HPLC法測定干血濾紙片中苯妥英的濃度

王漪檬，馬愛玲，趙寧民，馬培志（鄭州大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450003）

苯妥英（phenytoin，DPH）為早期的經(jīng)典抗癲癇藥物，目前存在臨床用量不斷減少但又需長期進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測[1-4]（therapeutic drug monitoring，TDM）的矛盾現(xiàn)狀。由于基層TDM開展不夠廣泛、在當(dāng)?shù)仂o脈采血后樣品不易運輸?shù)仍?，苯妥英的血藥濃度監(jiān)測呈現(xiàn)零星化態(tài)勢，甚至有些醫(yī)院已放棄此項檢測。目前苯妥英的血藥濃度檢測方法有熒光偏振免疫法、酶放大免疫分析法、高效液相色譜法、液-質(zhì)聯(lián)用法、二維液相色譜法和毛細(xì)管電泳法等[5-10]。

干血濾紙片法（dried blood spots，DBS）作為一項成熟的方法，已廣泛應(yīng)用于新生兒篩查[11]，藥物的檢測[12-14]和基因測序[15]。其樣品收集技術(shù)具有較大的優(yōu)勢[13]，包括樣本的室溫穩(wěn)定性好、微創(chuàng)、成本低、易保存和運輸、能夠減少潛在的病原體感染風(fēng)險等。其作為一種新穎的TDM方法，已有臨床研究將該方法應(yīng)用于丙戊酸、卡馬西平（carbamazepine，CBZ）、他克莫司等藥物濃度的檢測[16-18]。本實驗將HPLC法和DBS法相結(jié)合，旨為臨床監(jiān)測苯妥英的血藥濃度提供參考。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

Waters 1525高效液相色譜儀（美國沃特斯公司），Waters 2489紫外檢測儀（美國沃特斯公司），AUW120D電子天平（日本島津公司），SCILOGEX MX-S旋渦混合器（美國賽洛捷克公司），LG16-A高速離心機(jī)（北京雷勃爾公司），DS3120超聲波清洗機(jī)（天津東康公司），Whatman 903濾紙（美國沃特曼公司，批號：6981314W131）。

1.2 試藥

苯妥英對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量98.6%，批號：100210-201002）；卡馬西平對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量99.7%，批號：100142-201105）；空白EDTA全血由本院檢驗科提供；甲醇為色譜純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱Venusil XBP C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（55∶45）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測波長：235 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 對照品溶液的制備

取適量苯妥英對照品，精密稱定。置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為2000.0 mg·L-1的儲備液，精密量取儲備液適量，用甲醇定量稀釋成濃度分別為3.1、6.3、12.5、25.0、50.0、100.0 mg·L-1的系列對照品溶液。

2.3 內(nèi)標(biāo)溶液的制備

取卡馬西平對照品適量，精密稱定。置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1.3 mg·L-1的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.4 干血濾紙片的制備和處理

用移液器吸取50 μL已混勻的全血樣本，滴于濾紙片的標(biāo)示圓圈中心，使濾紙正面朝上，置于平坦?jié)崈舾稍锏脑嚬芗苌?，室溫條件下晾干（> 4 h）備用，晾干后置于塑料自封袋內(nèi)保存，樣本于冷藏2周或冷凍1個月內(nèi)完成檢測。

使用打孔器從制備好的濾紙片上打取直徑為6 mm的血斑，置于1.5 mL離心管中，加入含有卡馬西平內(nèi)標(biāo)的甲醇溶液200 μL，超聲處理10 min，渦旋混勻5 min，15 000 r·min-1離心5 min。取上清液20 μL進(jìn)樣檢測。

2.5 方法學(xué)驗證

2.5.1 專屬性考察 取空白全血樣本、對照品樣本、患者樣本，分別按“2.4”項下操作后進(jìn)樣分析，記錄色譜圖（見圖1）。結(jié)果顯示苯妥英和卡馬西平（內(nèi)標(biāo)）的保留時間分別為4.1 min和5.0 min。分離度良好，流動相、血液內(nèi)源性雜質(zhì)和內(nèi)標(biāo)均不干擾苯妥英的分析。

圖1 HPLC色譜圖A – 空白血樣，B – 苯妥英+空白血樣，C – 患者血樣；1 – 苯妥英，2 – 卡馬西平Fig 1 HPLC chromatogramA – blank blood sample, B – phenytoin + blank blood sample, C –blood sample of patients; 1 – phenytoin, 2 – carbamazepine

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限 配制苯妥英濃度分別為3.1、6.3、12.5、25.0、50.0、100.0 mg·L-1的系列溶液，按“2.4”項下操作后進(jìn)樣分析。以峰面積（苯妥英峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積）為X，苯妥英濃度為Y進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y = 0.003 X + 0.001（r = 0.999，n =6）。結(jié)果表明苯妥英在3.1 ～ 100.0 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.3 回收率和精密度 取空白全血15份，制備濃度分別為8.1、16.3、32.5 mg·L-1的苯妥英低、中、高濃度樣本各5份，按“2.4”項下操作后進(jìn)樣分析，計算其精密度、相對回收率、絕對回收率，結(jié)果見表1。

表1 HPLC法測定干血濾紙片中苯妥英濃度的回收率及精密度測定結(jié)果. n = 5Tab 1 Recovery and precision of phenytoin in dried blood filter paper by HPLC. n = 5

2.5.4 穩(wěn)定性考察 按“2.4”項下要求，制備含有低、中、高三個濃度的苯妥英濾紙片，分別進(jìn)行室溫放置4 h、24 h、2 d、7 d、14 d；反復(fù)凍融1、2、3、4次及冰箱凍存1、7、14、28 d的穩(wěn)定性試驗。以室溫放置4 h后的含量結(jié)果為100%，計算不同時間點濃度的偏差，均小于10%。結(jié)果表明含藥濾紙片在上述條件下穩(wěn)定性良好。

2.6 臨床應(yīng)用

收集20例需要檢測苯妥英血藥濃度的患者全血樣本，先按“2.4”項下要求制備濾紙片，分析得到患者全血藥物濃度A；將患者剩下的全血樣本離心，所得到的血漿常規(guī)處理分析，得到患者血漿藥物濃度B，使用SPSS 21.0軟件對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行配對樣本t檢驗，P> 0.05為差異無統(tǒng)計學(xué)意義；經(jīng)Kolmogorov-Smirnova檢驗，兩組數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布（P> 0.05），然后進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，兩組數(shù)據(jù)存在顯著性正相關(guān)關(guān)系（sig. = 0.000，相關(guān)系數(shù)為0.994），即該方法可應(yīng)用于臨床，結(jié)果可信。但由于此次收集的樣本量較少，更深入的研究將在今后的工作中持續(xù)進(jìn)行。

3 討論

3.1 苯妥英血藥濃度監(jiān)測現(xiàn)狀

苯妥英主要用于預(yù)防和治療癲癇[19]、三叉神經(jīng)痛[20]和抗心律失常[21]等。因其上市較早，目前臨床使用量有所下降，以我院為例，近三年對苯妥英的監(jiān)測大幅減少（2020年79例次，相較于2018年減少50%）。我院作為三甲醫(yī)院必須開展其血藥濃度監(jiān)測，所以將樣本集中收集檢測顯得尤為重要。雖然臨床對苯妥英的監(jiān)測大幅減少，但經(jīng)過數(shù)據(jù)檢索，近些年對該藥的研究仍較豐富，應(yīng)用仍很廣泛。有利用毛細(xì)管電泳法測定患者呼出氣中的藥物濃度[22]和使用LCMS/MS法測定患者頭發(fā)中的藥物濃度[8]的監(jiān)測方法。從其它方面來看，有苯妥英和患者基因之間的關(guān)系[23-24]以及通過小鼠唇間質(zhì)細(xì)胞中的微RNA-196a-5p抑制細(xì)胞增殖的相關(guān)研究[25]。故對于苯妥英的檢測仍需持續(xù)進(jìn)行。

3.2 方法學(xué)條件的選擇

本實驗選擇HPLC法進(jìn)行檢測，主要考慮此方法在操作、成本和實用性上更適合臨床的持續(xù)開展。流動相為甲醇-水，配置簡單易儲存，對色譜柱損害極小，無需柱前柱后沖洗轉(zhuǎn)換。臨床上苯妥英血藥濃度的參考范圍為10 ～ 20 μg·mL-1，本實驗建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為3.1 ～ 100.0 mg·L-1，可滿足臨床需要。穩(wěn)定性考察的結(jié)果為常溫可保存14 d，保證了樣本在收集運輸和集中檢測過程中保存完好。

3.3 濾紙的選擇

本實驗選用了臨床常用，性質(zhì)穩(wěn)定可靠的Whatman 903濾紙，分別考察了其30 μL和50 μL的載樣量。室溫晾干時間分別考察了4、8、12、24 h 。超聲處理時間分別考察了10、20、30 min。最后確定了50 μL的濾紙載樣量、> 4 h的濾紙晾干時間和10 min的超聲處理時間。

綜上，此方法操作簡單，樣本收集便捷，若能將之應(yīng)用于臨床，能夠更好的對患者進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測，保障其用藥安全。