circRIPK2在雞骨骼肌細(xì)胞增殖分化中的調(diào)控作用

張 敏，王芷筠，李 戡，聶慶華

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642)

人類(lèi)基因組約70%～90%可以轉(zhuǎn)錄成RNA，然而僅有不足2%的基因具備編碼能力[1]。眾多不具備編碼能力的RNA都被歸作轉(zhuǎn)錄噪音或者剪接副產(chǎn)品。盡管早期研究明確顯示非編碼RNA(Noncoding RNA，ncRNA)在自然界真實(shí)存在，它們的潛在作用仍沒(méi)有被充分證實(shí)[2]。隨著20世紀(jì)以來(lái)計(jì)算機(jī)技術(shù)的迅猛發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)這些非編碼RNA在不同的生理或者病理過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[3]。環(huán)狀 RNA(Circular RNA，circRNA)是內(nèi)源性非編碼RNA家族的一員，大概40年前，研究人員逐漸關(guān)注這種具有共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)的新興RNA分子。研究表明，circRNA在細(xì)胞中廣泛分布，和線(xiàn)性RNA相比，不易受RNA外切酶影響，具有更高的穩(wěn)定性[4]。近年來(lái)有關(guān)circRNA的生物學(xué)功能研究受到廣泛關(guān)注，其作用方式多種多樣，包括作為miRNA海綿、調(diào)控親本基因轉(zhuǎn)錄、和蛋白質(zhì)相互作用、甚至翻譯小肽等方式發(fā)揮功能[5-8]。目前對(duì)circRNA生物學(xué)功能的理解仍處于早期，除了對(duì)衰老、癌癥等疾病具有重要調(diào)控作用外，circRNA在肌肉發(fā)育過(guò)程中也具有重要作用。通過(guò)對(duì)不同動(dòng)物的骨骼肌和成肌細(xì)胞進(jìn)行circRNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在肌肉中高表達(dá)且具有調(diào)控作用的多個(gè)circRNA，例如circFUT10、circLMO7、circRBFOX2、circFGFR4 等，它們通過(guò)結(jié)合miRNA參與成肌細(xì)胞的增殖分化進(jìn)程[9-12]；另外也有研究發(fā)現(xiàn)circZNF609可以翻譯微肽，且調(diào)控成肌細(xì)胞的增殖過(guò)程[8]。

RIPK2是RIP家族的一員，RIPK2的N端包含1個(gè)絲氨酸/蘇氨酸結(jié)構(gòu)域，C端為半胱氨酸蛋白水解酶募集域[13]，研究表明，RIPK2在維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)或者調(diào)節(jié)脂肪代謝等方面發(fā)揮重要作用[14-15]。Ouyang等[11]前期對(duì)不同發(fā)育時(shí)期雞的骨骼肌進(jìn)行circRNA測(cè)序，通過(guò)對(duì)測(cè)序結(jié)果的分析篩選，發(fā)現(xiàn)circRIPK2在3個(gè)時(shí)期差異表達(dá)，因此推測(cè)circRIPK2可能在雞肌肉發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。本研究利用PCR擴(kuò)增、Sanger測(cè)序驗(yàn)證circRIPK2的存在，同時(shí)利用定量PCR、EdU試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)等探究circRIPK2對(duì)雞原代成肌細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

雞胚來(lái)源于珠海市裕禾農(nóng)牧有限公司。

主要試劑：DNA抽提試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自莫納生物科技有限公司；熒光定量PCR酶購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；環(huán)狀RNA過(guò)表達(dá)載體pCD2.5-ciR購(gòu)自吉賽生物科技有限公司；核質(zhì)分離試劑盒、FastDigestBamHI、FastDigestEcoRI購(gòu)自 Thermo 公司；RNAiso Plus購(gòu)自TAKARA公司；凝膠DNA小量回收試劑盒、低內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒均購(gòu)自Magen公司；轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 3000 購(gòu)自 Invitrogen 公司；Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基、RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、馬血清均購(gòu)自Gibco公司；EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 雞原代成肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 采集11胚齡雞胚的腿肌組織，用手術(shù)剪刀和鑷子剔除可見(jiàn)的骨骼和皮膚組織，剩余肌肉組織剪至肉糜狀，然后用胰蛋白酶在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化15～20 min，用完全培養(yǎng)基(體積分?jǐn)?shù)為20%的胎牛血清+體積分?jǐn)?shù)為79.5% 的RPMI+體積分?jǐn)?shù)為0.5%的青霉素、鏈霉素)終止消化。使用 70 μm 過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾后，1 500 r/min離心5 min，用完全培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行重懸、并接種到無(wú)菌培養(yǎng)皿中、差速貼壁2次，獲取純化的成肌細(xì)胞，細(xì)胞在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 circRIPK2 過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)circRNA的測(cè)序數(shù)據(jù)，通過(guò)Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)下載circRIPK2的基因序列，應(yīng)用DNASTAR軟件設(shè)計(jì)全長(zhǎng)序列的引物(表1)。通過(guò)PCR反應(yīng)獲得circRIPK2的全長(zhǎng)序列。使用FastDigestBamHI、FastDigestEcoRI酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及pCD2.5-ciR載體，酶切產(chǎn)物純化后利用T4連接酶連接、22 ℃ 條件下放置 1 h。取 10 μL 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化完成后涂板，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～14 h后挑取單克隆菌落培養(yǎng)，菌液鑒定后，送擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，比對(duì)circRIPK2基因序列和測(cè)序序列，選取結(jié)果吻合的單克隆菌落留用。

表 1 引物信息Table 1 Primers used in this study

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn) 當(dāng)原代成肌細(xì)胞密度 (顯微鏡視野下的細(xì)胞占比)超90%時(shí)，將細(xì)胞接種于12孔板，RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。12孔板細(xì)胞密度為70%～80%時(shí)，使用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)載體pCD2.5-circRIPK2和對(duì)照空載質(zhì)粒pCD2.5-ciR，轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)基，待貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞密度為90%～100%時(shí)，使用分化培養(yǎng)基(體積分?jǐn)?shù)為2%的馬血清+體積分?jǐn)?shù)為97.5%的RPMI+體積分?jǐn)?shù)為0.5%的青霉素、鏈霉素)誘導(dǎo)成肌細(xì)胞分化。

1.2.4 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 分別取100 mg不同胚齡和日齡的肌肉組織樣品，加入1 mL RNAiso Plus試劑后研磨勻漿。同時(shí)收集增殖分化不同時(shí)期的成肌細(xì)胞,用RNAiso Plus試劑吹打細(xì)胞，RNAiso Plus處理后進(jìn)行總RNA抽提，然后取0.5 μg總RNA，依據(jù)Monad反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將其反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?37 ℃ 2 min，55 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。以反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，RT-PCR)，PCR 反應(yīng)體系：上、下游引物各 0.3 μL、SYBR Green qPCR Mix 5 μL、cDNA 1 μL、雙蒸水 3.5 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)；溶解曲線(xiàn)程序?yàn)?5 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 1 s。以GAPDH作為內(nèi)參基因，檢測(cè)circRIPK2基因、細(xì)胞增殖相關(guān)標(biāo)記基因及肌分化標(biāo)志基因的表達(dá)。

1.2.5 EdU 試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)載體circRIPK2和pCD2.5-ciR，每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)，24 h后收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析細(xì)胞周期變化；轉(zhuǎn)染48 h后參考銳博EdU試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行孵育、固定、通透等處理，染色完成后加PBS緩沖液避光保存待用，在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 核質(zhì)定位分析 分離原代成肌細(xì)胞后用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)100% 時(shí)，使用核質(zhì)分離試劑盒回收細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)RNA，然后利用RTPCR技術(shù)檢測(cè)circRIPK2在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中的表達(dá)量。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 試驗(yàn)分組中每組包含3個(gè)重復(fù)，采用GraphPad Prism8軟件繪圖和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，2組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 circRIPK2的鑒定及細(xì)胞定位

用不同胚齡(11胚齡、16胚齡、1日齡)杏花雞腿肌進(jìn)行高通量測(cè)序，Ouyang等[11]鑒定發(fā)現(xiàn)了13 377個(gè)cricRNA，根據(jù)上述測(cè)序數(shù)據(jù)，本研究選取在3個(gè)時(shí)期差異表達(dá)的circRIPK2作為候選研究基因，描述了circRIPK2的成環(huán)來(lái)源示意圖(圖1)。針對(duì)RIPK2接頭序列預(yù)測(cè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)收斂引物、發(fā)散引物各1對(duì)(表1)，利用反轉(zhuǎn)錄后的cDNA、gDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示只有以cDNA為模板時(shí)，發(fā)散引物才可以擴(kuò)增出明亮的條帶(圖2)。同時(shí)Sanger測(cè)序結(jié)果顯示circRIPK2的環(huán)化位點(diǎn)真實(shí)存在(圖3)。使用核質(zhì)分離試劑盒，分別回收細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)RNA，采用RT-PCR對(duì)circRIPK2進(jìn)行細(xì)胞定位，結(jié)果(圖4)表明circRIPK2在核質(zhì)中均存在，其中細(xì)胞質(zhì)占比為72%，細(xì)胞核占比為28%。

圖 1 circRIPK2成環(huán)來(lái)源Fig.1 The biogenesis of circRIPK2

圖 2 circRIPK2收斂引物和發(fā)散引物的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of circHIPK2 by convergent primers and divergent primers

圖 3 circRIPK2發(fā)散引物擴(kuò)增片段測(cè)序結(jié)果Fig.3 Sanger sequencing result of PCR product amplified by divergent primers for circRIPK2

圖 4 circRIPK2在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中的分布Fig.4 Distribution of circRIPK2 in the nucleus and cytoplasm

2.2 circRIPK2的時(shí)空表達(dá)譜分析

以 11胚齡、16胚齡、1日齡小雞腿肌的cDNA作模板，通過(guò)RT-PCR技術(shù)比較不同胚齡circRIPK2的表達(dá)水平變化，發(fā)現(xiàn)circRIPK2在不同時(shí)期表達(dá)存在差異(圖5A)。同時(shí)，試驗(yàn)分析了circRIPK2在原代成肌細(xì)胞增殖分化不同時(shí)期的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)與成肌細(xì)胞密度約為50%的增殖期相比，分化期第1天至第6天circRIPK2的表達(dá)均顯著上調(diào)，在分化期第6天circRIPK2表達(dá)達(dá)到最高水平，這提示circRIPK2可能在細(xì)胞分化過(guò)程中起重要作用(圖 5B)。

圖 5 circRIPK2的時(shí)空表達(dá)譜分析Fig.5 Analysis of the expression of circRIPK2 at different stages

2.3 抑制原代成肌細(xì)胞增殖

在原代成肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)circRIPK2，利用RT-PCR技術(shù)證實(shí)過(guò)表達(dá)效果顯著(圖6A)，可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。轉(zhuǎn)染48 h后，和對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)circRIPK2的原代成肌細(xì)胞中p21的mRNA表達(dá)水平上調(diào)20%，而CyclinB2、Cyclin D1、CyclinD2和PCNA的mRNA表達(dá)水平分別下調(diào) 39%、22%、29%和45%(圖6B)。此外，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)細(xì)胞周期的影響(圖7、圖8)，結(jié)果表明過(guò)表達(dá)circRIPK2后，處于S期細(xì)胞顯著減少,處于G2/M期細(xì)胞顯著增多(圖8)；采用EdU染色檢測(cè)細(xì)胞增殖情況(圖9、圖10)，對(duì)EdU滲入細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)circ-RIPK2后，EdU滲入的細(xì)胞總數(shù)明顯低于對(duì)照組，細(xì)胞增殖水平受到抑制(圖10)。以上結(jié)果表明circ-RIPK2對(duì)成肌細(xì)胞的增殖過(guò)程具有顯著抑制作用。

圖 7 過(guò)表達(dá)circRIPK2對(duì)細(xì)胞周期的影響Fig.7 Effect of circRIPK2 overexpression on cell cycle progression of chicken primary myoblasts

圖 8 過(guò)表達(dá)circRIPK2后細(xì)胞周期的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.8 Statistical results of cell cycle after overexpression of circRIPK2

圖 9 EdU試驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)circRIPK2對(duì)雞原代成肌細(xì)胞增殖能力的影響Fig.9 Effect of circRIPK2 overexpression on the proliferation rate of chicken primary myoblast detected by EdU assay

圖 10 過(guò)表達(dá)circRIPK2后EdU試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.10 Statistical results of EdU assays after overexpression of circRIPK2

2.4 circRIPK2促進(jìn)原代成肌細(xì)胞分化

轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)載體pCD2.5-circRIPK2、pCD2.5-ciR至雞原代成肌細(xì)胞中，待細(xì)胞密度為90%～100%時(shí)，將培養(yǎng)基更換為分化培養(yǎng)基以誘導(dǎo)成肌細(xì)胞分化。誘導(dǎo)分化第2天提取細(xì)胞總RNA并進(jìn)行RT-PCR。試驗(yàn)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)circRIPK2后肌分化標(biāo)記基因MyHC、MYOG和Myomaker的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)39%、56%和25%(圖 11)。

圖 11 過(guò)表達(dá)circRIPK2后肌分化標(biāo)記基因表達(dá)量變化Fig.11 Expression changes of the myoblast differentiation marker genes after overexpression of circRIPK2

3 討論與結(jié)論

作為非編碼RNA家族的重要成員，circRNA廣泛參與基因表達(dá)調(diào)控和疾病發(fā)生過(guò)程[16-17]。有證據(jù)表明circRNA不但在動(dòng)物骨骼肌中例如牛骨骼肌、家禽骨骼肌、小鼠骨骼肌、豬骨骼肌等大量存在，而且具有較高的表達(dá)水平[11, 18-21]。這表明除了生肌調(diào)控因子、成肌增強(qiáng)因子、PAX家族等調(diào)控骨骼肌發(fā)育過(guò)程之外，circRNA在調(diào)控肌肉發(fā)育過(guò)程中也扮演重要角色[22-24]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌中的circRNA可通過(guò)作為miRNA海綿來(lái)調(diào)控骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育[25]。根據(jù)前期測(cè)序，本研究篩選出在3個(gè)時(shí)期差異表達(dá)的候選環(huán)狀RNA-circRIPK2，并且通過(guò)PCR和Sanger測(cè)序等技術(shù)驗(yàn)證circRIK2由RIPK2基因第4至第9外顯子反向剪切形成。RT-PCR發(fā)現(xiàn)circRIPK2在3個(gè)時(shí)期中差異表達(dá)，這提示circRIPK2可能在雞骨骼肌發(fā)育過(guò)程具有一定的調(diào)控作用。

有關(guān)circRNA對(duì)于成肌細(xì)胞的增殖已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道。在家禽骨骼肌中，RBFOX2基因的不同外顯子能夠環(huán)化形成circRBFOX2.2-3、circRBFOX2.2-4，兩者均可以吸附miR-1a、miR-206來(lái)調(diào)控雞成肌細(xì)胞增殖過(guò)程[11]。另外，在牛骨骼肌中發(fā)現(xiàn)，circLMO7可以充當(dāng)miR-378a-3p海綿，通過(guò)作為競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA來(lái)促進(jìn)成肌增殖[10]。在對(duì)circRIPK2研究中，我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)circRIPK2后，和對(duì)照組比較，對(duì)細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用的相關(guān)基因 (CyclinB2、CyclinD1、CyclinD2和PCNA)的mRNA表達(dá)水平顯著降低，然而對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用的標(biāo)記基因(p21)mRNA水平顯著上調(diào)。同時(shí)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、EdU試驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞周期的影響，結(jié)果也表明circRIPK2抑制成肌細(xì)胞的增殖。

circRNA除了調(diào)控肌肉細(xì)胞增殖，它對(duì)于肌肉細(xì)胞的分化也具有重要的作用。Li等[12]研究發(fā)現(xiàn)，circFGFR4在牛肌肉中高表達(dá)，它可以通過(guò)作為miR-107的分子海綿調(diào)控WNT3A的表達(dá)，從而間接促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化。在小鼠中circZfp609可以吸附miR-125b解除對(duì)下游靶基因BCLAF1的抑制作用，并且通過(guò)影響Myf5和MYOG的表達(dá)間接抑制成肌細(xì)胞的分化[26]。此外，在羊骨骼肌中，circFOXO3對(duì)成肌細(xì)胞的分化過(guò)程也具有抑制作用[27]。本試驗(yàn)表明過(guò)表達(dá)circRIPK2后，肌分化標(biāo)記基因MyHC、MYOG和Myomaker的mRNA表達(dá)水平上調(diào)，這證明過(guò)表達(dá)circRIPK2對(duì)成肌細(xì)胞的分化具有顯著抑制作用。

以上結(jié)果表明circRIPK2在骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有調(diào)控作用，然而circRIPK2參與骨骼肌調(diào)控的具體機(jī)制尚未闡釋?zhuān)写罄m(xù)進(jìn)一步探究。

研究表明circRIPK2在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，其中在細(xì)胞質(zhì)中的占比高于在細(xì)胞核中的占比，同時(shí)通過(guò)在雞原代成肌細(xì)胞過(guò)表達(dá)circRIPK2檢測(cè)相關(guān)標(biāo)記基因表達(dá)，證實(shí)circRIPK2可能通過(guò)抑制成肌細(xì)胞的增殖，正向調(diào)控成肌細(xì)胞分化進(jìn)程，從而參與骨骼肌調(diào)控過(guò)程。