青島市5歲低齡兒童重度齲患者齦上菌斑微生物群落的宏基因組學(xué)研究

劉夢(mèng)佳 滕飛 公文 徐穎婕 叢蓓蓓 王萬春

美國(guó)兒童牙科學(xué)會(huì)將低齡兒童齲（early childhood caries，ECC）定義為72個(gè)月以下的兒童的任何1顆及1顆以上乳牙齲壞或因齲導(dǎo)致的牙齒缺失或充填。中國(guó)第四次口腔流行病學(xué)調(diào)查顯示5歲兒童患齲率為71.9%，比十年前上升了 5.9%［1］。ECC是最常見的兒童口腔疾病，嚴(yán)重影響兒童的身心健康［2－3］。因此，針對(duì)低齡兒童齲病的病因?qū)W研究和精準(zhǔn)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是現(xiàn)階段研究重點(diǎn)。

誘發(fā)齲病的因素較為復(fù)雜，四聯(lián)因素學(xué)說認(rèn)為細(xì)菌、環(huán)境、宿主、時(shí)間都是齲病發(fā)生的必要因素。其中，細(xì)菌是最關(guān)鍵的因素。近年，隨著高通量測(cè)序技術(shù)和人類微生物組計(jì)劃的突破性進(jìn)展，越來越多學(xué)者認(rèn)為口腔微生物群落失衡導(dǎo)致齲病的發(fā)生和發(fā)展［4］，這為齲病研究提供了新思路。但是，目前的研究限制了對(duì)齲病微生物病因?qū)W研究的深度和精度［2，5］。

因此，本研究旨在對(duì)比解析青島市5歲重度低齡齲兒童及健康者齦上牙菌斑微生物群落差異，探究齲病發(fā)生的微生物病因?qū)W機(jī)制，甄選潛在的齲病相關(guān)微生物因子，建立基于菌群信息的齲病風(fēng)險(xiǎn)模型，為青島市兒童齲病特定目標(biāo)人群微生物診斷和個(gè)性化治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

2019年3～6月對(duì)青島市13個(gè)幼兒園的5歲兒童進(jìn)行口腔流行病學(xué)調(diào)查，經(jīng)口腔檢查篩選出31例患重癥低齡兒童齲的兒童（C組：dmfs≥6）和34例口腔健康的兒童（H組：dmfs＝0）參與本研究。受試者入選標(biāo)準(zhǔn)：過去3個(gè)月未使用抗生素；牙列為乳牙列；口腔黏膜無明顯異常；無發(fā)育畸形及全身系統(tǒng)性疾??；未佩戴各種正畸矯治器及配件。本研究經(jīng)青島大學(xué)附屬青島市口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有受試者均取得了兒童監(jiān)護(hù)人同意。

1.2 樣本采集方法

口腔檢查：選擇3名口腔專業(yè)本科以上畢業(yè)從事口腔臨床工作3年以上醫(yī)生進(jìn)行檢查，檢查器械均經(jīng)高溫高壓嚴(yán)格滅菌消毒。所有醫(yī)生在檢查前均接受口腔臨床檢查培訓(xùn)，檢查者之間的標(biāo)準(zhǔn)一致性檢驗(yàn)Kappa值均＞0.85。齲病的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照世界衛(wèi)生組織《口腔健康調(diào)查基本方法》（第5版）。

樣本采集：采樣前，根據(jù)《人類微生物組計(jì)劃程序手冊(cè)》（http：//hmpdacc.org/resources/tools＿protocols.php）和之前的研究［2］對(duì)3位口腔檢查醫(yī)生進(jìn)行樣本采集培訓(xùn)。2019年3～6月上午10：00～11：00收集樣本，所有受試者早晨不刷牙，采樣前2 h內(nèi)不進(jìn)食并輕漱口，在口腔檢查所用的簡(jiǎn)易牙椅上進(jìn)行采樣，用無菌棉簽收集全部萌出的20顆乳牙的頰舌面及面齦上菌斑，將棉簽頭剪下保存于1.5 mL離心管中，置于－20℃條件保存，在2 h之內(nèi)轉(zhuǎn)移至青島市口腔醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室－80℃冰箱。

1.3 基因組DNA的提取、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymer-ase chain reaction，PCR）擴(kuò)增及測(cè)序

使用 MoBio PowerSoil DNA Isolation Kit（QIAGEN）試劑盒純化分離菌斑樣本中基因組DNA，對(duì)其16S rRNA片段上的V3－V4高變區(qū)進(jìn)行基因擴(kuò)增，使用KAPA 2G Robust Hot Start Ready Mix試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用 Illumina Miseq PE300平臺(tái)（Illumina，Inc.，USA）進(jìn)行測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用IBM SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)各組的性別分布的差異性采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用 QIIME2（https：//qiime2.org）對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制和后續(xù)生物信息學(xué)分析。使用 R（v3.6.0，https：//www.r－project.org/）進(jìn)行菌群統(tǒng)計(jì)分析。H組和C組之間的比較采用Wilc-oxon ranksum檢驗(yàn)，采用Bonferroni檢驗(yàn)校正法進(jìn)行多重比較分析（P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。通過多因素方差分析（permutationa multivariate analysis of variance，PERMANOVA）考察齲病狀態(tài)和性別對(duì)微生物結(jié)構(gòu)的影響程度。所用構(gòu)建模型方法為隨機(jī)森林（random forest，RF）算法，模型性能通過受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）及其曲線下面積（area under the curve，AUC）進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 H組和C組的性別分布

65例5歲兒童納入研究，其中男36例，女39例；H組中，男17例，女17例；C組中，男19例，女12例（表1）。H組和C組的性別組成無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表1 H組和C組的性別分布Tab 1 Sex distribution of H group and C group

2.2 齦上菌斑菌種多樣性分布

圖1可見：α多樣性指數(shù)中，Shannon和Simpson指數(shù)顯示C組顯著高于H組（P＜0.05），說明C組的物種豐富度高于H組；不同性別來源的樣本的3個(gè)α多樣性指數(shù)均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 齦上菌斑菌群多樣性分析Fig 1 Analysis of the diversity and richness of the flora in supra-gingival plaque of the subjects

2.3 基于Bray-Curtis矩陣的齦上菌斑微生物群落結(jié)構(gòu)

首先，齲病狀態(tài)會(huì)顯著影響菌斑的微生物菌群結(jié)構(gòu)（F＝1.73，P＜0.05），性別無影響（P＞0.05；圖2A）；其次，H組和C組的菌斑菌群結(jié)構(gòu)存在明顯差異（P＜0.05），且C組的群落結(jié)構(gòu)距離較遠(yuǎn)且更為復(fù)雜，而H組的群落結(jié)構(gòu)較為相似（P＜0.001；圖 2B）；最后，PCoA分析可見兩組樣本呈顯著分離（P＜0.01；圖2C）。

圖2 H組和C組齦上菌斑微生物群落結(jié)構(gòu)比較Fig 2 Comparison of microbial community structure from supragingival plaque between H group and C group

2.4 基于種系發(fā)育信息的齦上菌斑微生物菌群特點(diǎn)

對(duì)兩組的齦上菌斑微生物相對(duì)豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（圖3）。在門水平，H組和C組樣本的組成比較相似，超過98%樣本的菌斑菌群由以下5個(gè)相對(duì)豐度占比較高的門構(gòu)成，包括變形菌門（Proteobateria，35.32%）、厚壁菌門（Firmicutes，28.14%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，12.95%）、放線菌門 （Actinobacteria，12.39%）、梭桿菌門（Fusobacteria，9.57%）。

圖3 齦上菌斑菌群中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門構(gòu)成Fig 3 The predominant phylum in the supragingival plaque microbiota

在門、綱、目、科、屬、種6個(gè)種系發(fā)育水平下比較C組和H組物種組成差異，沒有發(fā)現(xiàn)齲病特異性致病菌，即不存在齲患者群中可檢測(cè)到，而健康人群中未檢測(cè)到的物種（圖4）。從門到種6個(gè)水平下均檢測(cè)到在兩組間相對(duì)豐度存在顯著差異的細(xì)菌種類（圖4，P＜0.05）：（1）門水平，梭桿菌門（Fusobacteria）、TM7；（2）綱水平，梭桿菌綱（Fusobacteriia）、芽孢桿菌綱（Bacil-li）；（3）目水平，梭桿菌目（Fusobacteriales）、巴氏桿菌目（Pasteurellales）；（4）科水平，普氏菌科（Prevotellace-ae）、巴氏桿菌科（Pasteurellaceae）；（5）屬水平，普氏菌屬（Prevotella）、嗜血桿菌屬（Haemophilus）；（6）種水平，變形鏈球菌（Streptococcus mutans）、異殊韋榮球菌（Veillonella dispar）、普氏菌 －317（Prevotella 317）、副流感嗜血桿菌（Haemophilus parainfluenzae）。

圖4 H組和C組齦上菌斑菌群種系發(fā)育信息的比較Fig 4 Difference of microbial composition of supragingival plaque between H group and C group

2.5 基于齦上菌斑微生物建立ECC評(píng)估模型

首先，篩選對(duì)建模最優(yōu)的種系發(fā)育水平，發(fā)現(xiàn)利用細(xì)菌種水平圖譜可獲得性能最佳模型（AUC＝0.71，圖5）；其次，基于本研究中已篩選出的4個(gè)在兩組間顯著差異表達(dá)的細(xì)菌種構(gòu)建模型，可得到性能接近于基于全部細(xì)菌種信息構(gòu)建的評(píng)估模型（AUC＝0.68，圖5）；最后，分別用這四個(gè)細(xì)菌種獨(dú)立建模，變形鏈球菌亦可得到性能較好評(píng)估模型（AUC＝0.68，圖5），提示這些微生物因子在低齡兒童齲病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

圖5 利用齦上菌斑菌群圖譜建立齲病分類模型Fig 5 Caries classifications based on supragingival plaque microbiota profile

3 討 論

本研究中，健康和患齲兒童的性別分布均衡（P＞0.05），不同性別來源的兒童口腔微生物組沒有差異（P＞0.05）。與之前研究結(jié)果一致［6］，重度低齡兒童齲兒童和健康者齦上菌斑菌群多樣性和結(jié)構(gòu)均存在顯著差異。而且，患齲兒童之間的群落結(jié)構(gòu)相比健康者間距離較遠(yuǎn)且更為復(fù)雜，提示齲病菌群可能存在個(gè)體異質(zhì)性［2，7］。此外，在H組和C組中均沒有檢測(cè)到“齲特異性”細(xì)菌。這些結(jié)果說明齲病涉及的微生物變化比所預(yù)期的要復(fù)雜，不是某種特異性微生物導(dǎo)致的，而是口腔生物膜菌群的結(jié)構(gòu)在整體上發(fā)生了改變，這也證實(shí)了“生態(tài)菌斑假說”［8］。

通過對(duì)種系發(fā)育水平的研究得出齦上菌斑微生物群落的在門水平的構(gòu)成與以往兒童口腔齦上菌斑研究一致［9］。本研究篩選出在齲病中高表達(dá)的細(xì)菌，主要屬于鏈球菌屬、普氏菌屬和韋榮球菌屬，即這些口腔常駐微生物轉(zhuǎn)變?yōu)榱酥虏∥⑸铮@亦證實(shí)了微生態(tài)失衡是多種微生物作用的結(jié)果，從而導(dǎo)致齲病的發(fā)生發(fā)展［8］。其中，變形鏈球菌是最常見的致齲細(xì)菌，具有高度產(chǎn)酸和耐酸特性，其致齲能力強(qiáng)于其他產(chǎn)酸菌［10］。變形鏈球菌在牙菌斑微環(huán)境中通過發(fā)酵多種化合物產(chǎn)酸，并且生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝，最終導(dǎo)致牙齒脫礦、齲損加重［11］。韋榮球菌主要利用碳水化合物代謝出中間產(chǎn)物（乳酸），將乳酸轉(zhuǎn)化為酸性較弱的丙酸和乙酸，并在低pH值環(huán)境下有利于變異鏈球菌等致齲菌進(jìn)行代謝產(chǎn)酸過程［12－13］。普氏菌在體外培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)沒有產(chǎn)酸性，僅具備中度耐酸能力［14］，但大量齲病研究發(fā)現(xiàn)普氏菌在牙本質(zhì)齲中高表達(dá)，可能通過自身的蛋白溶解特性參與齲病的發(fā)生發(fā)展［2，15－16］。

人類微生物組核心目標(biāo)之一是利用共生菌群診斷和預(yù)測(cè)疾病。本研究基于牙菌斑菌群信息建立了齲病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型，其辨別齲病和健康樣本的準(zhǔn)確率均可以達(dá)到71%；尤其是使用篩選的4個(gè)細(xì)菌種類和變形鏈球菌分別建立的齲病評(píng)估模型均與全菌譜模型的性能比較相似。本研究結(jié)果提示可以利用其建立快捷和精確的齲病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法，是否可直接應(yīng)用于臨床預(yù)測(cè)高危人群，亟待于進(jìn)一步研究驗(yàn)證。