佳、尖銳對稱、且能將2 組同分異構體中第1組母離子m/z321.171的α-玉米赤霉醇與β-玉米赤霉醇、第2組母離子m/z319.155的α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇與玉米赤霉酮有效分離，因此選擇Waters XBridge BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）作為實驗選用的器材。

2.3 質譜參數(shù)的優(yōu)化

Triple TOFTM5600+儀器具有CDS自動校正輸液系統(tǒng)。利用DuoSprayTM離子源的參比噴霧輸入校正液，系統(tǒng)可進行自動校正。DuoSprayTM離子源有電噴霧離子源和大氣壓化學電離源共2 種，實驗選擇電噴霧離子源作為檢測離子源，大氣壓化學電離源作為校正離子源。通過自動校正系統(tǒng)可進行自動批校正，進而確保長時間內系統(tǒng)的準確質量數(shù)穩(wěn)定。

為獲得準確可靠的實驗數(shù)據(jù)，采用Triple TOFTM5600+儀器，利用該系統(tǒng)特有的數(shù)據(jù)依賴掃描（information dependent acquisition，IDA）功能建立了飛行時間質譜-數(shù)據(jù)依賴掃描（time of flight-information dependent acquisition-tandem mass spectrometry，TOF-MS-IDA-MS/MS）的實驗流程檢測目標物，一次進樣可得到一級母離子和二級碎片離子的高分辨率質譜圖，以及與之對應的定性、定量分析數(shù)據(jù)。利用該系統(tǒng)的動態(tài)背景扣除功能，極大地降低本底背景的二級質譜信號強度，提高樣品中低含量目標物的MS/MS信號。實驗通過優(yōu)化噴霧電壓、離子源溫度、氣簾氣、霧化氣、霧化氣、去簇電壓、碰撞能量、碰撞能量動態(tài)變量等參數(shù)，實現(xiàn)了所有目標化合物的有效分離和良好響應。碰撞能量動態(tài)變量是定性分析的重要參數(shù)，可以提高靈敏度并減少二級碎片離子信息的遺漏。實驗中，將碰撞能量動態(tài)變量設置為20 eV，能夠獲得碰撞能量動態(tài)變量分別為20、40、60 eV時的增強子離子掃描圖譜，從而獲取豐富的二級碎片離子信息。

與三重四極桿質譜的定量手段不同，實驗采用的Triple TOFTM5600+高分辨質譜是在TOF-MS-IDA-MS/MS的實驗流程下同時進行一級全掃描和依賴于數(shù)據(jù)的二級質譜掃描，以母離子作為定量離子簡化了質譜參數(shù)的優(yōu)化過程，且提高了實驗效率，因此更利于樣品的快速篩查和定量分析。實驗采用電噴霧電離和ESI+/ESI－模式，得到一級全掃描質譜圖后以各化合物的分子離子峰的理論精確質量數(shù)提取色譜圖，圖2為30 種興奮劑的提取離子色譜圖，可以根據(jù)保留時間對目標物進行初步定性。理論精確質量數(shù)與測量精確質量數(shù)的相對偏差越小，篩查結果的可信度越高。表1數(shù)據(jù)表明：30 種興奮劑的質量數(shù)偏差均小于5.0×10－6，符合歐盟2002/657/EC[28]增加的LC-MS目標準則，因此可以根據(jù)理論精確質量數(shù)對目標物進行確證[29]。根據(jù)歐盟2002/657/EC文件對質譜分析方法中需要4.0 個識別點作為鑒定點個數(shù)的規(guī)定，高分辨質譜中母離子的識別點為2.0 個、子離子的識別點為2.5 個，因此1 個母離子和1 個子離子可對目標物確證[30]。通過二級質譜掃描，能夠得到豐富的二級離子碎片信息，從而提高定性結果的準確性。

圖2 30 種興奮劑的提取離子色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatograms of 30 stimulants

2.4 方法的線性關系、檢出限（limits of detection，LOD）和定量限（limits of quantitation，LOQ）

按1.3.1節(jié)方法吸取30 種興奮劑混合標準中間溶液，并用乙腈配制標準系列溶液，以目標化合物的一級質量數(shù)提取離子峰面積為縱坐標，各組分的質量濃度（ng/mL）為橫坐標得到線性回歸方程，以3 倍和10 倍信噪比對應的空白樣品添加質量濃度作為LOD和LOQ。表2表明：30 種興奮劑在0.5～100.0 ng/mL質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數(shù)不低于0.998 0，LOD為0.1～2.0 μg/kg，LOQ為0.2～4.0 μg/kg。

表2 30 種興奮劑的線性關系、LODs和LOQsTable 2 Linear calibration curves, LODs and LOQs for 30 stimulants

續(xù)表2

2.5 加標回收率與相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）

表3 30 種興奮劑的回收率和RSD（n =6）Table 3 Recoveries and RSD for 30 stimulants (n= 6)

續(xù)表3

空白豬肉和牛肉基質中添加30 種興奮劑后進行加標回收率實驗，共添加3 個水平，每個水平重復6 次。表3表明：30 種興奮劑在豬肉基質中的加標回收率在77.99%～108.4%之間，RSD在0.51%～9.68%之間；在牛肉基質中的加標回收率在80.26%～109.2%之間，RSD在0.29%～9.53%之間。

2.6 實際樣品檢測結果

應用實驗建立的方法對市場采購的20 批次豬肉樣品進行檢測，采用精確質量數(shù)和保留時間的方式對樣品中興奮劑進行定性篩查，且結合二級特征碎片離子確證，均未檢出陽性樣品。符合GB/T 21981—2008《動物源產(chǎn)品中激素多殘留檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法》[31]、GB/T 21982—2008《動物源性食品中玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮殘留量檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法》[32]和SN/T 5167—2019《出口動物源食品中氫氯噻嗪等10 種利尿劑殘留量的測定 液相色譜-質譜/質譜法》[33]規(guī)定的測定結果。

3 結 論

本研究建立了基于PRiME HLB通過式固相萃取凈化的方式，采用UPLC-Triple TOFTM5600+液質聯(lián)用系統(tǒng)測定豬肉和牛肉中30 種興奮劑藥物殘留的方法，其前處理簡單快速，采用TOF-MS模式和IDA-MS/MS模式對目標物進行檢測。在TOF-MS模式，以目標物的保留時間、一級精確質量數(shù)、同位素分布和同位素豐度比定性，以準分子離子峰的峰面積定量；在IDA-MS/MS模式，通過相應碰撞能量而產(chǎn)生的二級離子碎片特征圖譜的確證方法避免了假陽性的出現(xiàn)，其靈敏度高、穩(wěn)定性好、極大地提高了檢測效率和準確度，因此能夠快速篩查和確證豬肉和牛肉中30 種興奮劑殘留，實驗為食源性興奮劑的風險監(jiān)測提供了一種有力的技術手段。