黃芪甲苷通過抑制MerTK緩解阿霉素引起的心臟毒性

王雪麗，陳亞男，黃厚芹，劉岳鵬，許 瑾，何學(xué)明

腫瘤發(fā)病率逐年升高[1]，化療作為一種強(qiáng)而有效的治療手段被廣泛應(yīng)用于腫瘤治療。阿霉素作為一種高效、廣譜的蒽環(huán)類抗癌藥，可用于治療成人以及兒童的多種實體腫瘤(如乳腺、卵巢和胃腸道腫瘤)和血液惡性腫瘤(如淋巴瘤和白血病)，然而，因阿霉素可引起劑量依賴性的心臟毒性，導(dǎo)致嚴(yán)重心肌病和充血性心力衰竭，嚴(yán)重限制了其在臨床上的應(yīng)用[2]，因此老年腫瘤病人及有嚴(yán)重心臟病者屬限制性用藥，克服阿霉素的心臟毒性將有助于擴(kuò)寬阿霉素的適用人群。

黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ，AST Ⅳ)是中藥黃芪主要的有效成分，具有抗癌、抗氧化、抗老化、抗炎等多種效應(yīng)[3]。AST Ⅳ具有明顯的心臟保護(hù)作用，主要表現(xiàn)為抑制心臟重構(gòu)、改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、保護(hù)心肌缺血以及抑制心肌細(xì)胞凋亡等[4]。已有研究[5]表明，AST Ⅳ能緩解柯薩奇病毒B3感染引起的以嚴(yán)重的心臟炎癥為特征的病毒性心肌炎。AST Ⅳ的心臟保護(hù)作用的機(jī)制尚不明確。Mer酪氨酸激酶(Mer tyrosine kinase，MerTK)是TAM受體酪氨酸激酶家族成員之一。MerTK缺乏已被證明在動脈粥樣硬化模型中是有害的，因為它具有抑制炎癥，促進(jìn)分解和驅(qū)動斑塊壞死核心中凋亡小體清除的能力[6]。我們的預(yù)實驗提示AST Ⅳ能夠維持MerTK的水平，因此提出假說，AST Ⅳ可能通過抑制MerTK裂解從而緩解阿霉素引起的心肌損傷。本研究旨在探究AST Ⅳ對阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷的保護(hù)作用，以及MerTK是否在其中發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性6周齡ICR小鼠(18～22 g)，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。實驗過程中對動物處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。鹽酸多柔比星購自深圳萬樂藥業(yè)有限公司，AST Ⅳ購自成都曼斯特有限公司，羧甲基纖維素鈉購自上海生物工程有限公司，Masson染色試劑盒購自福建邁新公司，p-MerTK抗體購自Abcam公司，白細(xì)胞介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin 6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)ELISA試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。小動物心電圖機(jī)(BL-420S生物機(jī)能實驗系統(tǒng))，AU5800型全自動生化分析儀(美國BeckmanCoulter公司)。

1.2 實驗動物 50只小鼠隨機(jī)分成對照組、阿霉素組(DOX組)、DOX+AST Ⅳ20 mg/kg組、DOX+AST Ⅳ40 mg/kg組、DOX+AST Ⅳ 80 mg/kg組，每組10只，觀察小鼠精神狀態(tài)和存活率改善情況以進(jìn)行AST Ⅳ劑量的篩選。隨后，30只小鼠隨機(jī)分為對照組、DOX組、DOX+AST Ⅳ 80 mg/kg組，每組10只。給予ICR小鼠阿霉素20 mg/kg單次腹腔注射制備阿霉素急性心臟毒性模型，對照組給予0.9%氯化鈉溶液。將AST Ⅳ用0.5%羧甲基纖維素鈉配置成2 mg/mL混選液，給予小鼠灌胃，對照組與DOX組給予0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃。于造模前1 d給予AST Ⅳ 80 mg/kg灌胃預(yù)處理，造模當(dāng)天記為第0天，繼續(xù)給藥10 d，每天1次。

1.3 心電圖監(jiān)測、高分辨率小鼠超聲監(jiān)測心功能 于造模后第10天，每組各取3只，給小鼠備皮，運用氣麻機(jī)麻醉小鼠(麻醉藥為異氟烷)，將小鼠放置于檢測臺上。四肢涂抹導(dǎo)電凝膠，心電圖機(jī)監(jiān)測小鼠心電圖，高分辨率小鼠超聲監(jiān)測心臟射血分?jǐn)?shù)(EF)和縮短分?jǐn)?shù)(FS)。

1.4 心臟Masson染色 于造模后第10天，每組各取3只，迅速暴露小鼠心臟，用40 g/L多聚甲醛經(jīng)左心室灌注，心固定24 h后，加入400 g/L蔗糖脫水，冰凍切片，Masson染色(參照試劑盒說明書)，顯微鏡下觀察。

1.5 血液樣品制備 于造模后第10天，每組各取3只，收集小鼠靜脈血，每只500～600 μL，冰上靜置后放入4 ℃離心機(jī)中，3 000 r/min離心10 min，分離上清。使用全自動血清生化儀檢測血清中肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)含量(試劑盒購自浙江伊利康生物技術(shù)有限公司)；通過酶聯(lián)免疫吸附法測定IL-1β、IL-6和TNF-α水平(試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.6 組織蛋白樣品制備以及心臟組織MerTK蛋白表達(dá)的檢測 于造模后第10天，每組各取3只，用40 g/L水合氯醛0.4 mL/20 g麻醉并處死小鼠，用眼科剪開胸取心，將其放入預(yù)冷PBS中，將心臟中的血液輕輕擠壓漂洗干凈血液，用濾紙吸干水份。心臟組織置于凍存管后，存放于液氮中速凍。將樣本移入專用組織破碎管中，每10 mg樣本中加入100 μL含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液，并放入適量磁珠，放入破碎儀中勻漿2～3次，直到組織塊消失。冰上靜置1 h，待組織樣本充分裂解。使用預(yù)冷的4 ℃離心機(jī)，15 000 r/min離心10 min。取上清液，并且用BCA法測蛋白濃度。放入-80 ℃?zhèn)溆?。蛋白樣品與5×蛋白上樣緩沖液按4∶1比例混合，渦旋混勻，100 ℃水浴中加熱5 min。每個泳道加30 μg蛋白樣品，通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，并電泳轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，室溫封閉60 min，加入按1∶1 000稀釋的p-MerTK抗體，4 ℃過夜。TBST洗膜后再以辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔源IgG室溫孵育2 h。ECL底物發(fā)光顯色1 min，應(yīng)用Image J軟件對條帶進(jìn)行灰度分析，目的蛋白條帶和內(nèi)參GAPDH條帶的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況與存活率 對照組小鼠精神狀態(tài)良好，進(jìn)食情況正常；DOX組、DOX+AST Ⅳ 20 mg/kg組、DOX+AST Ⅳ 40 mg/kg組出現(xiàn)精神萎靡不振、中度腹瀉等癥狀；DOX+AST Ⅳ 80 mg/kg組小鼠精神狀態(tài)尚可，有輕度腹瀉的癥狀。造模第10天，對照組小鼠存活10只，DOX組小鼠存活3只，DOX+AST Ⅳ 20 mg/kg組小鼠存活3只，DOX+AST Ⅳ 40 mg/kg組小鼠存活4只，DOX+AST Ⅳ 80 mg/kg組小鼠存活6只。DOX組小鼠死亡率高；DOX+AST Ⅳ 80 mg/kg組第10天小鼠存活率明顯改善；DOX+AST Ⅳ 20 mg/kg組、DOX+AST Ⅳ 40 mg/kg組第10天小鼠存活率低，且精神狀態(tài)欠佳。因此，其他實驗中AST Ⅳ劑量為80 mg/kg。

2.2 AST Ⅳ改善阿霉素引起的心電圖異常 與對照組相比，DOX組小鼠心率明顯減慢、QT間期明顯延長(P<0.01)；與DOX組相比，DOX+AST Ⅳ 80mg/kg組小鼠QT間期明顯縮短(P<0.01)，心率改善幾乎達(dá)到正常水平(見表1)。

表1 AST Ⅳ改善阿霉素引起的小鼠心電異常

2.3 AST Ⅳ改善阿霉素引起的超聲心動圖異常 與對照組相比，DOX組小鼠EF和FS均明顯降低(P<0.01)；與DOX組相比，DOX+AST Ⅳ 80 mg/kg組小鼠EF、FS下降程度明顯改善(P<0.01)(見表2)。

表2 3組小鼠心臟超聲心動圖檢查結(jié)果

2.4 AST Ⅳ改善阿霉素引起的心肌酶改變 與對照組相比，DOX組CK-MB和LDH含量均明顯增加(P<0.01)；與DOX組相比，DOX+AST Ⅳ 80 mg/kg組CK-MB和 LDH含量均明顯降低 (P<0.01)(見表3)。

表3 AST Ⅳ改善阿霉素引起的心肌酶改變

2.5 心肌形態(tài)學(xué)Massson染色結(jié)果 Massson染色結(jié)果顯示，與對照組相比，DOX組小鼠心肌細(xì)胞間質(zhì)出現(xiàn)嚴(yán)重纖維化(藍(lán)色部分)；與DOX組相比，DOX+AST Ⅳ 80 mg/kg組小鼠心肌纖維化面積明顯減少(藍(lán)色部分)(見圖1)。

2.6 AST Ⅳ通過抑制MerTK裂解緩解阿霉素引起的心臟毒性 與對照組相比，DOX組p-MerTK的蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)；與DOX組相比，DOX+AST Ⅳ 80 mg/kg組p-MerTK的表達(dá)水平明顯下降(P<0.01)(見圖2、表4)。

表4 各組p-MerTK蛋白表達(dá)比較

2.7 AST Ⅳ緩解阿霉素引起炎癥 與對照組相比，DOX組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯升高(P<0.01)；與DOX組相比，DOX+AST Ⅳ 80 mg/kg組IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯下降(P<0.01)(見表5)。

表5 各組炎癥指標(biāo)水平比較

3 討論

蒽環(huán)類化療藥物阿霉素顯著提高了癌癥病人的生存率；但是，許多病人遭受阿霉素引起的心臟毒性，以劑量依賴性方式引起不可逆性心肌病，如左心功能不全和心力衰竭，降低了病人的生存質(zhì)量[7]。右丙亞胺是FDA批準(zhǔn)用于治療阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性的唯一藥物，然而其也具有很大的不良反應(yīng)，如骨髓抑制和干擾阿霉素活性[8]。因此，尋找緩解化療性心臟病新的治療方案極其迫切。本研究顯示在給予化療藥物后，給予AST Ⅳ可以減輕化療藥物導(dǎo)致的心臟毒性，且與MerTK的作用相關(guān)，為臨床緩解化療藥物毒性提供了新的選擇。

AST Ⅳ可以減輕阿霉素引起的心臟損傷，減輕心臟炎癥并改善心功能。通過查閱文獻(xiàn)，本研究選擇20、40、80 mg/kg 3個AST Ⅳ劑量[9-10]，然而在小鼠生存率實驗中，20、40 mg/kg AST Ⅳ組小鼠死亡率未明顯改善，因此選擇80 mg/kg AST Ⅳ進(jìn)行其他實驗。相關(guān)文獻(xiàn)[9-10]也顯示，大劑量的AST Ⅳ才是有效的，大劑量的AST Ⅳ能夠減輕心肌損傷、心肌炎癥、心肌細(xì)胞凋亡、心臟纖維化等。研究[9]表明，AST Ⅳ能夠通過抑制NADPH氧化酶2和NADPH氧化酶4減輕阿霉素誘發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡、心肌炎癥等；AST Ⅳ顯著減弱了阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞線粒體損傷和功能障礙[11]；AST Ⅳ通過抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可減輕柯薩奇病毒B3感染引起的心肌炎的嚴(yán)重程度，并減輕心臟炎癥[5]。本研究也顯示AST Ⅳ減輕了阿霉素引起的IL-1β等炎癥指標(biāo)的升高，明確了AST Ⅳ對抗心臟炎癥的作用。研究[4,9,12]表明，AST Ⅳ通過多種信號通路改善心臟的收縮功能，并發(fā)揮心肌保護(hù)作用，如抑制NADPH氧化酶衍生的氧化應(yīng)激、抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、激活PPARα，本研究顯示AST Ⅳ改善阿霉素引起的心臟收縮功能指標(biāo)EF、FS的降低、心肌酶LDH、CK-MB的升高以及心肌纖維化。

AST Ⅳ減輕心臟損傷的機(jī)制可能是抑制了MerTK裂解。有研究[10]表明MerTK的裂解由TNF-α轉(zhuǎn)化酶通過涉及活性氧(ROS)、蛋白激酶Cδ和p38絲裂原活化蛋白激酶的途徑介導(dǎo)。另有研究[12]表明生長停滯特異性蛋白6(Gas6)和蛋白S是MerTK的配體，GAS6和蛋白S都是橋接分子，將MerTK與垂死細(xì)胞上的磷脂酰絲氨酸連接起來ADAM17裂解MerTK形成可溶性Mer。ROS是阿霉素引起的常見成分，它們誘導(dǎo)MerTK的蛋白裂解，導(dǎo)致MerTK功能障礙和穩(wěn)定裂解產(chǎn)物可溶性Mer的出現(xiàn)[13]；MerTK裂解會損害炎癥消退并限制心臟修復(fù)[6]。抑制MerTK裂解可在缺血再灌注損傷后促進(jìn)炎癥消退，促炎性介質(zhì)IL-1β和TNF-α降低[6]。在心肌缺血再灌注小鼠模型中，巨噬細(xì)胞MerTk缺失導(dǎo)致心臟創(chuàng)傷清創(chuàng)減少，梗死面積增大，心功能下降，提示MerTK可能參與心肌修復(fù)[14]。本研究結(jié)果顯示，AST Ⅳ維持了MerTK表達(dá)水平的同時降低了阿霉素引起的炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-6和TNF-α升高，提示AST Ⅳ可能通過維持心肌組織內(nèi)巨噬細(xì)胞的MerTK水平維持巨噬細(xì)胞清除炎癥的功能而實現(xiàn)其改善心功能和心肌纖維化的作用。