一種中藥配伍活性成分的提取及其體外抑菌性*

張 劍，張 博，張 寒，徐 豪，劉春葉

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

中藥配伍是在中醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)理論和臨床經(jīng)驗指導(dǎo)下，將多種中藥配伍在一起，用以更好治療疾病，是中醫(yī)藥的核心[1-3]。近年來，現(xiàn)代方劑配伍相容性研究日益受到人們的重視，并逐漸成為中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的重要組成部分[4-6]。中藥配伍法則是中藥復(fù)方理論的精華，復(fù)方配伍產(chǎn)生的中藥多成分、多靶點、多途徑的治療作用為中藥新藥研發(fā)提供了理論指導(dǎo)和實踐依據(jù)。單味中藥經(jīng)配伍后可以達(dá)到減毒、增效的效果[7]。

黃連中含有鹽酸小檗堿,在體外對多種革蘭陽性及陰性菌均具抑菌作用,目前認(rèn)為是黃連的主要抑菌成分之一[8-9]；苦參中主要含有生物堿類和黃酮類成分，具有抑菌、抗菌、抗炎、抗氧化等功效[10-11]。甘草根及根莖的主要成分是甘草酸，甘草酸具有抑菌、抗氧化、抑制人類免疫缺陷病毒、增強免疫、保護(hù)等方面的藥理作用[12-13]。將黃連-苦參-甘草等藥以不同比例配伍，產(chǎn)生不同的臨床效果。

作者選擇黃連、苦參、甘草組成中藥抑菌配方，通過對配方中有效成分進(jìn)行提取，并運用藥敏實驗和提取液的吸光度來確定最佳抑菌效果的配方比例，以期為中藥復(fù)方抑菌處方的研制提供借鑒和參考。

1 實驗部分

1.1 原料與儀器

黃連、苦參、甘草：道地藥材，西安葆元堂股份有限公司。將藥材放入恒溫鼓風(fēng)干燥機中37 ℃干燥，然后用高速萬能粉碎機粉碎并過180 μm篩，放入廣口瓶中備用；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌：標(biāo)準(zhǔn)菌種，由西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)信息與技術(shù)學(xué)院提供。

電子天平：JM-B6002，余姚市紀(jì)銘稱重校驗設(shè)備有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-2000A，循環(huán)水式真空泵：SHZ-D(Ⅲ)，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；高速萬能粉碎機：FW-200，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；紫外可見分光光度計：WFZ UV-2102PCS，優(yōu)尼柯(上海)儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱：DH-500A，北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 活性成分提取

以水為溶劑，采用微波萃取法，提取功率為1 000 W，設(shè)定相應(yīng)提取時間和溫度，將提取液抽濾、濃縮，定容到25 mL容量瓶；取上述溶液1 mL，稀釋1 000倍，用紫外分光光度計測345 nm處的吸光度，以吸光度的大小作為評價指標(biāo)。

1.2.2 抑菌性實驗

移取提取液1 mL至滅菌離心管中，再將20片直徑6 mm滅菌后的濾紙片浸入藥液中放入37 ℃干燥箱，揮發(fā)除去大部分水后備用。稱取33 g營養(yǎng)瓊脂，加入1 000 mL蒸餾水中，加熱煮沸溶解，在121 ℃、102 MPa滅菌15 min制成培養(yǎng)基，待溫度下降至50～60 ℃，在超凈臺上將制備好的培養(yǎng)液倒入經(jīng)過同樣方法滅菌的培養(yǎng)皿中，放冷、凝固，備用[14]；將所需細(xì)菌接種在培養(yǎng)皿中，然后貼上浸有提取液的濾紙片，放入37 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后觀察抑菌圈大小。

1.2.3 響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取工藝

利用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計并優(yōu)化提取方案，考察各影響因素之間的交互作用。以提取液最大紫外吸收波長處吸光度為響應(yīng)值，對提取過程中的提取溫度、提取時間、V(水)∶m(原料)(以下簡稱“液料比”)進(jìn)行三因素三水平實驗設(shè)計，共17個實驗點(包括5個中心點)。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取液最大紫外吸收

將提取液在200～600 nm紫外分光光度計下進(jìn)行掃描，結(jié)果見圖1。

λ/nm圖1 配伍提取液200～600 nm紫外吸收光譜

由圖1可知，藥材提取液在紫外波長為345 nm處的峰型較好，且吸收明顯。因此，選用波長345 nm對提取液中有效成分含量進(jìn)行評價。

2.2 配伍比例

不同組方時各提取液的抑菌性實驗結(jié)果見表1。

表1 抑菌結(jié)果1)

續(xù)表

由表1可知，m(黃連)∶m(苦參)∶m(甘草)=8∶1∶1，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及腐生葡萄球菌均具有較好抑制作用，抑菌圈最大，抑菌效果最好，故確定最佳配比為m(黃連)∶m(苦參)∶m(甘草)=8∶1∶1。

2.3 響應(yīng)曲面實驗

選擇提取溫度A、提取時間B、液料比C為自變量，以提取液最大吸收波長處吸光度為響應(yīng)值，采用Box-Behnken實驗方法，設(shè)計17個實驗點，其中12個為析因點，5個為零點實驗，以估計誤差。實驗因素水平及編碼、響應(yīng)面實驗結(jié)果及方差分析結(jié)果分別見表2～表4。

表2 實驗因素水平及編碼

表3 響應(yīng)面分析方案及實驗結(jié)果

續(xù)表

表4 方差分析表1)

2.4 各因素之間的交互作用

2.4.1 溫度與時間的交互影響

固定液料比C為20∶1，由響應(yīng)曲面得出提取溫度A與提取時間B的等高線圖和響應(yīng)曲面圖見圖2。

A/℃a 等高線圖

b 響應(yīng)曲面圖圖2 提取溫度與時間的交互影響

由圖2可知，提取溫度與提取時間的等高線呈橢圓形，表明溫度與時間對實驗有交互影響，但表4可知AB的P=0.052 4>0.05，表明兩者之間交互作用不顯著。

2.4.2 溫度與液料比的交互影響

固定提取時間B為60 min，由響應(yīng)曲面得出提取溫度A和液料比C的等高線圖和響應(yīng)曲面圖見圖3。

A/℃a 等高線圖

b 響應(yīng)曲面圖圖3 提取溫度與液料比的交互影響

由圖3可知，等高線呈圓形，曲面平緩，表明提取溫度與液料比無交互影響。由表4可知AC的P=0.799 6>0.05，表明兩者之間交互作用不顯著。

2.4.3 時間與液料比的交互影響

固定提取溫度A為50 ℃，由響應(yīng)曲面得出提取時間B和液料比C的等高線圖和響應(yīng)曲面圖見圖4。

B/mina 等高線圖

b 響應(yīng)曲面圖圖4 提取時間與液料比對提取率的交互影響

由圖4可知，等高線呈橢圓形，表明提取時間與液料比有交互影響。由表4可知BC的P=0.278 8>0.05，因此，兩因素之間交互作用對實驗結(jié)果影響不顯著。

2.5 結(jié)果驗證與抑菌活性評價

精密稱取3份藥材樣品，按優(yōu)化后的條件進(jìn)行提取，所得提取液分析結(jié)果見表5。

由表5可知，提取液的吸光度平均值為0.785 6，理論預(yù)測值為0.789 9，則相對誤差為0.5%，相對誤差小于3%。因此，采用響應(yīng)曲面法(RSM)優(yōu)化得到的提取條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實用價值。提取液的抑菌結(jié)果表明，優(yōu)化條件下的抑菌效果顯著。

表5 驗證結(jié)果

3 結(jié) 論

對黃連、苦參、甘草3種中藥材的配伍比例進(jìn)行優(yōu)化，采用超聲-索氏提取對配伍藥材活性成分進(jìn)行提取，獲得m(黃連)∶m(苦參)∶m(甘草)=8∶1∶1，提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌的抑菌效果最好。對中藥的開發(fā)利用具有一定的指導(dǎo)意義，為中藥復(fù)方抑菌處方的研制提供一定的參考。