實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合濃縮涂片染色法快速診斷結(jié)核病的效果

李 喬，吳 健，陳澤城

（高州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 高州 525200）

防治結(jié)核病是全球面臨的公共衛(wèi)生問題。大量的研究表明，盡早地對結(jié)核病患者的病情進(jìn)行診治是控制其病情發(fā)展的關(guān)鍵[1-3]。目前，臨床上常采用直接涂片染色法、改良羅氏培養(yǎng)法、MGIT-960 培養(yǎng)法等對結(jié)核病患者的病情進(jìn)行診斷。本文主要是探討用Real-time PCR 擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合濃縮涂片染色法快速診斷結(jié)核病的效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本文的研究對象是2016 年6 月至2020 年6 月期間高州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科收到的526 份分泌物標(biāo)本。在這526份分泌物標(biāo)本中，痰液標(biāo)本有427 份，支氣管沖洗液標(biāo)本有37 份，尿液標(biāo)本有25 份，胸腹液標(biāo)本有25 份，膿液標(biāo)本有5 份，腦脊液標(biāo)本有2 份，心包液標(biāo)本有2 份，組織標(biāo)本有2 份，精液標(biāo)本有1 份。

1.2 方法

采用直接涂片染色法進(jìn)行病原體檢測的方法是：按照《痰涂片鏡檢質(zhì)量保證手冊》的要求，將分泌物標(biāo)本均勻地涂抹在載玻片上，并進(jìn)行抗酸染色操作[4]。染色完畢后，將載玻片放置于顯微鏡下進(jìn)行檢查。采用Real-time PCR 擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合濃縮涂片染色法進(jìn)行病原體檢測的方法是：將5 ～10 mL 的分泌物標(biāo)本放置在50 mL 離心管中。按照《結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》及BACTEC MAGIT-960 操作規(guī)程進(jìn)行堿消化濃縮操作[5]。在沉渣中加入0.7 ～1 mL 的PBS緩沖液（pH=6.8），制成混合液。對該混合液進(jìn)行離心處理，制成離心沉渣懸浮液。將0.1 mL 的離心沉渣懸浮液加入到DNA 提取管中，將0.5 mL 的離心沉渣懸浮液加入到BACTEC MGIT-960 培養(yǎng)管中，取0.1 mL 離心沉渣懸浮液制成規(guī)格為10 mm×10 mm 的載玻片，然后，按照結(jié)核分歧桿菌核酸擴(kuò)增熒光檢測試劑說明書的要求，將DNA 提取管、BACTEC MGIT-960 培養(yǎng)管及載玻片分別放置在達(dá)安760 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（生產(chǎn)企業(yè)為中山大學(xué)達(dá)安公司）中。按照中國防癆協(xié)會制定的《結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》，對陽性菌株進(jìn)行菌種鑒定[6]。根據(jù)《痰涂片鏡檢質(zhì)量保證手冊》的要求，對采用直接涂片染色法、濃縮涂片染色法進(jìn)行病原體檢測的結(jié)果進(jìn)行判定。按照結(jié)核分歧桿菌核酸擴(kuò)增熒光檢測試劑說明書的要求，對采用Real-time PCR技術(shù)聯(lián)合濃縮涂片染色法進(jìn)行病原體檢測的結(jié)果進(jìn)行判定。根據(jù)BACTEC MGIT-960 全自動分歧桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)出具的陽性報(bào)告，對陽性菌株進(jìn)行菌種鑒定。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察采用BACTEC MGIT-960 培養(yǎng)法、直接涂片染色法、Real-time PCR 擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合濃縮涂片染色法對這526份分泌物標(biāo)本進(jìn)行病原體檢測的時(shí)間、結(jié)核分枝桿菌的檢出率及用Real-time PCR 擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合濃縮涂片染色法診斷結(jié)核病的靈敏度、特異度及準(zhǔn)確率。敏感度=真陽性例數(shù)/（真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%。特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+ 假陽性例數(shù)）×100%。準(zhǔn)確率=（真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù)）/（真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對本次研究中的數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 采用不同的方法對526 份分泌物標(biāo)本進(jìn)行病原體檢測的情況

與采用直接涂片染色法相比，采用MGIT-960 培養(yǎng)法、Real-time PCR 擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合濃縮涂片染色法對526 份分泌物標(biāo)本進(jìn)行病原體檢測時(shí)結(jié)核分枝桿菌的檢出率更高，P＜0.05。與采用MGIT-960 培養(yǎng)法相比，采用直接涂片染色法、Realtime PCR 擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合濃縮涂片染色法對526 份分泌物標(biāo)本進(jìn)行病原體檢測的時(shí)間更短，P＜0.05。詳見表1。

表1 采用不同的方法對526 份分泌物標(biāo)本進(jìn)行病原體檢測的情況

2.2 采用Real-timePCR 擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合濃縮涂片染色法診斷結(jié)核病的靈敏度、特異度及準(zhǔn)確率

采用Real-time PCR 擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合濃縮涂片染色法對526 份分泌物標(biāo)本進(jìn)行病原體檢測的結(jié)果顯示，真陽性患者有140 例，真陰性患者349 有例，假陽性患者有21 例，假陰性患者有16 例。采用Real-time PCR 擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合濃縮涂片染色法診斷結(jié)核病的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確率分別為89.7%、94.3%、93.0%。詳見表2。

表2 采用Real-time PCR 擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合濃縮涂片染色法診斷結(jié)核病的靈敏度、特異度及準(zhǔn)確率（%）

3 討論

目前，臨床上常采用直接涂片染色法、BACTEC MGIT-960 培養(yǎng)法等對結(jié)核病患者的分泌物標(biāo)本進(jìn)行病原體檢測。采用直接涂片染色法對結(jié)核病患者的分泌物標(biāo)本進(jìn)行病原體檢測具有簡便快捷、檢查費(fèi)用低的特點(diǎn)。但用此法對結(jié)核病患者病情進(jìn)行診斷的敏感度、特異度均較低。在臨床上，采用BACTEC MGIT-960 培養(yǎng)法進(jìn)行病原體檢測的結(jié)果是診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)。有研究表明，采用BACTEC MGIT-960 培養(yǎng)法對結(jié)核病患者病情進(jìn)行診斷的效率較低，患者需要等待1 ～2 個(gè)月才能夠得到檢查的結(jié)果[7]。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于結(jié)核病的快速診斷中[8]。Real-time PCR 擴(kuò)增技術(shù)基于TaqMan 熒光探針原理，可通過檢測熒光信號的強(qiáng)弱計(jì)算PCR 產(chǎn)物的數(shù)量。濃縮涂片染色法具有可直接觀察到抗酸桿菌的特點(diǎn)。陳昕昶等[9]的研究表明，采用Real-time PCR 擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合濃縮涂片染色法對結(jié)核病患者的分泌物標(biāo)本進(jìn)行病原體檢測，既可簡化檢驗(yàn)的流程，又可大大地縮短進(jìn)行檢測的時(shí)間。

綜上所述，用Real-time PCR 擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合濃縮涂片染色法可快速對結(jié)核病患者的病情進(jìn)行診斷，且準(zhǔn)確率較高。