基于GC-MS的綠僵菌代謝組學(xué)前處理技術(shù)研究

楊 華，徐金柱，趙丹陽，邱華龍，田龍燕，秦長生

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2 廣東省林業(yè)科學(xué)研究院/廣東省森林培育與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510520)

代謝組學(xué)利用現(xiàn)代分析技術(shù)對(duì)生物體內(nèi)小分子化合物進(jìn)行定性定量研究[1]，結(jié)合現(xiàn)代生物信息學(xué)可實(shí)現(xiàn)對(duì)代謝物全面地、無偏倚地分析[2]。研究微生物代謝物的變化動(dòng)態(tài)，有助于我們更加了解微生物內(nèi)部的生理變化。目前代謝組分析技術(shù)主要有氣相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)[3]、液相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)[4]和核磁共振(NMR)[5]等?；贕CMS技術(shù)的樣品前處理步驟主要包括：淬滅、提取、衍生化和檢測。在代謝物淬滅過程中，應(yīng)盡可能地保證微生物細(xì)胞的完整性，避免胞內(nèi)代謝物外流[6]，可以通過迅速降低溫度或者在菌體培養(yǎng)液中加入有機(jī)溶劑等手段抑制代謝酶活性。冷甲醇淬滅是普遍使用的方法[7]，它可以在亞秒時(shí)間內(nèi)阻斷代謝反應(yīng)，將胞內(nèi)外的代謝物區(qū)分開[8-9]。常用的提取方法有冷甲醇液氮反復(fù)凍融法[10]和75%乙醇煮沸法[11]等。常用的提取液有熱乙醇、高氯酸或堿、甲醇和三氯甲烷等。在破碎細(xì)胞時(shí)，提取液將胞內(nèi)的代謝物溶解，為了確保提取到穩(wěn)定可靠的代謝物，可以加入4?羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和哌嗪乙磺酸(PIPES)等鹽離子進(jìn)行緩沖[12]。此外超臨界流體萃取、微波輔助萃取[13]、固相萃取、固相微萃取等方法也可用于微生物代謝物提取。但至今，仍然沒有一種適用于所有微生物的提取方法[14]，不同微生物、不同提取方法提取的代謝物傾向性和分析技術(shù)亦不同。因此在每一項(xiàng)新的代謝組學(xué)研究中，提取方法一定要有針對(duì)性的優(yōu)化和測試。

近年來，以綠僵菌Metarhiziumspp.、白僵菌Beauveriaspp.為代表的真菌生物農(nóng)藥已成為生物防治領(lǐng)域的熱門研究[15]。在菌種保存和應(yīng)用過程中，繼代培養(yǎng)造成菌株形態(tài)變異和毒力減退等退化現(xiàn)象普遍發(fā)生，極大地影響了真菌殺蟲劑在生產(chǎn)上的應(yīng)用。繼代培養(yǎng)后分生孢子產(chǎn)量與毒力的下降常常伴隨著次生代謝產(chǎn)物、代謝路徑和代謝網(wǎng)絡(luò)等層面的變化[16-19]。目前微生物代謝組學(xué)研究主要集中于大腸埃希菌Escherichiacoli[20]、釀酒酵母Saccharomycescerevisiae[21]及枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis[22-23]等幾種模式微生物，并且沒有一種方法可以適用于所有微生物的代謝研究。為了獲得真實(shí)、可靠和全面的代謝組學(xué)信息，需要一個(gè)準(zhǔn)確、穩(wěn)定的代謝組學(xué)檢測方法，但目前關(guān)于綠僵菌代謝組僅有少量基于LC-MS檢測的研究[24]，鮮見基于GC-MS的相關(guān)研究。本文以綠僵菌Ma09為研究對(duì)象，采用高分辨率的GC-MS技術(shù)，對(duì)綠僵菌代謝物前處理技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以期建立適用于綠僵菌的代謝組檢測方法，為獲得和解析綠僵菌的“代謝物指紋圖譜”提供技術(shù)支持，為綠僵菌的深入研究及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

綠僵菌Ma09，由廣東省林業(yè)科學(xué)研究院提供，綠僵菌斜面保存于4 ℃冰箱備用。轉(zhuǎn)接于PPDA液體培養(yǎng)基，200 r/min、25 ℃ 條件下培養(yǎng) 72 h。

1.2 方法

1.2.1 淬滅 參照 Tsuchido 等[25]的方法采用D260 nm和D280 nm回收率法評(píng)價(jià)淬滅劑對(duì)細(xì)胞膜損傷的程度。核酸和蛋白的特異吸光波長分別為260 和 280 nm，淬滅后菌液的D260 nm和D280 nm增加，意味著細(xì)胞內(nèi)的核酸和蛋白已滲出到菌液中，說明細(xì)胞膜已產(chǎn)生損傷。取72 h菌體培養(yǎng)液10 mL，4 ℃、6 000 r/min 離心 10 min，離心所得沉淀再用9 g/L NaCl溶液潤洗1次去除殘留培養(yǎng)基。分別用10 mL 不同淬滅劑 (0 ℃)將菌體重懸，以 9 g/L NaCl溶液作為陰性對(duì)照、熱 9 g/L NaCl (70 ℃,30 min)溶液作為陽性對(duì)照，4 ℃、6 000 r/min 離心10 min，得到上清液，試驗(yàn)重復(fù)3次。測定上清液的D260 nm和D280 nm，根據(jù)如下公式計(jì)算核酸的回收率(η260 nm)和蛋白的回收率 (η280 nm)。

淬滅劑參考前人的研究[7, 26]，選擇甲醇、乙醇和甘油溶液，體積分?jǐn)?shù)分別為20%、40%和60%。添加的緩沖鹽為 9 g/L的 NaCl、NaCN 和 (NH4)2CO3，10 mmol/L EDTA 及 10 mmol/L HEPES 溶液。

1.2.2 綠僵菌代謝物氣相色譜質(zhì)譜檢測 將綠僵菌Ma09菌液以40%(φ)乙醇溶液淬滅，?40 ℃冷甲醇提取后N2吹干，加入20 mg/mL的甲氧基胺鹽酸鹽吡啶溶液在37 ℃反應(yīng)60 min，加入含1%(φ)三甲基氯硅烷(TMCS)的N, O?雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺 (φ為 96% 的 BSTFA )衍生 1 h。采用 Agilent 8890+5977B GC/MS 系統(tǒng)，毛細(xì)管色譜柱為 HP-5ms(30 m×0.25 mm×0.25μm) (φ為 5% 的苯基甲基硅氧烷)非極性彈性石英毛細(xì)管柱。質(zhì)譜條件：電子轟擊源(EI)，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為 150 ℃，接口溫度為 280 ℃，電子能量為 70 eV，調(diào)諧方式為標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧，質(zhì)譜掃描方式為全掃描，掃描范圍為30～500 aum。使用NIST譜庫進(jìn)行圖譜檢索，試驗(yàn)重復(fù)3次。

氣相色譜以純度大于99.99%(φ)的高純氦氣(Ne)為載氣，載氣流速1 mL/min。采用不分流進(jìn)樣方式，進(jìn)樣量l μL。進(jìn)樣口溫度280 ℃。氣相色譜條件如下：

條件 A：起始溫度 50 ℃，保持 3 min；以 10 ℃/min升至 150 ℃，保持 5 min；然后以 5 ℃/min 升至 200 ℃，保持 5 min；以 10 ℃/min 升至 280 ℃，保持 5 min。

條件B：參考明明[27]的GC條件。起始溫度70 ℃，保持 4 min；以 3 ℃/min 升至 200 ℃；以 10 ℃/min升至 280 ℃，保持 5 min。

條件C：參考王洪彬等[23]的GC條件。初始溫度 70 ℃，恒溫保持 2 min；以 3 ℃/min 升到 133 ℃；以 2 ℃/min 升至 200 ℃；再以 3 ℃/min 升至 220 ℃；以 5 ℃/min 升溫至 280 ℃。

條件D：參考胡志宏等[28]的GC條件，起始溫度 65 ℃，保持 2 min；以 5 ℃/min 升至 185 ℃；以1 ℃/min 升至 200 ℃；以 15 ℃/min 升至 280 ℃，保持 5 min。

條件E：參考郭剛等[29]的GC條件，起始溫度70 ℃，保持 4 min；以 5 ℃/min 升至 280 ℃，保持4 min。

1.2.3 提取 熱乙醇提取法參考 Castrillo 等[11]的方法略作修改，淬滅后的綠僵菌沉淀加入5 mL 75%(φ)熱乙醇溶液 (含 0.25 mol/L HEPES 溶液)，pH 為 7.5，95 ℃ 水浴 3 min；然后迅速在冰浴中冷卻 3 min，12 000 r/min 離心 10 min，取上清液在 90 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1 mL。N2吹干后待衍生處理。

熱甲醇提取法參照Maharjan等[12]的方法。淬滅后的綠僵菌沉淀中加入2 mL的甲醇溶液[V(甲醇)∶V(H2O)=2∶1]混合均勻后迅速放入 70 ℃ 水中平衡 30 min，然后以 12 000 r/min 離心 5 min，取上清液N2吹干待后衍生化處理。

冷甲醇提取法參考前人研究[30-32]并作相應(yīng)修改，淬滅后的綠僵菌沉淀用2 mL預(yù)冷的甲醇(?20 ℃)溶解，迅速放入?20 ℃ 冰箱中保存 20 min，冰浴凍融 10 min 后以 12 000 r/min 離心 5 min。上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管，取上清液1 mL將沉淀再次懸起，重復(fù)上述步驟，2次上清液合并，N2吹干后待衍生化處理。

甲醇氯仿提取法參考Maharjan等[12]的方法。淬滅后的綠僵菌沉淀用1 mL甲醇溶解后，加入1 mL 冷三氯甲烷 (?40 ℃)渦旋 30 s后置于?20 ℃中保存 60 min，此過程中每隔 15 min 渦旋 1 次，最后12 000 r/min 離心 10 min，取上清液 N2吹干待衍生化處理。

氯仿?甲醇?緩沖液提取法參考Maharjan等[12]的方法略作修改。淬滅后的綠僵菌沉淀用5 mL冷三氯甲烷 (?40 ℃)溶解后，加入 2 mL 含有 3 mmol/L HEPES 和 3 mmol/L EDTA 的冷緩沖溶液 (0 ℃)，混合均勻后 12 000 r/min 離心 5 min。收集上層液并在剩余的三氯甲烷相中加入2 mL預(yù)冷的甲醇(?40 ℃)和 2 mL 冷緩沖液，渦旋 30 s后 10 000 r/min 離心5 min，收集上層水相并與前一次提取液合并，N2吹干待衍生化處理。

1.2.4 衍生化 代謝物經(jīng)淬滅和提取后必須進(jìn)行衍生化處理后才能進(jìn)行GC-MS檢測分析。對(duì)衍生時(shí)間進(jìn)行比較，取吹干后的樣品，加入20 mg/mL的甲氧基胺鹽酸鹽吡啶溶液80 μL，劇烈振蕩30 s后，在 37 ℃ 條件下反應(yīng) 90 min，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，然后加入 80 μL 含 1%(φ)TMCS的BSTFA衍生劑，在70 ℃條件下分別衍生0.5、1.0和1.5 h，冷卻至室溫后進(jìn)行GC-MS檢測，3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Mass Hunter軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，提取離子峰并用NIST MS數(shù)據(jù)庫進(jìn)行定性分析，將所有離子峰的峰面積數(shù)據(jù)歸一化，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析，采用Duncan’s法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 整體水平的細(xì)胞損傷及代謝物的滲出

D260 nm和D280 nm是評(píng)價(jià)細(xì)胞滲出物的指標(biāo)。圖1的結(jié)果顯示，D260 nm最小的淬滅劑為40%(φ)乙醇溶液和20%(φ)甘油溶液，兩者差異不顯著，但明顯低于其他淬滅劑處理的(P<0.05)。D280 nm最小的淬滅劑為60%(φ)甲醇溶液和20%(φ)甘油溶液，且兩者間差異不顯著，但明顯低于其他淬滅劑處理的(P<0.05)。

圖 1 不同淬滅劑處理后菌液的D260 nm和D280 nmFig.1 D260 nm and D280 nm of bacterial fluid with different quenching solutions

D260 nm和D280 nm越小說明淬滅過程中的代謝物滲出越少，淬滅效果越好。回收率計(jì)算結(jié)果(表1)顯示，40%(φ)乙醇溶液和20%(φ)甘油溶液2種處理的核酸和蛋白回收率最低。

表 1 不同淬滅劑處理后核酸和蛋白的回收率Table 1 The recovery rates of nucleic acid and protein using different quenching solutions

2.2 不同離子鹽對(duì)淬滅效果的影響

以40%(φ)乙醇溶液為空白對(duì)照，分別加入不同種類的離子鹽，從圖2可以看出緩沖鹽的加入降低了菌液的D260 nm和D280 nm，減少了菌體細(xì)胞的損傷，但是多重比較并未發(fā)現(xiàn)幾種離子鹽之間差異顯著 [F(D260 nm)=0.893，F(xiàn)(D280 nm)=2.009]。操作中發(fā)現(xiàn)，20%(φ)甘油溶液由于黏稠度比較大，不利用后期的濃縮，因此本試驗(yàn)選擇40%(φ)乙醇溶液且不加入任何離子鹽作為最佳淬滅劑。

圖 2 不同離子鹽加入后菌液的D260 nm和D280 nmFig.2 D260 nm and D280 nm of bacterial fluid added with different ionic salt

2.3 綠僵菌代謝物氣相色譜質(zhì)譜條件的確定

圖3為5種氣相色譜條件的總離子流圖。由于條件不同，各處理所用的時(shí)間也不同，條件C的總時(shí)最長為75 min，條件A僅需46 min。此外出峰時(shí)間和出峰數(shù)量存在明顯差異。

圖 3 不同氣相色譜條件檢測出的總離子流圖Fig.3 Graph of total ion current (TIC) under different chromatographic conditions

根據(jù)檢測出來的有效峰的數(shù)量可以判斷出條件A的效果最好，條件A所獲得的有效峰為97.33個(gè)，顯著多于其他幾種條件的(P<0.05)。

2.4 提取方法對(duì)綠僵菌代謝物提取效果的影響

選用了GC-MS對(duì)5種不同方法的提取效果進(jìn)行分析，根據(jù)有效峰數(shù)量評(píng)判最優(yōu)方法，各處理獲得有效峰數(shù)量差異顯著(P<0.05)。各處理樣本TIC譜圖見圖4。

圖 4 不同提取方法檢測出的總離子流圖Fig.4 Graph of total ion current (TIC) using different extraction methods

根據(jù)有效峰的數(shù)量和強(qiáng)度判斷，冷甲醇法效果最佳，可以檢測出有效峰109.4個(gè)，其次是熱乙醇法。

2.5 不同衍生物比例和時(shí)間的影響

不同衍生時(shí)間的總離子流圖見圖5，以圖5中物質(zhì)數(shù)量和峰強(qiáng)度作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)圖6有效峰數(shù)量可知，衍生0.5 h時(shí)大多數(shù)物質(zhì)濃度較低且有多種物質(zhì)無法檢測到，而衍生1.0和1.5 h時(shí)檢測到的物質(zhì)數(shù)量顯著提高了(P<0.05)，衍生1.5 h后可以檢測到90.33個(gè)有效峰。

圖 5 不同衍生時(shí)間的總離子流圖(TIC)Fig.5 Graph of total ion current (TIC) at different derivative time

圖 6 不同衍生時(shí)間的有效峰Fig.6 Effective peak at different derivative time

2.6 樣品前處理最佳方法的確定

取 10 mL 培養(yǎng) 72 h的綠僵菌菌液，40% 冷乙醇溶液淬滅后用2 mL冷甲醇提取，離心后將上清液用 N2吹干，加入 80 μL 20 mg/mL 的甲氧基胺鹽酸鹽吡啶溶液，劇烈振蕩30 s后，在37 ℃環(huán)境中反應(yīng)90 min，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，然后加入 80 μL BSTFA(φ為 1% TMCS)衍生劑，在 70 ℃條件下反應(yīng)，衍生1.5 h。在氣相色譜條件A下進(jìn)行代謝物檢測鑒定。采用該方法進(jìn)行3次重復(fù)測定，根據(jù)其保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行重復(fù)性評(píng)價(jià)，公式如下：

從表2可以看出該方法檢測保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.000 002～0.005 789，均小于 0.05，說明該方法穩(wěn)定性和重復(fù)性較好，且精密度較高，可以滿足代謝組學(xué)分析的要求。采用優(yōu)化方法處理的樣品經(jīng)GC-MS分析后共鑒定到50種代謝物。

表 2 綠僵菌代謝物檢測最適方法保留時(shí)間的重復(fù)性Table 2 Repeatability of the retention time for the optimal method of Metarhizium metabolites detection

3 討論與結(jié)論

代謝物分析的關(guān)鍵要選擇高敏感性的檢測手段，要求最大程度、最大范圍地提取細(xì)胞內(nèi)代謝物，從而更加真實(shí)的反映菌體胞內(nèi)代謝情況。雖然微生物代謝組分析已經(jīng)成為一種廣泛使用的方法，但只使用一個(gè)已建立起來的方法進(jìn)行代謝組分析所能檢測出的代謝物覆蓋率很低[33]，目前為止還沒有一種普遍適用的淬滅方法。另外絲狀真菌的生理和形態(tài)與細(xì)菌、酵母菌有很大的不同，培養(yǎng)物通常高度黏稠且不均勻，液體培養(yǎng)基中有時(shí)會(huì)形成菌絲團(tuán)或菌球，很難從發(fā)酵過程中獲得具有代表性的樣品[34]。因此不能采取與細(xì)菌、酵母菌相同的方法，需要對(duì)代謝物樣品制備步驟進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化。

理想的淬滅應(yīng)具有以下幾個(gè)條件：滅活新陳代謝的速度比樣品中代謝物的轉(zhuǎn)化速度更快；在淬滅步驟中保護(hù)樣品的完整性；淬滅盡量不引起代謝物的化學(xué)和物理性質(zhì)的變化；樣品淬滅以后能夠適合接下來的分析步驟；有可靠的重復(fù)性[35]。Wittmann等[36]認(rèn)為微生物突然進(jìn)入低于?60 ℃的環(huán)境中會(huì)產(chǎn)生一個(gè)冷休克的狀態(tài)，但是冷甲醇會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)代謝物的大量泄漏。對(duì)于甲醇是否真的能夠引起細(xì)胞代謝物泄漏的說法不一，Villas等[37]用冷甲醇處理釀酒酵母很少發(fā)生泄漏，而Maharjan[12]用冷甲醇處理谷氨酸棒桿菌胞內(nèi)代謝物則易泄漏。目前大部分研究都選用60%冷甲醇溶液作為淬滅劑，也有選用甘油和乙醇作為淬滅劑的研究。Villas等[37]認(rèn)為60%(φ)冷甘油?鹽水溶液是淬滅酵母和細(xì)菌最好的淬滅劑。Spura等[7]發(fā)現(xiàn) 40%(φ)的乙醇加 8 g/L 氯化鈉溶液(?20 ℃)作為淬滅劑效果要遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于60%甲醇溶液。本試驗(yàn)比較了甲醇、乙醇和甘油作為淬滅劑的效果，其中，效果最好的是40%(φ)乙醇溶液和20%(φ)甘油溶液，60%(φ)甲醇溶液效果次之。此外對(duì)于使用甘油作為淬滅劑也一直存在著爭議，Villas-b?as等[26]認(rèn)為在 60%(φ)冷甘油加鹽水溶液淬滅酵母和細(xì)菌可以很好的解決細(xì)胞泄露問題，本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，甘油雖然可以很好的保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，但由于黏稠度較大，易被色譜柱吸附，影響檢測質(zhì)量，在色譜總離子圖(TIC)中前端產(chǎn)生大片覆蓋區(qū)域，不利于分離。緩沖鹽對(duì)淬滅效果的影響也存在2種說法。Faijes等[9]認(rèn)為添加了HEPES和 (NH4)2CO3可以維持菌體內(nèi)外滲透壓平衡，顯著減少胞內(nèi)代謝物的泄露。Canelas等[38]則認(rèn)為加入緩沖鹽會(huì)加速代謝物滲出。由此可見，微生物淬滅方法和淬滅劑的選擇是一個(gè)艱難的過程，需要根據(jù)研究對(duì)象進(jìn)行優(yōu)化評(píng)價(jià)，建立適合相應(yīng)微生物淬滅的方法。本試驗(yàn)中在淬滅劑加入幾種離子鹽后，D260 nm、D260 nm與對(duì)照相比較均有小幅度降低，但是多重比較結(jié)果表明與對(duì)照差異并不顯著。這說明針對(duì)不同的菌種，是否需要加入緩沖鹽也是應(yīng)該考量的。本試驗(yàn)認(rèn)為40%乙醇溶液不加入緩沖鹽更適合作為綠僵菌代謝組的淬滅劑。

在不改變理化性質(zhì)的基礎(chǔ)上最大限度地將微生物代謝物從樣品中提取出來；提取后的樣品形式要與分析檢測技術(shù)的需求一致；盡可能地去除干擾物質(zhì)；便于濃縮[39]。提取劑的極性決定著最后獲得代謝物的極性范圍[40]，利用提取液與代謝物的相似相容原理，可以破壞菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而提取到代謝物質(zhì)。Maharjan等[12]使用6種提取劑提取大腸埃希菌代謝物，包括酸、堿、冷甲醇、熱甲醇、熱乙醇和甲醇+三氯甲烷，結(jié)果表明冷甲醇提取到了更多的代謝物。此外，利用熱乙醇提取氨基酸和途徑中間產(chǎn)物，簡單快速且無鹽加入，易蒸發(fā)和濃縮，但高溫對(duì)熱不穩(wěn)定的代謝物有破壞作用。Castrillo等[11]用4種提取方法分別提取了酵母菌的代謝組，不同方法產(chǎn)生了明顯不同的代謝物。Meyer等[41]對(duì)比了6種方法提取金黃色葡萄球菌代謝物，即冷甲醇、冷乙醇、冷甲醇、熱乙醇、冷氯仿+水+乙醇和熱水，發(fā)現(xiàn)冷乙醇效果最好。Canelas等[10]認(rèn)為甲醇反復(fù)凍融法和酸性甲腈乙醇不適用于酵母的代謝物提取。本試驗(yàn)比較了綠僵菌代謝組的5種提取方法，效果最好的還是冷甲醇法，這與大部分報(bào)道是一致的。

生物體內(nèi)的低極性難揮發(fā)的代謝物質(zhì)如氨基酸、脂肪、糖類和核苷酸類等需要GC-MS分析時(shí)，必須先進(jìn)行衍生化。目前常用的衍生化方法為肟化硅烷化衍生法[42]。肟化硅烷化衍生法實(shí)際包括2個(gè)步驟：首先是甲氧基胺與醛酮類物質(zhì)的加成反應(yīng)。但對(duì)于種類不同的醛酮物質(zhì)影響也是不同的。對(duì)于還原性糖類物質(zhì)主要影響因素為反應(yīng)時(shí)間[11]。而對(duì)于α?酮酸類物質(zhì)，pH是主要因素[43]。其次，肟化后需要進(jìn)行全面的硅烷化反應(yīng)，常用的硅烷化試劑有N?(叔丁基二甲基硅烷基)?N?甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA)、雙 (三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)等，通常會(huì)在使用中加入1%(φ)的三甲基氯硅(TMCS)。Kanani等[44]認(rèn)為BSTFA衍生化時(shí)間對(duì)回收的代謝物種類產(chǎn)生較大影響，本試驗(yàn)選取了甲氧基胺鹽酸鹽37 ℃條件下肟化90 min，加入BSTFA(φ為1% TMCS)70 ℃條件下進(jìn)行硅烷化，衍生時(shí)間為1.5 h時(shí)效果最好。

氣相色譜主要用于代謝物質(zhì)的分離，質(zhì)譜則是對(duì)代謝物的相對(duì)分子質(zhì)量和分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，為了能夠更有效地分離樣品中的代謝物，對(duì)氣相色譜升溫程序做了具體的優(yōu)化選擇，起始溫度過高不利于代謝物的檢測，因此本試驗(yàn)中色譜條件的起始溫度定為50 ℃，采取程序升溫法。程序開始時(shí)柱溫較低，低沸點(diǎn)物質(zhì)得到分離，中等沸點(diǎn)物質(zhì)緩慢移動(dòng)，隨著柱溫升高，低沸點(diǎn)和高沸點(diǎn)物質(zhì)得到分離，最后升溫至280 ℃，幾乎所有物質(zhì)都已經(jīng)被氣化分離。

本文對(duì)金龜子綠僵菌菌液的前處理技術(shù)及氣相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用分析方法進(jìn)行研究，對(duì)前處理過程中的淬滅、提取和衍生時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。所建方法對(duì)微生物主要代謝物如糖、氨基酸、醇、有機(jī)酸、烷烴、酯等均可檢出。此方法簡單、方便、高效，且穩(wěn)定性好，重復(fù)性良好，該方法的建立有助于開展更深入的代謝機(jī)制相關(guān)研究，并可為農(nóng)、林領(lǐng)域開展病原微生物代謝組相關(guān)研究提供參考。