大孔樹脂純化顯齒蛇葡萄黃酮的工藝研究△

孔慶童 付 明 胡 興 王登宇

(民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室;湘西藥用植物與民族植物學湖南省高校重點實驗室;懷化學院生命科學系，湖南 懷化 418008)

顯齒蛇葡萄(Ampelopsis grossedentata)主要生長在我國江南山區(qū)的溝谷林中或山坡灌叢，屬于葡萄科蛇葡萄屬藤本植物。顯齒蛇葡萄全株藥用，具有清熱解毒、祛風濕、強筋骨等功效，可治療感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、黃疸型肝炎、皰癤等癥［1－3］。民間將其制成藤茶(亦稱“茅巖莓茶”、“甘露茶”等)飲用，可強身健體，并且在食品中也有應用［4］。

迄今為止，已在5000多種植物中發(fā)現(xiàn)了黃酮類化合物，而據(jù)有文獻報道，顯齒蛇葡萄中黃酮含量高達45%，主要是二氫楊梅素［5，6］，并且具有廣泛的生理活性，可抑制機體內(nèi)的氧化損傷，調(diào)節(jié)人體免疫機能;降低血糖血脂，用于防治糖尿病、動脈粥樣硬化、高血脂等;同時具有護肝、抗血栓、抗病毒等作用［7，8］。

黃酮類化合物的純化方法有紙層析法、重結晶法［9］、高效液相層析法［10］、柱層析法等，大孔樹脂是不含離子基團的高分子聚合物吸附劑［11］，在生物堿、黃酮等成分的分離純化領域中應用廣泛，具有操作簡便、再生容易、溶劑耗費少、回收率高等優(yōu)點，分離純化效果較好。根據(jù)現(xiàn)有條件選取大孔樹脂層析法純化顯齒蛇葡萄黃酮，優(yōu)化篩選最佳工藝條件，為今后進一步研究顯齒蛇葡萄黃酮奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器:顯齒蛇葡萄莖于2011年6月5日采自湖南省懷化市，將材料洗凈、剪碎、烘干后粉碎，過60目篩，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

HPD100、HPD600、D101、DM130、AB －8 型大孔吸附樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)，二氫楊梅素(99%，張家界至誠生物有限公司)，AlCl3·6H2O、NaOH、HCl、無水乙醇、95%乙醇等均為分析純。

島津UV2450分光光度計、臺式高速冷凍離心機(力康發(fā)展有限公司)、HL－1恒流泵(上海滬西分析儀器廠)、FA2004電子天平(上海衡平儀器儀表廠)、JY98－ⅢDN超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)、索氏提取器、DP01溶劑過濾器。

1.2 方法

1.2.1 配制溶液、活化大孔樹脂:配制 0.1 mg·mL－1的二氫楊梅素對照品溶液、5%AlCl3、5%HCl、1mol·L－1NaOH等。將各種樹脂進行酸處理→堿處理→醇處理［12］，備用。

1.2.2 提取樣品黃酮［13］:稱取2.5 g 樣品加入適量石油醚于索氏提取器中回流脫脂，棄石油醚、風干，然后加入50 mL 65%的乙醇于65℃浸提2 h，超聲波處理25 min，8000 rpm離心5 min。收集上清液;向沉淀中再加入50 mL 65%的乙醇，超聲波處理25 min，再離心。合并上清液即得顯齒蛇葡萄黃酮粗提液，將粗提液抽濾后用65%乙醇定容至100 mL，備用。

1.2.3 確定最大吸收波長、建立標準曲線:取二氫楊梅素對照品溶液、樣品黃酮提取液、蒸餾水各1 mL，分別加入3 mL 5%的AlCl3，用65%的乙醇定容至10 mL，顯色10 min后于200～400 nm掃描，確定二者共同的最大吸收波長。分別取二氫楊梅素對照品 0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL，如上所述在最大吸收波長處測吸光值，以吸光值對二氫楊梅素濃度繪制標準曲線。

1.2.4 測定樣品黃酮的含量:取一定體積的黃酮提取液如

1.2.3 所述測吸光值。根據(jù)吸光值通過回歸方程求出X，再按公式(2.1)計算黃酮的質(zhì)量分數(shù):

X:由標準曲線得出的二氫楊梅素濃度;n:稀釋倍數(shù);V:提取液體積，mL;w:樣品質(zhì)量，g。

1.2.5 靜態(tài)試驗［14，15］:吸附性能考察:將 5 種活化后的樹脂分別稱取5 g于250 mL錐形瓶，加入100 mL樣品提取

解吸性能考察:棄去靜態(tài)吸附試驗中的上清液，用濾紙吸干樹脂表面的液體，將之平分為5等份，分別加入15%、35%、55%、75%、95% 乙醇100 mL，搖床振蕩12 h，靜置3 h后按1.2.4方法測上清液的吸光值，計算出上清液中的黃酮質(zhì)量分數(shù)和靜態(tài)解吸率，篩選洗脫劑的最佳體積分數(shù)。液，避光、密封振搖24 h。然后取上清液按1.2.4方法測吸光值、計算上清液中黃酮的質(zhì)量分數(shù)，篩選吸附性能最佳的樹脂型號。

1.2.6 動態(tài)試驗

動態(tài)吸附率

制備一系列不同濃度的樣品溶液，取一定體積上柱，吸附一定時間后以一定的流速先用蒸餾水洗至無黃酮流出，再用不同體積分數(shù)的乙醇洗脫，分別收集洗脫液，并測其吸光值。在其他條件相同時，以其中一個為變量，分別篩選最佳上樣濃度、上樣體積、吸附時間和洗脫速度。

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長、標準曲線及回歸方程:對二氫楊梅素對照品和樣品提取液進行掃描，結果顯示兩者在310 nm處有最大光吸收，因此取不同濃度的對照品測A310，以A310對二氫楊梅素濃度作圖，得線性回歸方程y=55.14795x，r=0.9998，說明在0 ～15μg·mL－1濃度范圍內(nèi)線性關系良好。

2.2 顯齒蛇葡萄黃酮的含量:根據(jù)樣品液的吸光值通過回歸方程計算出黃酮的濃度，測得樣品提取液的A310=0.380，濃度為 689.1 μg·mL－1，根據(jù)公式(1)計算出顯齒蛇葡萄莖中黃酮含量為2.76%。

2.3 靜態(tài)試驗結果:5種不同型號樹脂的靜態(tài)吸附量、吸附率結果見表1，靜態(tài)解吸率結果如圖1所示:

表1 不同樹脂對顯齒蛇葡萄黃酮的吸附率

圖1 五種樹脂的靜態(tài)解吸結果

由表1可知，HPD100型樹脂對樣品黃酮的吸附率高于其他4種樹脂，其次是D101型及AB－8型樹脂。從圖1可知，洗脫劑的體積分數(shù)對黃酮的解吸率有明顯的影響，隨著體積分數(shù)的增加，解吸率也逐漸增加，故洗脫劑的最佳體積分數(shù)為95%;當洗脫劑體積分數(shù)達95%時，HPD100、DM130型的黃酮解吸率最高，但DM130樹脂的吸附性能較差，故選用HPD100型樹脂進行動態(tài)實驗。

2.4 動態(tài)試驗結果

2.4.1 上樣濃度的優(yōu)化:將樣品提取液配制成137.8、172.3、229.7、344.6、689.1μg·mL－1系列濃度的上樣液，各取5 mL上柱，按1.2.6的方法操作，計算不同上樣濃度黃酮的吸附率、洗脫率及回收率，結果如圖2。

圖2 上樣濃度對吸附率、洗脫率和回收率的影響

由圖2可知，隨著上樣液的濃度增加，對黃酮的吸附率減少，洗脫率和回收率也減小，故上樣液的最佳濃度為137.8μg·mL－1。

2.4.2 上樣體積的優(yōu)化:選擇濃度為 137.8μg·mL－1的樣品液，分別上樣3、4、5、6、7mL，吸附30 min 后按2.4.1 方法洗脫、收集，測A310。計算不同上樣體積下黃酮的吸附率、洗脫率及回收率，結果如圖3。

圖3 上樣體積對吸附率、洗脫率和回收率的影響

由圖3可知，隨著上樣體積的增大，對黃酮的吸附率并沒有明顯變化。而黃酮的洗脫率和回收率隨體積增大先增大后減小，且在上樣體積為5.0 mL時有最大值，之后開始下降。主要是因為上樣量加大，蒸餾水洗出的黃酮量也增加，故最佳上樣體積為5 mL。

2.4.3 吸附時間的優(yōu)化:取 137.8μg·mL－1的樣品液 5 mL，上柱平衡，分別吸附 7 min、15 min、30 min、60 min 后，按2.4.1方法洗脫、收集，測A310。計算不同吸附時間下黃酮的吸附率、洗脫率及回收率，結果如圖4。

圖4 吸附時間對吸附率、洗脫率和回收率的影響

由圖4可知，隨著吸附時間的增長，樹脂對黃酮的吸附率也增大;但在30 min前黃酮的洗脫率和回收率增加，30 min后洗脫率和回收率降低，當吸附時間為30 min時洗脫率和回收率最高;吸附時間為60 min時吸附率最大，但是洗脫率、回收率最低。吸附時間過短會導致吸附不完全，而吸附時間過長又導致解吸困難，因此確定最佳吸附時間為30 min。

2.4.4 洗脫速度的優(yōu)化:取 5 mL、137.8μg·mL－1樣品液上柱、平衡，吸附 30 min 后，分別以 0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mL/min流速，先用蒸餾水再用95% 乙醇洗脫，分別收集洗脫液，測A310。計算不同吸附時間下黃酮的吸附率、洗脫率及回收率，結果如圖5。

圖5 洗脫速度對吸附率、洗脫率和回收率的影響

由圖5可知，洗脫速度對黃酮的吸附率沒有明顯影響，但是對洗脫率和回收率有明顯影響。隨洗脫流速的增大，洗脫率和回收率先增大后減小，且在1 mL/min時有最大值。當流速為1.0 mL/min和1.5 mL/min時，洗脫率和回收率非常接近;流速過低或過高時黃酮的洗脫率都很低，為節(jié)省時間、提高生產(chǎn)效率，選擇最佳洗脫速度為1.5 mL/min。

2.5 驗證性試驗:將已活化的HPD100型樹脂濕法裝柱、平衡，在最優(yōu)條件下(上樣液中黃酮的濃度為137.8μg·mL－1，上樣體積 5 mL，吸附 30 min，洗脫速度 1.5 mL/min)做3組平行試驗，結果表明樹脂對顯齒蛇葡萄莖中黃酮的平均吸附率85.44%，洗脫率94.92%，回收率95.66%，純化后樣品的黃酮質(zhì)量分數(shù)達81.1%，工藝結果基本穩(wěn)定，可用于工業(yè)純化。

3 討論

黃酮類化合物的溶解度因結構、存在狀態(tài)不同因此有很大差異，一般游離態(tài)苷元難溶于水，易溶于甲醇、乙醇等有機溶劑，其中黃酮醇、查爾酮等難溶于水;而二氫黃酮、二氫黃酮醇等在水中的溶解度稍大［8］。乙醇毒性較小，可回收利用，因此選用乙醇來提取顯齒蛇葡萄中的黃酮并用其作為洗脫劑。

根據(jù)黃酮類化合物本身具有的熒光性質(zhì)，可用熒光分析法直接測定顯齒蛇葡萄中黃酮的含量［16］;由于黃酮類化合物與三價鋁離子能形成穩(wěn)定的熒光絡合物，在紫外區(qū)內(nèi)有特征吸收峰，也可在顯色后用分光光度法測定黃酮的含量。很多文獻以蘆丁為對照品測黃酮的含量，但我們進行波長掃描時，發(fā)現(xiàn)蘆丁和樣品沒有共有的最大吸收峰，而以二氫楊梅素為對照品時，有共有特征峰。雖然樣品與對照品的波長掃描圖有些不同，主要是因為樣品中含有多種黃酮類化合物。本實驗采用三氯化鋁顯色法測定顯齒蛇葡萄的黃酮含量。

靜態(tài)吸附實驗中吸附率較低，可能是因為加入的樣品提取液過多，樹脂已達飽和。近些年，也有采用大孔樹脂法純化顯齒蛇葡萄黃酮的工藝研究，他們用70% 乙醇作為洗脫劑，洗脫不徹底，所以洗脫率和回收率都沒有達到本實驗的95%。且95% 乙醇易于回收，濃縮干燥迅速、方便，故工業(yè)上用95% 乙醇洗脫是可行的。

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