Sirt1在銀屑病皮損中的表達(dá)及對連接蛋白表達(dá)的影響

吳軍陽，李維鑫

Sirt1（silent information regulator protein1）是體內(nèi)一種非常重要的組蛋白和非組蛋白去乙?；?，參與蛋白質(zhì)的去乙?；{(diào)控過程。目前研究發(fā)現(xiàn)，Sirt1參與了基因沉默、機(jī)體長壽、生物周期節(jié)律、能量代謝、新陳代謝以及應(yīng)激的調(diào)控等，在糖尿病、心血管疾病、慢性炎癥性肺部疾病、慢性腎臟疾病、神經(jīng)變性以及腫瘤等疾病的治療和預(yù)防中發(fā)揮重要的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Sirt1與皮膚疾病亦存在密切的關(guān)系[1]。本研究旨在探討Sirt1對銀屑病緊密連接蛋白和黏著連接蛋白表達(dá)的影響，探討其可能的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本采集 病例組：銀屑病皮損組織標(biāo)本來自昆山市第一人民醫(yī)院皮膚科經(jīng)臨床及組織病理確診的20例尋常性銀屑病患者。對照組：正常對照組皮膚組織標(biāo)本來自18例經(jīng)臨床檢查排除銀屑病及其他常見皮膚病的整形外科手術(shù)患者的正常皮膚組織。細(xì)胞培養(yǎng)：人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株（HaCaT細(xì)胞）（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

1.1.2 主要儀器和試劑 免疫組化DAB試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），兔抗人Sirt1抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），兔抗人緊密連接蛋白（ZO-1、occludin）抗體（美國Proteintech Group公司），兔抗人黏著連接蛋白（E-cadherin）抗體（美國Bioworld公司），兔抗人GAPDH抗體（美國Bioworld公司），山羊抗兔抗體（美國BIO-RAD公司），F(xiàn)luorChem FC2凝膠成像儀（美國 Alpha Innotech公司），瓊脂糖凝膠成象分析儀（美國BIO-RAD公司），酶標(biāo)儀（美國BioTek公司），培養(yǎng)板（美國Corning公司），DMEM培養(yǎng)基（上海英駿生物技術(shù)有限公司），胎牛血清（北京賽默飛生物化學(xué)制品有限公司），白藜蘆醇（美國Sigma公司），煙酰胺（美國Sigma公司），總RNA提取試劑盒（北京百泰克生物科技有限公司），cDNA合成試劑盒（北京百泰克生物科技有限公司），顯影液BeyoEcl plus（碧云天生物技術(shù)研究所），聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物為南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成。人Sirt1引物序列：正向引物5'-GCGATTGGGTACCGAGATAAC-3'，反向引物5'-GGCCTTGGAGTCCAGTCACTA-3'，GAPDH引物序列：正向引物5'-AGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3'，反向引物 5'-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3'。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測銀屑病皮損組織中Sirt1、ZO-1、occludin、E-cadherin的表達(dá)水平 取本院病理科已制備的銀屑病及正常對照組的皮膚組織石蠟切片，按免疫組化DAB試劑盒步驟操作：二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，檸檬酸鹽溶液微波爐高溫抗原修復(fù)，行內(nèi)源性過氧化物酶封閉，正常羊血清孵育，兔抗人一抗室溫孵育2 h，羊抗兔二抗孵育1 h，HPP標(biāo)記的鏈霉親和素孵育，DAB染色，梯度乙醇脫水，二甲苯溶液透明， 中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。以PBS一抗作空白對照，DAB染色后用蘇木素復(fù)染。棕褐色染色為陽性結(jié)果。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組 HaCaT細(xì)胞于含10%胎牛血清、100 U/ml青、鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。白藜蘆醇和煙酰胺濃度分別配置為100 mmol/L和1 mol/L。實驗分為3組：陰性對照組，白藜蘆醇組（Res組），煙酰胺組（Nic組）。

1.2.3 各組細(xì)胞RNA、蛋白質(zhì)收集 HaCaT細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，以3×108/L的密度接種到6孔培養(yǎng)板中，每孔3 ml。細(xì)胞生長至80%融合時，換同量的無血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。6 h后，Res組加入濃度為 100 mmol/L 的白藜蘆醇 3 μl，Nic組加入濃度為1 mol/L的煙酰胺3 μl，對照組不作任何處理。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，根據(jù)總RNA提取試劑盒的步驟提取RNA，檢測濃度，并根據(jù)cDNA合成試劑盒步驟反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｏ嗤椒ㄌ幚砀鹘M細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入裂解液，高速離心取上清，獲得蛋白，酶標(biāo)儀檢測各組蛋白濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 HaCaT細(xì)胞Sirt1基因（mRNA）表達(dá)測定 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測Sirt1的基因表達(dá)水平，以GAPDH作為內(nèi)參，將保存的cDNA以Sirt1、GAPDH正反向引物和擴(kuò)增混合物于PCR儀中擴(kuò)增為DNA。PCR的條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30次，最后72℃延伸2 min。以5 μl PCR的產(chǎn)物加1 μl 6×上樣緩沖液上樣，設(shè)置1%瓊脂糖凝膠電泳100 V 30 min，然后瓊脂糖凝膠成像分析儀拍照。采用ImageJ軟件檢測各組吸光度，比較mRNA表達(dá)量。

1.2.5 HaCaT細(xì)胞Sirt1、ZO-1、occludin、E-cadherin蛋白表達(dá)測定 蛋白質(zhì)印跡試驗（Western blotting）檢測Sirt1、ZO-1、occludin、E-cadherin蛋白表達(dá)水平。以GAPDH作為內(nèi)參，各組蛋白以每孔30 μg上樣行聚丙烯酰胺凝膠電泳，25 V半干式轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，置一抗（以封閉液1:1 000稀釋）中，4℃孵育過夜，TBST洗3×10 min，置生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗（以封閉液1:3 000稀釋）中室溫孵育2 h，TBST 洗 3×10 min，顯影液 BeyoEcl plus 外敷于FluorChem FC2凝膠成像儀曝光拍照。使用ImageJ軟件檢測吸光度，比較各組蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗重復(fù)3次后，采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用方差分析法比較Res組、Nic組與對照組間有無統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 Sirt1在銀屑病皮損組織中的表達(dá)與分布

在正常人皮膚組織中，Sirt1在表皮各層細(xì)胞均顯著高表達(dá)，而在銀屑病患者皮損中Sirt1各層表達(dá)量均有下降，且在顆粒層下降較明顯（圖1）。

圖1 Sirt1在正常人皮膚及銀屑病患者皮損中的表達(dá)與分布（SP法 ×100）

2.2 ZO-1、occludin、E-cadherin在銀屑病皮損中的表達(dá)與分布

與正常人皮膚組織相比，銀屑病患者皮損組織中緊密連接蛋白ZO-1、occludin和黏著連接蛋白E-cadherin表達(dá)量顯著升高，在表皮各層均顯著高表達(dá)（圖2）。

圖2 3種連接蛋白在正常人皮膚與銀屑病患者皮損中的表達(dá)與分布（SP法×100）

2.3 Sirt1在角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)與調(diào)控

分別使用Sirt1的特異性激活劑白藜蘆醇和抑制劑煙酰胺處理HaCaT細(xì)胞后，與對照組相比，激活劑Res組Sirt1表達(dá)水平均明顯增加（P＜0.05），而抑制劑Nic組Sirt1表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖3，圖4）。

圖3 3組HaCaT細(xì)胞Sirt1基因（mRNA）表達(dá)水平

圖4 3組HaCaT細(xì)胞的Sirt1蛋白表達(dá)水平

2.4 Sirt1表達(dá)對角質(zhì)形成細(xì)胞間連接蛋白的影響

激活劑白藜蘆醇和抑制劑煙酰胺處理細(xì)胞后，與對照組相比，Res組緊密連接蛋白ZO-1和occludin表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），而Nic組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。黏著連接蛋白E-cadherin在Res組表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05），而Nic組表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖5）。

圖5 3組HaCaT細(xì)胞各連接蛋白表達(dá)水平

3 討論

銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病，病程較長且易復(fù)發(fā)，其病因和發(fā)病機(jī)制至今未完全清楚，可能與感染、遺傳、免疫功能異常、內(nèi)分泌異常等因素有關(guān)[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者存在不同程度的皮膚屏障功能損傷，保濕修復(fù)皮膚屏障功能已成為治療銀屑病的重要輔助治療方法[3]。銀屑病皮損角質(zhì)形成細(xì)胞中，角蛋白及細(xì)胞間脂質(zhì)均異常表達(dá)[4]。研究表明，銀屑病患者存在構(gòu)成細(xì)胞間緊密連接和黏著連接的連接蛋白表達(dá)和分布異常，與正常表皮相比，緊密連接蛋白（如ZO-1、occludin、Cldn-4）其表達(dá)范圍明顯增大，除顆粒層外，在棘層等其他層均較高表達(dá)[5]。

緊密連接蛋白和黏著連接蛋白是構(gòu)成角質(zhì)形成細(xì)胞間連接的重要組成部分，參與維持皮膚的屏障功能。緊密連接蛋白和黏著連接蛋白的調(diào)控主要受基因和外部環(huán)境因素影響，其中環(huán)境因素誘導(dǎo)的組蛋白乙?；腿ヒ阴；磻?yīng)是一種重要的表觀遺傳調(diào)節(jié)方式，可以通過調(diào)控特定基因表達(dá)水平來影響皮膚連接蛋白的表達(dá)。Sirt1是體內(nèi)一種非常重要的組蛋白和非組蛋白去乙?；福瑓⑴c蛋白翻譯后的去乙?；揎椷^程。在這過程中，Sirt1在細(xì)胞染色質(zhì)水平，通過誘導(dǎo)組蛋白去乙?；瘉碚{(diào)控包括染色質(zhì)重組、轉(zhuǎn)錄活化或抑制、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化及細(xì)胞凋亡等一系列生物學(xué)效應(yīng)，特別是與細(xì)胞活化后的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控有關(guān)。Sirt1屬于Ⅲ型去乙?；?，其發(fā)揮去乙?；?yīng)必須依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的作用。Sirt1被NAD+激活后，使組蛋白和非組蛋白的賴氨酸殘基脫去乙?；a(chǎn)生O-乙?；?ADP核糖和煙酰胺，從而產(chǎn)生一系列的調(diào)節(jié)效應(yīng)[6]。Sirt1主要通過與P53、NF-κB、FOXO、MEF2、MyoD、PPAR-γ、PGC-1α、eNOS 等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，發(fā)揮去乙?；?yīng)而產(chǎn)生機(jī)體長壽、能量代謝、炎癥、應(yīng)激以及腫瘤的調(diào)控等作用。

目前已有研究表明，Sirt1與銀屑病存在密切的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，在銀屑病皮損組織中Sirt1水平明顯下降[7,8]；Sirt1激活劑SRT2014對銀屑病患者取得了良好的組織學(xué)改善[9]。盡管目前對銀屑病的Sirt1及連接蛋白均有研究，然而銀屑病皮損中Sirt1與皮膚緊密連接蛋白和黏著連接蛋白是否有相關(guān)性還不是很清楚，尚未檢索到相關(guān)文獻(xiàn)報道。本實驗論證了Sirt1與連接蛋白的直接關(guān)系，實驗中以Sirt1及文獻(xiàn)中常使用的緊密連接蛋白ZO-1、occludin，黏著連接蛋白E-cadherin作為檢測指標(biāo)，首先采用免疫組化技術(shù)檢測Sirt1、ZO-1、occludin、E-cadherin在銀屑病同一皮損中的表達(dá)與分布情況，推測其之間的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與人正常皮膚組織相比，Sirt1在銀屑病患者皮損組織中表達(dá)水平下降，而緊密連接蛋白ZO-1、occludin，黏著連接蛋白E-cadherin表達(dá)均顯著增高。緊密連接蛋白ZO-1、occludin、黏著連接蛋白E-cadherin表達(dá)增高可能與Sirt1表達(dá)水平下降有關(guān)。為了進(jìn)一步證實Sirt1與連接蛋白表達(dá)的相關(guān)性，本實驗選用Sirt1的特異性激活劑白藜蘆醇和抑制劑煙酰胺對HaCaT細(xì)胞進(jìn)行研究。白藜蘆醇是Sirt1的特異性激活劑，其特異性、敏感性較強(qiáng)，具有抗炎、抗增殖、抗氧化及緩解皮膚光老化等功能[10]。而煙酰胺是Sirt1的抑制劑，其為Sirt1的產(chǎn)物，可通過負(fù)反饋作用抑制Sirt1的活性。研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇可激活Sirt1的表達(dá)，且在Sirt1作用下，HaCaT細(xì)胞的緊密連接蛋白ZO-1、occludin及黏著連接蛋白E-cadherin表達(dá)均顯著下降。而煙酰胺不能明顯抑制Sirt1的表達(dá)，對緊密連接蛋白和黏著連接蛋白無效應(yīng)或作用較弱，其可能與煙酰胺的抑制效應(yīng)有關(guān)，煙酰胺主要通過負(fù)反饋效應(yīng)來發(fā)揮抑制Sirt1的作用，其抑制效應(yīng)不顯著。

在銀屑病皮損組織中，連接蛋白ZO-1、occludin、E-cadherin表達(dá)范圍及表達(dá)量異常增多，Sirt1 對其的下調(diào)作用有希望成為銀屑病治療的靶點。Sirt1如何作用于連接蛋白，其具體的信號通路等還需要作進(jìn)一步研究。