UHPLC-MS/MS 測定人血漿中尿嘧啶與二氫尿嘧啶的濃度

童 萃，陳 順，王志鵬，高守紅 （海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200003）

嘧啶類化療藥物在腫瘤治療中的地位越來越重要，其代表藥物5-氟尿嘧啶及其口服前藥卡培他濱更受到了廣泛關(guān)注，體內(nèi)二氫尿嘧啶脫氫酶(DPD)是此類藥物代謝的限速酶之一[1]，前瞻性評價DPD 的總體活性有利于提高藥物療效及減少患者的毒副反應(yīng)，對臨床具有重要意義。內(nèi)源性物質(zhì)尿嘧啶(U)是體內(nèi)DPD 的天然底物，在此酶的催化下生成二氫尿嘧啶(UH2)，并最終通過尿液排出體外。測定血漿中U 和UH2的含量，并通過(UH2)/(U)比值計算，可從代謝物的角度評價DPD 的活性[2]。臨床上常用評價DPD 酶活性的方法是測定患者的基因表型，DPD 的編碼基因DPYD 序列中包含了多達7 600 個多態(tài)位點，使得DPD 酶的活性在人群中是高度可變的[3]。不同的突變位點及不同位點的組合給臨床檢測帶來了極大的困難。到目前為止，也只有DPYD*2A 的多態(tài)性被用于臨床實踐，用來篩選出5-氟尿嘧啶代謝嚴重不良的患者，避免嚴重的毒副反應(yīng)[4]。單一應(yīng)用基因的多態(tài)性來評價DPD 酶的活性在臨床上存在一定的困難，基因的多態(tài)性并不能直接同下游的酶的活性聯(lián)系起來，兩者并沒有完全對等的關(guān)系。基因需通過轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白的修飾之后才能發(fā)揮作用?；蚨鄳B(tài)聯(lián)合下游代謝物的含量測定更能準確的評價DPD 酶的活性[5]。目前常應(yīng)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法對人血漿或干燥唾液中U 和UH2濃度進行檢測[6-11]，但所報道的方法均有一些復(fù)雜或難以重現(xiàn)。本研究成功的建立了一種靈敏、高效、準確、重現(xiàn)性好，且能同時測定人血漿中U 和UH2濃度的UHPLCMS/MS 方法，為體內(nèi)DPD 總體活性提供更客觀有效的評價途徑。

1 材料與方法

1.1 儀器與耗材

1 290-6460A 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，包含G4220A 二元泵、G4226A 自動進樣器、G1316C柱溫箱、MassHunter 數(shù)據(jù)處理工作站（美國Agilent）；調(diào)速渦旋混合器（美國Labnet）；SK7200H 超聲儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；BSA124S-CW 分析天平（德國賽多利斯）；5810R 型低溫高速離心機、移液器（德國Eppendorf 公司）。

1.2 藥品與試劑

尿嘧啶、二氫尿嘧啶和氯尿嘧啶（內(nèi)標）對照品（純度>99%,大連美侖生物有限公司）；乙酸銨（美國賽默飛世爾科技）；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、異丙醇（色譜純，德國默克公司）；屈臣氏蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；牛血清白蛋白（BSA）(上海博光生物科技有限公司)；生理鹽水（長征醫(yī)院藥學(xué)部自制）。

1.3 色譜分離條件

色譜柱為Agilent poroshell 120 SB-Aq-柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm），流動相為5 mmol/L 乙酸銨水溶液(A)和乙腈(B)，流速為0.3 ml/min，梯度洗脫：0～0.3 min，100% A；0.3～1.0 min，100%～10% A；1.0～2.5 min，10% A；柱溫為30 ℃，洗脫時間2.5 min，進樣量5 μl。

1.4 質(zhì)譜分離條件

采用ESI 離子源，多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）進行一/二級質(zhì)譜分析，用于定量分析的檢測離子為：U[M+H]+m/z113.0→40.1，檢測模式為正離子模式；UH2[M+H]+m/z115.0→55.1，檢測模式為正離子模式；氯尿嘧啶（IS）[M-H]-m/z145.0→42.1，檢測模式為負離子模式。霧化溫度為300 ℃，霧化氣壓力為40 psi，干燥氣流速為10 L/min，鞘氣溫度300 ℃，鞘氣流速12 L/min，解離電壓為4 000 V。

1.5 樣本采集

選取8 名血漿樣品指標正常的成年人，于當日清晨8 時空腹狀態(tài)下靜脈采血3 ml, EDTA-3K 管抗凝，離心后分離上層血漿, 于?80 ℃冰箱凍存。

1.6 樣本預(yù)處理

取100 μl 樣本，加10 μg/ml 氯尿嘧啶（IS）10 μl，加乙酸乙酯3 ml，渦旋5 min，1 710×g離心10 min，取上層有機相2.7 ml，45 ℃氮氣揮干儀揮干，用10%甲醇溶液100 μl 復(fù)溶，渦旋1 min，取上清液進樣分析。

1.7 標準溶液配制

用含有3 %牛血清白蛋白作為空白基質(zhì)代替血漿配置標準曲線樣品。取100 μg/ml 的尿嘧啶和二氫尿嘧啶各100 μl，加800 μl 水，制成10 μg/ml標準混合液，置于?20 ℃?zhèn)溆谩Ｈ?0 μg/ml 標準混合液適量，用3 %牛血清白蛋白稀釋制成10、20、50、100、200、500、1 000、1 500 ng/ml 系列濃度樣品, 然后按照上述“1.6”項下樣品的處理方法配制。

2 結(jié)果

2.1 專屬性考察

U 和UH2的出峰時間以及峰型良好，代替血漿經(jīng)過前處理后，對待測組分的測定沒有干擾，內(nèi)標對分析物的測定也沒有干擾，且能很好分離，結(jié)果見圖1。

圖1 尿嘧啶和二氫尿嘧啶及內(nèi)標質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖

2.2 標準曲線和線性范圍

U 和UH2的線性范圍是10.0～1 500.0 ng/ml，以空白BAS 中U 和UH2的濃度為橫坐標（X），U和UH2與內(nèi)標化合物氯尿嘧啶的峰面積比為縱坐標（Y），進行最小二乘法加權(quán)（權(quán)重系數(shù)為1/χ2），U 和UH2的線性回歸方程分別是Y=0.27X+0.002 2、Y=0.58X+0.038 0，r均>0.990，表明線性關(guān)系良好。

2.3 精密度和準確度

取定量下限、低、中、高標準添加血漿樣本按照前處理方法進行處理，每個濃度樣品平行制備5 份進行分析，連續(xù)3 d 重復(fù)操作，根據(jù)當天的標準曲線計算當天實測樣本濃度，計算樣本在低、中和高濃度下的日內(nèi)、日間精密度和準確度，結(jié)果顯示，精密度和準確度的偏差均在15%左右。準確度相對偏差在20%范圍內(nèi)時，最低定量下限精密度偏差不大于20%，結(jié)果見表1。

表1 尿嘧啶和二氫尿嘧啶的精密度 (n=5)

2.4 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

取低、高2 個濃度的樣本進行基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率考察，結(jié)果顯示，U、UH2及內(nèi)標氯尿嘧啶的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率良好，結(jié)果均較穩(wěn)定，結(jié)果見表2。

表2 尿嘧啶和二氫尿嘧啶的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

2.5 樣品穩(wěn)定性

考察低、高2 個濃度的血漿樣品經(jīng)歷3 次冷凍與解凍循環(huán)的穩(wěn)定性、血漿樣品在室溫（25 °C）放置6 h 后經(jīng)樣品處理后穩(wěn)定性和血漿樣品經(jīng)樣品處理后室溫放置24 h 的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，3 次凍融、6 h室溫（25 °C）條件下和24 h 放置自動進樣器中的穩(wěn)定性均符合要求，結(jié)果見表3。

表3 樣品的穩(wěn)定性(RE%)

2.6 樣本檢測

應(yīng)用本研究所建立的方法，對8 名健康成人的血漿樣本測定分析，在樣本實測過程中, 同時插入已知濃度的隨行質(zhì)控樣本(QC 樣本), 隨時監(jiān)控樣本測定的準確度。U 和 UH2濃度測定結(jié)果見圖2。

圖2 實測8 名健康成人內(nèi)源性U 和UH2 濃度值

3 討論

3.1 空白基質(zhì)的選擇

U 和UH2是人體內(nèi)常見的兩種物質(zhì)，且同核酸的代謝密切相關(guān)，由于U 和UH2均為人體內(nèi)源性物質(zhì)，故不能采用人源的基質(zhì)進行方法學(xué)的開發(fā)及驗證，通過查閱資料，選擇了不含U 和UH2的3%牛血清蛋白作為基質(zhì)進行方法學(xué)的開發(fā)[12]。也有文獻報道采用去除U 和UH2的人源血漿基質(zhì)進行方法學(xué)實驗[9]，但基質(zhì)的來源較珍貴，不適合方法的普及，所以選用3%牛血清蛋白作為替代基質(zhì)。

3.2 色譜柱的選擇

U 因其特殊的化學(xué)性質(zhì)，在大部分的色譜柱上均沒有保留。U 和UH2的LogP值分別為?0.707和?0.840，有較強的親水性，決定了其不保留的性質(zhì)。在定量方法的開發(fā)過程中，先后采用了Agilent Zorbax SB-C18色譜柱， Agilent Zorbax Eclipse-C18色譜柱，Waters Atlantis T3色譜柱，Waters Xselect 色譜柱，Waters Xbridge 等色譜柱來進行條件摸索，但上述色譜柱對U 和UH2均沒有保留。最后，采用Agilent Zorbax SB-Aq 對U 和UH2進行定量分析，該色譜柱對強極性的化合物有較好的保留效果，同時，兼容100%的起始流動相也對保留產(chǎn)生了良好的結(jié)果。

3.3 樣本預(yù)處理的優(yōu)化

本研究還分別考察了幾種常見的處理方法，包括甲醇和乙腈的蛋白沉淀、Waters Oasis HLB 萃取板的固相萃取以及乙酸乙酯，甲基叔丁基醚，二氯甲烷/三氯甲烷，環(huán)己烷進行的液液萃取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯對U 和UH2的萃取效果較好，同時，還分別考察了5%、10%、20%、30%、40%、50%的異丙醇、乙酸乙酯溶液對U 和UH2的萃取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單純的乙酸乙酯對待測化合物具有較好的提取效率。提取回收率均高于90%，且RSD<10%。另外對3%牛血清蛋白的基質(zhì)效應(yīng)進行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)平均基質(zhì)效應(yīng)在85%～101%之間，RSD<7%，說明該前處理方法對于基質(zhì)的清除較為徹底，測定結(jié)果穩(wěn)定，沒有明顯的基質(zhì)干擾。

本研究雖重在方法開發(fā)，收集的樣本數(shù)量較少，但從測定的U 和UH2濃度分布來看DPD 對內(nèi)源性U 的代謝存在個體差異，建議臨床應(yīng)用5-氟尿嘧啶及其卡培他濱篩查DPD 總體活性[12-13]，后續(xù)可進一步擴大樣本數(shù)量進行深入研究。

4 結(jié)論

本實驗建立了一種快速，穩(wěn)定，高靈敏度的UHPLC-MS/MS 方法，可用于測定人體內(nèi)源性物質(zhì)U 和UH2的含量，從代謝物的角度評價DPD 酶的活性，從而協(xié)助臨床醫(yī)生制定化療藥物5-氟尿嘧啶及其口服前藥卡培他濱合理的用量，以較低的毒副反應(yīng)獲得最大的臨床療效。