不同生長條件下鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌多樣性及活性菌株的篩選

李 婷，鄧順升，劉艷明，黃雅麗

(1 廣州中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006；2 廣東藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院/廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006)

鐵皮石斛Dendrobiumofficinale是蘭科Orchidaceae石斛屬Dendrobium多年附生草本，以新鮮或干燥的莖入藥?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛含有多糖、生物堿及酚類等多種有效活性成分，其提取物具有抗氧化、降血糖及防治糖尿病并發(fā)癥、抗腫瘤、提高免疫力等多種藥理作用[1-2]。鐵皮石斛作為藥食同源藥材，已被大量應(yīng)用于疾病及日常生活保健中，其需求量急劇上升[3-4]。目前鐵皮石斛種子、苗莖段、原球莖等是市場規(guī)?；囵B(yǎng)常用材料來源，在一定程度上解決了鐵皮石斛資源嚴(yán)重短缺的問題[5]。但是人工種植鐵皮石斛仍存在以下問題：試管苗移栽成活率偏低、生長周期長，致使鐵皮石斛種植成本高而產(chǎn)量低[6]；人工種植鐵皮石斛質(zhì)量參差不齊，且種植鐵皮石斛有效成分含量相對低于野生鐵皮石斛植株[7-8]；人工密集種植導(dǎo)致鐵皮石斛較易遭受微生物病害的侵染，造成炭疽病、白絹病、黑斑病、黑腐病等石斛病害的發(fā)生[9]，這些現(xiàn)象被認(rèn)為與組織培養(yǎng)苗生產(chǎn)與傳代過程中缺乏植物內(nèi)生菌有密切關(guān)系[10]。

植物內(nèi)生菌是指那些在生活史的一定階段或全部階段生活于植物的各種組織和器官內(nèi)部并與宿主植物在長期共同進(jìn)化過程中形成共生關(guān)系的一類微生物[11]。作為蘭科植物，鐵皮石斛的種子雖然數(shù)量眾多但沒有胚乳，在自然條件下必須與微生物建立共生關(guān)系才能完成生活史[12]。目前普遍認(rèn)為，石斛內(nèi)生菌可以通過增強(qiáng)水分和礦質(zhì)營養(yǎng)吸收，產(chǎn)生生長調(diào)節(jié)劑和維生素等物質(zhì)以促進(jìn)植株根、莖、葉的生長及提高活性成分[13]。

石斛內(nèi)生菌是影響石斛生長與藥效的重要生態(tài)因素之一。目前石斛內(nèi)生菌的研究主要集中在真菌方面，細(xì)菌作為內(nèi)生菌重要組成部分和活性類群研究較少。比較野生和人工鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌結(jié)構(gòu)差異，研究野生鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌活性和在組培苗中的定殖情況，對于揭示植物內(nèi)生菌結(jié)構(gòu)形成的驅(qū)動因素、增強(qiáng)鐵皮石斛馴化苗對自然環(huán)境的栽培適應(yīng)性、提高鐵皮石斛產(chǎn)量具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 藥用植株和菌株

野生鐵皮石斛采自廣東省清遠(yuǎn)市(23°20′49″N,113°12′ 11″E), 株高 10～15 cm；人工栽培鐵皮石斛采自廣東省潮州市饒平鐵皮石斛人工種植基地(23°10′49″N，113°21′9″E)，株高 20～35 cm。石斛樣品生長狀態(tài)均良好。采樣時(shí)將整株植物完整挖出，無菌采樣袋密封好放入冰盒，運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室后置于4 ℃冰箱中保存, 在2 h內(nèi)進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的分離。使用的鐵皮石斛炭疽病致病菌為膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院張桂芳老師饋贈。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA) 培養(yǎng)基購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司?；钚跃Y選培養(yǎng)基配制參考文獻(xiàn) [14]。2×T5 Direct PCR kit(Tsingke) 購于北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。共生培養(yǎng)基配制：1/2 MS(購自海博生物技術(shù)有限公司)+2 g/L活性炭+8 g/L 瓊脂。引物 27F(5′-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3′)和 1492R(5′-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3′)由深圳華大基因股份有限公司合成。

1.3 內(nèi)生細(xì)菌的分離和純化

用自來水沖洗掉鐵皮石斛植株上的泥土后，將其根、莖、葉分開，剪成約2 cm的小段, 依次用φ為75% 的乙醇溶液浸泡 2 min，10.91～65.45 g/L的NaClO溶液浸泡5 min，無菌水沖洗至少3遍, 用無菌鑷子和剪刀將植株根、莖、葉剪碎，取0.1 g剪碎組織置于無菌研缽中，加無菌水1 mL研磨成勻漿，取0.1 mL組織勻漿均勻涂布于PDA平板上，37 ℃條件下培養(yǎng)14 d左右，每天觀察菌株生長狀況，將新長出菌落轉(zhuǎn)接新的PDA平板，根據(jù)肉眼可辨的菌落形態(tài)特征，將從同一器官內(nèi)分離到的相同菌株去除，轉(zhuǎn)接純化至單菌落后保存。同時(shí)收集表面消毒時(shí)最后1次沖洗樣品的水樣，以同樣的方法涂布于PDA平板檢測消毒效果。

1.4 內(nèi)生細(xì)菌的鑒定

使用 Direct PCR kit擴(kuò)增細(xì)菌 16S rDNA。挑取單菌落菌體加入 50 μL Lysis buffer A 中，95 ℃ 水浴 10 min，加入等量 Lysis buffer B 作為緩沖液；渦旋振蕩后短暫離心，取上清液作為DNA模板，以27F和1492R為引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA，PCR反應(yīng)條件:98 ℃ 預(yù)變性 2 min；98 ℃ 變性 10 s，55 ℃退火 20 s，72 ℃ 延伸 30 s，共 30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 終延伸2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定無誤后送上海美吉生物有限公司測序，測序序列于Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi) 中比對。選取代表性菌株的16S rDNA序列信息，使用MEGA7.0軟件，采用鄰接法構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹，并用iTOL進(jìn)一步美化。

1.5 內(nèi)生細(xì)菌活性篩選

參照文獻(xiàn)[14]的方法篩選解磷、解鉀、產(chǎn)IAA和固氮的活性菌株。參照文獻(xiàn)[15]的方法篩選產(chǎn)鐵載體的活性菌株。將篩選菌株和致病炭疽菌接種在PDA平板上,兩菌相距5 cm，置于培養(yǎng)箱內(nèi)28 ℃條件下培養(yǎng)3～5 d，觀察并記錄菌株生長情況和菌株間的拮抗現(xiàn)象。每種拮抗菌設(shè)3次重復(fù)。

1.6 內(nèi)生細(xì)菌定殖動態(tài)

將內(nèi)生菌于37 ℃、250 r/min條件下培養(yǎng)至對數(shù)期，稀釋成1×106CFU/mL菌液備用。隨機(jī)挑選健康且長勢一致(2～4葉期)鐵皮石斛組培苗，移至含有共生培養(yǎng)基的旋口瓶中，每瓶3棵苗。吸取0.5 mL稀釋菌液添加至試管苗根部，對照組僅添加0.5 mL培養(yǎng)基。將試管苗置于溫度(25±2) ℃、光照度1 500 lx、每天光照時(shí)間 12 h、空氣相對濕度 60%～80% 的條件下培養(yǎng)。分別取接種后3、10、20和30 d的鐵皮石斛苗，用無菌剪刀將其根、莖、葉分開，按“1.3”方法表面消毒以及檢測消毒效果。將根、莖和葉分別置于無菌的研缽中研磨至勻漿，再用無菌蒸餾水梯度稀釋，涂布平板，于37 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，統(tǒng)計(jì)回接菌定殖情況。

1.7 數(shù)據(jù)處理

參考文獻(xiàn)[16]的方法對野生和人工栽培鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener diversity index，H′)、均勻度指數(shù)(Evenness index，E)、相似性系數(shù) (Similarity coefficient，C) 進(jìn)行計(jì)算及分析。采用 Excel、SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理統(tǒng)計(jì)，利用Duncan’s 法分析鐵皮石斛不同部位的多樣性指數(shù)差異, 采用t檢驗(yàn)分析不同生境下的數(shù)據(jù)是否存在差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生與人工栽培鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌的類群結(jié)構(gòu)

從野生鐵皮石斛植株中分離到217株內(nèi)生細(xì)菌，根據(jù)測序比對和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，內(nèi)生細(xì)菌可以歸類為芽孢桿菌屬Bacillus、微桿菌屬M(fèi)icrobacterium、不動桿菌屬Acinetobacter、短食單胞菌屬Stenotrophomonas、硫胺素芽孢桿菌屬Aneurinibacillus、棒狀桿菌屬Leifsonia、短小桿菌屬Curtobacterium、無色菌屬Achromobacter、泛菌屬Pantoea等9個(gè)屬(隸屬于3個(gè)門)(圖1)。其中芽孢桿菌屬和不動桿菌屬菌株數(shù)分別占總分離菌株數(shù)的79.26%和8.76%，為優(yōu)勢菌群。野生鐵皮石斛不同組織內(nèi)生細(xì)菌類群結(jié)構(gòu)存在差異(圖2)。分離自根的內(nèi)生細(xì)菌有70株，優(yōu)勢菌群是芽孢桿菌屬(占根部分離菌株的81.16%)、微桿菌屬(7.25%)和不動桿菌屬(5.8%)。來自莖的內(nèi)生細(xì)菌有128株，優(yōu)勢菌群是芽孢桿菌屬(占莖部分離菌株的79.84%)、不動桿菌屬(9.3%)和短食單胞菌屬(6.2%)。葉中分離到19株細(xì)菌，以芽孢桿菌屬(占葉部分離菌株的68.42%)、不動桿菌屬(15.79%)為優(yōu)勢菌群。芽孢桿菌屬、不動桿菌屬、短食單胞菌屬存在于野生鐵皮石斛根、莖、葉各組織部位。

圖 1 基于16S rDNA建立的部分鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequence of partial endophytic bacteria isolated from the Dendrobium officinal

圖 2 野生鐵皮石斛可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌在屬水平的相對豐度Fig.2 The relative abundance of cultivatable endophytic bacteria isolated from wild Dendrobium officinale at the genus level

從人工栽培鐵皮石斛植株中分離到68株內(nèi)生細(xì)菌，歸類為伯克霍爾德菌屬Burkholderia、埃希菌屬Escherichia、泛菌屬Pantoea3個(gè)屬(隸屬于1個(gè)門)(圖1)。其中伯克霍爾德菌屬和埃希菌屬分別占總分離菌株數(shù)的54.41%和30.88%，為優(yōu)勢菌群。人工栽培鐵皮石斛不同組織內(nèi)生細(xì)菌類群結(jié)構(gòu)存在差異（圖3）。根中分離到細(xì)菌34株，莖中分離到細(xì)菌22株，均以伯克霍爾德菌屬(占根部分離菌株的62.5%，占莖部分離菌株的60.87%)和埃希菌屬(占根部分離菌株的37.5%，占莖部分離菌株的30.43%)為優(yōu)勢菌群，并且這2個(gè)菌群也存在于葉中。葉中分離到細(xì)菌12株，以泛菌屬(61.54%)為優(yōu)勢菌群。

圖 3 人工栽培鐵皮石斛可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌在屬水平的相對豐度Fig.3 The relative abundance of cultivatable endophytic bacteria isolated from artificial cultivation Dendrobium officinale at the genus level

以上結(jié)果表明，野生與人工栽培鐵皮石斛內(nèi)生菌類群和比例存在較大差異，只有泛菌屬在野生和人工栽培鐵皮石斛中都可以分離到。

2.2 野生與人工栽培鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌的多樣性和相似性

從多樣性指數(shù)(H′)來看(表1)，野生鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌的H′為0.85，根、莖、葉的內(nèi)生細(xì)菌H′分別為0.75、0.80和1.02，根、莖、葉內(nèi)生細(xì)菌的均勻度指數(shù)(E)分別為0.42、0.36、0.63，葉中內(nèi)生細(xì)菌的H′和E顯著高于根和莖中的相關(guān)指數(shù)。野生植株中莖與根的相似性系數(shù)(C)最高(C莖?根=0.72)，其次是莖與葉(C葉?莖=0.65)，根與葉的相似性最低(C根?葉=0.60)；根據(jù) Jaccard相似性系數(shù)原理，當(dāng)C介于0.00～0.25 時(shí)為極不相似，C介于0.25～0.50時(shí)為中等不相似，C介于0.50～0.75時(shí)為中等程度相似，C介于0.75～1.00 時(shí)為極度相似[16]。由此可見，野生鐵皮石斛根、莖、葉3個(gè)部位兩兩之間的內(nèi)生細(xì)菌類群組成均為中等相似。

表 1 鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌的多樣性1)Table 1 The diversity of endophytic bacteria in Dendrobium officinale

人工栽培鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌的H′為0.61，根、莖、葉的內(nèi)生細(xì)菌H′分別為 0.47、0.87、0.93，根、莖、葉內(nèi)生細(xì)菌的E分別為0.68、0.80、0.84，說明葉中的內(nèi)生細(xì)菌多樣性最高，且類群最均勻，根的內(nèi)生細(xì)菌H′和E顯著低于莖和葉的相關(guān)指數(shù)；人工栽培植株中根與葉相似性最高(C根?葉=0.70)，其次是莖與葉 (C葉?莖=0.64)，根與莖中最低 (C根?莖=0.44)；根據(jù)Jaccard相似性系數(shù)原理判斷標(biāo)準(zhǔn)，人工栽培鐵皮石斛植株內(nèi)生細(xì)菌類群在根?葉和莖?葉中均為中度相似，根?莖中為中度不相似。

2.3 野生鐵皮石斛活性內(nèi)生菌的篩選

以野生鐵皮石斛代表性內(nèi)生細(xì)菌為供試菌株，進(jìn)行解磷、解鉀、固氮、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)IAA、拮抗菌的活性篩選，共獲得38株菌株，占篩選菌株的45%，其中10株具有解鉀活性，30株具有固氮活性，2株具有產(chǎn)IAA活性，4株具有拮抗病原菌活性。這些活性菌株中，10株分離自根，25株分離自莖，3株分離自葉，分子生物學(xué)鑒定歸類為芽孢桿菌屬(28株)、無色菌屬(3株)、不動桿菌屬(1株)、短小桿菌屬(1株)、硫胺素芽孢桿菌屬(2株)、泛菌屬(1株)、短食單胞菌屬(1株)、寡養(yǎng)單胞菌屬(1株)。菌株Bacillussp.B70、Curtobacterimsp.B81 同時(shí)具有固氮和產(chǎn)IAA活性。菌株Bacillussp.B03、Bacillussp.B23、Stenotrophomonssp.B32、Bacillussp.B41、Achromobactersp.B68、Bacillussp.B83 同時(shí)具有解鉀和固氮的特性。說明野生鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌具備較好的促生潛力，是發(fā)展菌劑的良好備選。

2.4 野生鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌在鐵皮石斛組培苗中的定殖

菌株Bacillussp.B70、Curtobacterimsp.B81 是促生活性較高的菌株，不動桿菌屬Acinetobacter是野生鐵皮石斛優(yōu)勢菌群，泛菌屬Pantoea細(xì)菌在野生和人工栽培鐵皮石斛中都存在，菌株Acinetobactersp.B48和Pantoeasp.B28具有拮抗病原菌活性。以菌株Bacillussp.B70、Curtobacterimsp.B81、Acinetobactersp.B48 和Pantoeasp.B28 為供試菌，觀察它們在鐵皮石斛組培苗的定殖動態(tài)。結(jié)果表明，除了Curtobacterimsp.B81以外，其他3株菌株能定殖在組培苗的不同部位 (表 2)。菌株P(guān)antoeasp.B28、Acinetobactersp.B48、Bacillussp.B70 在回接 3 d 后能在植物宿主中分離到，說明內(nèi)生菌具有一定的定殖效率。在回接后10 d，內(nèi)生菌定殖部位和數(shù)量有所增多，是內(nèi)生菌定殖的發(fā)展時(shí)期?；亟雍?0 d，定殖部位有所減少，說明內(nèi)生菌定殖因組織部位環(huán)境不同出現(xiàn)偏好性。定殖菌回接后30與20 d相比，除Acinetobactersp.B48在葉中的定殖消失，其余菌株定殖部位相對穩(wěn)定，是定殖相對穩(wěn)定期。在30 d的定殖觀察中，菌株Acinetobactersp.B48 和Bacillussp.B70 最終定殖在莖部，菌株P(guān)antoeasp.B28能定殖在根、莖、葉各部位。

表 2 內(nèi)生菌在鐵皮石斛組培苗中的定殖動態(tài)1)Table 2 Colonization trends of endophytic bacteria in potted seedling of Dendrobium officinale

3 討論與結(jié)論

蘭科植物有著豐富的內(nèi)生細(xì)菌資源，已有研究報(bào)道其在根、莖和葉中均有分布，對宿主植物的生長、抗病和抗逆性等具有重要作用[17]。本研究從鐵皮石斛根、莖、葉中分離到285株內(nèi)生細(xì)菌，隸屬3門11屬。從野生鐵皮石斛共分離到217株內(nèi)生細(xì)菌，歸類為芽孢桿菌屬、微桿菌屬等9個(gè)屬，以芽孢桿菌屬、不動桿菌屬為優(yōu)勢菌群存在于根、莖、葉各部位。從人工栽培鐵皮石斛植株中只分離到68株內(nèi)生細(xì)菌，歸類為伯克霍爾德菌屬、埃希菌屬、泛菌屬3個(gè)屬，以伯克霍爾德菌屬、埃希菌屬為優(yōu)勢菌群存在于植株根、莖部。只有泛菌屬在野生和人工栽培鐵皮石斛中都有分布，野生鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌物種多樣性指數(shù)均明顯高于人工栽培鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌，表明兩者內(nèi)生細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)存在較大差異。這可能是因?yàn)橐吧F皮石斛多生長在物種多樣的山林環(huán)境，該環(huán)境蘊(yùn)含了豐富的微生物資源，而人工種植大棚環(huán)境單一，物種有限，栽培基質(zhì)頻繁消毒處理，長期的人工栽培模式大大降低了植物內(nèi)生菌的多樣性。植物缺乏內(nèi)生菌也是其生長緩慢、成活率低、抗逆性差的主要因素[10]。把野生鐵皮石斛中具有促生和生防活性的內(nèi)生菌接入人工栽培鐵皮石斛，一方面可提高人工栽培鐵皮石斛內(nèi)生菌多樣性，增強(qiáng)其對栽培環(huán)境的適應(yīng)性，另一方面也為鐵皮石斛仿生態(tài)栽培奠定基礎(chǔ)。

鉀和磷是植物生長必需的營養(yǎng)元素。IAA可以促進(jìn)根的生長，增強(qiáng)根毛增殖和延長。固氮菌為宿主提供一定氮源，滿足其生命需求，有利于增加產(chǎn)量。產(chǎn)鐵載體的內(nèi)生細(xì)菌可以螯合Fe3+，有效地競爭致病真菌對鐵的需求[14]。炭疽病是人工栽培鐵皮石斛的重要病害，嚴(yán)重影響石斛產(chǎn)量和品質(zhì)[15]。從野生鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌中篩選解磷、解鉀、固氮、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)IAA、拮抗炭疽菌活性菌株，共獲得38株活性菌株，占篩選菌株的45%，這些內(nèi)生細(xì)菌具有開發(fā)促生和生防菌劑的良好潛力。但是菌劑應(yīng)用在生產(chǎn)栽培實(shí)踐中面臨的主要問題是有效期短和效果不穩(wěn)定[18]，其主要原因是活性菌在自然條件下在宿主植物的定殖能力有限。因此定殖能力強(qiáng)是內(nèi)生菌開發(fā)為生產(chǎn)應(yīng)用菌劑的前提條件。本研究將促生活性較高的菌株Bacillussp.B70、Curtobacterimsp.B81及優(yōu)勢類群的菌株Acinetobactersp.B48、Pantoeasp.B28回接組培苗，除了Curtobacterimsp.B81以外，其余菌株在組培苗都有定殖分布，說明來源于野生鐵皮石斛的內(nèi)生菌在人工組培苗中仍有較好的定殖性。雖然是通過根部接種，但是菌株Bacillussp.B70在回接后20 d只存在于莖部，菌株Acinetobactersp.B48存在于莖和葉部，這可能是因?yàn)橹参锊煌M織部位結(jié)構(gòu)和成分不同，內(nèi)生細(xì)菌在宿主植物中分布具有組織偏嗜性。

綜上所述，鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌資源豐富，野生和人工鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌多樣性有較大差異，內(nèi)生細(xì)菌活性比較普遍，在人工組培苗中有一定的定殖性，這為鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌功能性開發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)。