潮汕特色佛手香黃的特征揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

林良靜，蔡惠鈿,2，包涵，黃雪盈，陳曦，高向陽,2

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642）（2.華農(nóng)(潮州)食品研究院有限公司，廣東潮州 521000）（3.廣西生態(tài)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院旅游與交通管理學(xué)院，廣西柳州，545004）

佛手柑是蕓香科（Rutaceae）柑桔屬（Citrus）常綠小喬木植物的果實(shí)[1]，因其獨(dú)特芳香而備受歡迎[2,3]，其香氣主要來自于其萜烯類、倍半萜烯類以及高級醇類、醛類、酮類、酯類等物質(zhì)[4]。佛手柑作為藥食兩用的藥材，本身辛辣苦澀不適宜服用。潮汕地區(qū)流行通過鹽腌、沖洗、曬干、炊熟、浸糖液、浸中藥粉液、烘干等復(fù)雜工藝將佛手柑制成佛手香黃。經(jīng)炮制后的佛手香黃具有去積祛風(fēng)、開胃理氣、化痰生津的功效，且風(fēng)味濃郁香甜、醇厚陳香[5]。目前對佛手香黃的揮發(fā)性風(fēng)味成分僅有嚴(yán)贊開[6]等采用GC-MS分析發(fā)現(xiàn)儲存階段的佛手香黃(Z)-2,3-丁二醇、(E)-2,3-丁二醇的含量明顯增加，但對其核心特殊香氣成分鮮有研究報道。

食品的風(fēng)味和香氣通常與揮發(fā)性物質(zhì)相關(guān)，并且是評估消費(fèi)者對食品的接受或拒絕以及感官上的偏愛的重要因素[7]。揮發(fā)性物質(zhì)對食品香氣的最終貢獻(xiàn)不僅取決于其濃度，還取決于其氣味閾值。單一地考慮含量而忽略閾值對揮發(fā)性進(jìn)行判斷不夠全面。目前，檢測揮發(fā)性物質(zhì)的常用手段是GC-MS，但GC-MS技術(shù)通常檢測分子量較大（C9～C21）的物質(zhì)，無法檢測到分子量較?。–5～C10）但至關(guān)重要的微量風(fēng)味物質(zhì)。近年來，GC-IMS作為揮發(fā)性風(fēng)味檢測手段逐漸普及，可快速、簡便以及可檢測到分子量較小的微量物質(zhì)（C5～C10），已成功運(yùn)用在多種食品揮發(fā)性風(fēng)味分析和品質(zhì)檢測上[8]。香味活度值（OAV，Odoractivevalue）是評估揮發(fā)性風(fēng)味對風(fēng)味貢獻(xiàn)值的重要參數(shù)，當(dāng)OAV＞1時往往認(rèn)定其對揮發(fā)性風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。但是OAV值計算涉及數(shù)種物質(zhì)的定量工作，工作量較大。劉登勇等[9]將百分比引進(jìn)OAV計算公式中得到新參數(shù)ROAV，通過新公式可快速計算得到了皋火腿的主要貢獻(xiàn)風(fēng)味物質(zhì)。樊艷等利用SPME-GC-MS結(jié)合ROAV分析腐乳中的主體風(fēng)味物質(zhì)[10]。

因此本文采用氣相色譜-離子遷移色譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）及相對香氣活度值（ROAV）計算對佛手香黃揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行研究，再通過化學(xué)計量對不同品牌的佛手香黃的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行區(qū)分識別，確定特殊香氣的特征性標(biāo)志成分，為提供建立佛手香黃質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供分析檢測的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

佛手香黃樣品在潮汕地區(qū)的生產(chǎn)企業(yè)和市場收集，為排除各品牌配方不同以及不同儲存時間所帶來的風(fēng)味差異，選擇了4個不同品牌以及不同儲存時間共8種有代表性的樣品。具體信息如下：

1-1：品牌1，儲存3年份潮州老香黃；2-1：品牌2，儲存1年份潮州老香黃；2-2：品牌2，儲存2年份潮州老香黃；2-3：品牌2，儲存3年份潮州老香黃；3-1：品牌3，儲存1年份潮州老香黃；3-2：品牌3，儲存2年份潮州老香黃；3-3：品牌3，儲存3年份潮州老香黃；3-4：品牌3，儲存4年份潮州老香黃。

FlavourSpec?Laboratory 風(fēng)味分析儀配有GC×IMS Library Search軟件，德國G.A.S公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 GC-IMS實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1.1 樣品的前處理

稱取樣品各1 g置于20 mL頂空瓶中，60 ℃孵育15 min后進(jìn)樣，用氣相離子遷移譜儀FlavourSpec?進(jìn)行GC-IMS分析。

1.2.1.2 GC-IMS條件

色譜柱FS-SE-54-CB-1（15 m，ID：0.53 mm）（美國Restek公司）柱溫60 ℃，載氣/漂移氣N2，IMS溫度45 ℃，孵育時間15 min，孵育溫度60 ℃，進(jìn)樣針溫度65 ℃，孵化轉(zhuǎn)速500 r/min進(jìn)樣量500 μL，分析時間30 min。

E1（漂移氣流速）150 mL/min；E2（氣象載氣流速）0～2 min，2 mL/min；2～20 min，2 mL/min；20～30 min，100 mL/min；30 min，100 mL/min。

1.2.2 相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）

該參數(shù)設(shè)定對樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)最大成分：ROAVstan=100，其他的成分（A）：

式中：C% A、TA為各風(fēng)味組分的相對百分含量和對應(yīng)的感覺閾值；C% stan、Tstan分別為對樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)最大組分的相對百分含量和感覺閾值。當(dāng)物質(zhì)的ROAV＞1時，該物質(zhì)對于揮發(fā)性風(fēng)味的貢獻(xiàn)大，為主香成分，ROAV越大，對風(fēng)味的貢獻(xiàn)就越大。當(dāng)0.1＜ROAV＜1時，該成分作為修飾成分。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用G.A.S.開發(fā)的GCxIMS Library Search軟件，通過內(nèi)置的NIST 2014氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫與G.A.S.的IMS遷移時間數(shù)據(jù)庫二維定性，軟件內(nèi)置的NIST數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫可對物質(zhì)進(jìn)行定性分析；利用LAV軟件的Gallery Plot插件選取圖中所有的待分析區(qū)域，生成指紋圖譜；SIMCA-P 14.1進(jìn)行主成分分析和PLS-DA建模；用IBM SPSS 25.0、Excel軟件和Origin 2018 64Bit進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性成分定性及定量分析

使用G.A.S開發(fā)的GCxIMS Library Search軟件，通過內(nèi)置的NIST 2014氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫與G.A.S.的IMS遷移時間數(shù)據(jù)庫二維定性和定量分析，得到Gallery Plot圖，如圖1。

圖1 氣相離子遷移譜圖中選取的揮發(fā)性有機(jī)物的Gallery Plot圖Fig.1 Gallery plot diagram of volatile organic compounds selected from gas phase ion migration spectrum

接上頁

圖1 中每一列為同一保留時間及漂移時間下的有機(jī)物（不同樣品中相同的物質(zhì)）的信號峰；其色塊顏色越白，峰強(qiáng)越強(qiáng)，含量越高。從3個品牌的佛手香黃中檢測到8種酯類、15種醛類、11種醇類、3種酮類、23種烯萜類、6種酸類、3種呋喃類、1種噻唑類和1種吡嗪類。將70種已知揮發(fā)性風(fēng)味化合物歸類，利用面積歸一法計算各揮發(fā)性成分的相對百分含量并統(tǒng)計如表1。

表1 佛手香黃的揮發(fā)性物質(zhì)相對百分含量Table 1 The relative content of volatile flavor substances in Lao-Xiang-Huang preserved

將各類揮發(fā)性化合物匯總并進(jìn)行單因素分析及顯著性差異分析，繪制柱形圖，如圖2。

圖2 基于GC-IMS分析佛手香黃的不同種類揮發(fā)性物質(zhì)相對百分比柱形圖Fig.2 The relative percentages bar diagram of the volatile organic compounds in Lao-Xiang-Huang preserved were detected by GC-IMS

不同品牌不同儲藏時間的佛手香黃樣品中萜烯類種類豐富，與其他物質(zhì)相比，相對百分含量均最高，約50%～70%。不同品牌的佛手香黃的烯萜類物質(zhì)有差異，品牌2的烯萜類物質(zhì)顯著高于其他品牌。佛手香黃在儲藏前3年，烯萜類相對百分比含量變化不顯著，第3年樣品烯萜類物質(zhì)顯著減少。烯萜類物質(zhì)一般來自植物自身，具有花草的香味。生佛手的烯萜類物質(zhì)在蒸制過程損失嚴(yán)重[11]，且腌制放置過程中持續(xù)下降[6]。檸檬烯是新鮮佛手的標(biāo)志物質(zhì)，占比約30%～50%[12]，腌制后的潮州老香黃中的檸檬烯損失嚴(yán)重，僅相對百分含量8%～10%。其次，相對百分含量較高的香葉醇、alpha-松油醇-M、alpha-松油醇-D均在腌制佛手中被報道[13]，為花香味特征[14]。

接上頁

醇類物質(zhì)主要由氨基酸的脫羧和脫氨產(chǎn)生，具有清涼的感受[15]，有研究表明在儲存期間醇類物質(zhì)會顯著增加，且成為佛手香黃儲存過程香味增濃的主要原因[16]。本研究中醇類物質(zhì)相對含量隨時間變化并不顯著，但不同品牌間醇類含量有顯著差異，品牌2的佛手香黃的3-甲基丁醇、1-戊醇、甲醇、1-苯乙醇均高于其余兩者。與醇類的結(jié)果類似，醛類物質(zhì)相對含量隨時間變化不顯著，品牌2的醛類相對百分含量顯著高于其余兩者。醛類有強(qiáng)烈香味，香味一般似果香，味甜帶澀[17]。其含量較高的是丙醛，表現(xiàn)出青草、可可和咖啡味[18]。

酯類物質(zhì)主要來源于脂肪酸氧化、氨基酸代謝及醇和醛等代謝合成，通常帶有水果的香氣[19]。品牌2的酯類物質(zhì)顯著高于其他品牌，并且隨著儲藏時間的增加，酯類物質(zhì)相對百分含量增加。本文檢測的酯類中含量最高的是乙酸香葉酯和乙酸乙酯。乙酸香葉酯具有玫瑰和薰衣草的香氣，是一種重要的香料來源[20]。乙酸乙酯能產(chǎn)生令人愉悅的水果香氣[21]。其余的呋喃、酸類、吡嗪類物質(zhì)相對百分含量較低。

2.2 基于ROAV計算分析佛手香黃的主要揮發(fā)性風(fēng)味變化

對檢測結(jié)果中風(fēng)味成分的在水中的香味閾值進(jìn)行查詢并計算，定義對樣品香味貢獻(xiàn)最大的成分3-甲硫基丙醛ROAV為100，其他風(fēng)味成分的ROAV由式（1）計算得出，得表2。

表2 佛手香黃揮發(fā)性風(fēng)味成分的相對風(fēng)味活度值Table 2 The relative odor activity value of volatile flavor components in Lao-Xiang-Huang preserved

接上頁

通常，具有較高ROAV（大于1）的香氣化合物被認(rèn)為是總體香氣的主要貢獻(xiàn)者，0.1＜ROAV＜1的成分被認(rèn)為在總體香氣中起協(xié)調(diào)作用[49]。

與陳小愛等人利用GC-IMS分析潮州佛手香黃的揮發(fā)性物質(zhì)的結(jié)果不同，本研究利用GC-IMS結(jié)合ROAV分析8個佛手香黃樣品中相對香氣值最高的均為甲硫基丙醛[50]。甲硫基丙醛（0.09%～0.27%）相對含量雖不高，但由于其低閾值，對佛手香黃風(fēng)味貢獻(xiàn)最大，奠定了潮州佛手香黃的基礎(chǔ)風(fēng)味特征。甲硫基丙醛由蛋氨酸通過Strecker降解反應(yīng)合成[51]，具有煮馬鈴薯的香味[34,35]，也有研究證明甲硫基丙醛具有肉香及肉湯風(fēng)味[35]。這一差異可能是不同品牌佛手香黃的腌制過程中的鹽腌和干燥過程不同工藝造成的[47]。

在佛手香黃中含量較高的烯萜類物質(zhì)仍是風(fēng)味的主要來源之一，累積香氣值達(dá)44～117。有研究表明在新鮮佛手中，香葉醇（12.14～36.86）和芳樟醇（10.35～52.53）是佛手精油中的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)[49]，帶有花香、木香等香氣。在品牌2佛手香黃中該兩類物質(zhì)的相對香氣值均高于其他品牌，但隨時間變化不明顯。另外，具有較高香氣活度值的苯乙醛（8.61～28.88），3-甲基丁醛（6.81～20.12）、3-甲基丁醇（23.21～72.20）和壬醛（2.66～4.97）也是佛手香黃風(fēng)味重要來源之一。苯乙醛有濃郁的玉簪花香氣[47]。3-甲基丁醛、3-甲基丁醇和壬醛在佛手風(fēng)味相關(guān)的文獻(xiàn)中還未被報道。3-甲基丁醛被描述為麥芽味（刺鼻的辛辣味）[40]，是令人不愉悅的風(fēng)味。但3-甲基丁醛對香氣的貢獻(xiàn)取決于化合物的濃度[51]，3-甲基丁醛在低濃度下，該味會變得果香而令人愉悅[40]。3-甲基丁醇青香、帶有刺激性[41]，霉味、焦糊[42]。壬醛有堅果烤香味[48]。

alpha-松油醇-M、alpha-松油醇-D、月桂烯-D、alpha-蒎烯、己醛、beta-羅勒烯是新鮮佛手精油的主要成分[49]。經(jīng)過腌制炮制后，在潮州香黃中它們均ROAV＜1，作為風(fēng)味協(xié)調(diào)成分。這些物質(zhì)對佛手香黃的風(fēng)味具有協(xié)調(diào)作用，使風(fēng)味更加濃郁，和諧。

2.3 動態(tài)主成分分析

利用SIMCA-P軟件對不同品牌的佛手香黃樣品揮發(fā)性化合物進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 佛手香黃揮發(fā)性物質(zhì)的主成分分析Fig.3 PCA analyzed of volatile compounds of Lao-Xiang-Huang preserved

PCA分析可通過對大量數(shù)據(jù)進(jìn)行降維，減少數(shù)據(jù)冗余。本研究通過SIMCA-P軟件對8組樣品進(jìn)行主成分分析。主成分1貢獻(xiàn)率為34.3%，主成分2貢獻(xiàn)率為24.9%，累計貢獻(xiàn)率為59.2%，可以有效解釋總變異的59.2%的原始數(shù)信息，通過二維空間分布可以直觀觀察到組間及組內(nèi)的差異。同組樣品距離相近，組內(nèi)差異小，樣品間重復(fù)性較好。由圖3可知，同一品牌的佛手香黃分布距離較近，不同品牌區(qū)分度較大，主要差異體現(xiàn)在PC1上。而同一品牌不同儲存時間的樣品也有一定的區(qū)分度，主要差異體現(xiàn)在PC2上。上述結(jié)果表明，GC-IMS可對不同品牌的潮州佛手香黃進(jìn)行分類鑒別，可用于鑒別佛手香黃來源，建立溯源體系。

2.4 不同品牌佛手香黃揮發(fā)性成分差異分析

通過SIMCA-P軟件對不同品牌的佛手香黃的揮發(fā)成分建立PLS-DA模型。PLS-DA是有監(jiān)督的分析，有助于高維數(shù)據(jù)的可視化、判別分析與代謝變化有關(guān)的潛在代謝物。經(jīng)PLS-DA分析，R2X=0.92，R2Y=0.977，Q2=0.943，R2X和R2Y分別表示模型所能解釋X和Y矩陣信息的百分比，當(dāng)R2X-R2Y＜0.3，Q2＞0.5代表該模型較可靠。利用置換檢驗(yàn)對PLS-DA模型建立結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)，如圖4。右側(cè)R2Y及Q2值為真實(shí)值，左側(cè)為預(yù)測值，當(dāng)預(yù)測值均低于真實(shí)值且R2Y與Q2的回歸線斜率大于1，Q2截距為負(fù)值時，模型預(yù)測結(jié)果穩(wěn)定性較好，未出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象。

圖4 佛手香黃揮發(fā)性物質(zhì)的PLS-DA Permutations圖Fig.4 PLS-DA permutations test of Lao-Xiang-Huang preserved

通過模型相對應(yīng)的載荷圖分析不同品牌佛手香黃的差異化學(xué)成分，以變量重要性投影（VIP）值描述變量的貢獻(xiàn)程度，當(dāng)VIP值＞1時，該物質(zhì)可認(rèn)為是重要差異物質(zhì)。其VIP值見圖5，初步篩選出VIP值＞1的18個差異化學(xué)成分。

圖5 佛手香黃揮發(fā)性物質(zhì)的VIP圖Fig.5 VIP analysis of Lao-Xiang-Huang preserved

采用單因素方差分析對3個品牌的佛手香黃的18個差異性物質(zhì)進(jìn)行顯著性分析，篩選p＜0.05的物質(zhì)，繼續(xù)篩選出15個差異物質(zhì)，包括2-糠醇-D、乙醇-D、乳酸乙酯、2-二甲基乙酸、乙酸乙酯、5-甲基糠醛-D、alpha-水芹烯-D、檸檬烯-D、香葉醇、alpha-松油醇-D、香茅醛、1-苯乙醇、松油烯-4-醇、2-乙酰基呋喃-D、丙酮。利用熱圖對差異性化學(xué)成分的峰強(qiáng)度數(shù)值進(jìn)行比較，見圖6。

圖6 佛手香黃差異揮發(fā)性物質(zhì)的熱圖Fig.6 Heatmap of differential volatile substances Lao-Xiang-Huang preserved

由圖6結(jié)合單因素方差分析結(jié)果，品牌1的標(biāo)志揮發(fā)性化合物為2-糠醇-D，品牌2的標(biāo)志揮發(fā)性化合物為乙醇-D、乳酸乙酯、2-二甲基乙酸、乙酸乙酯、5-甲基糠醛-D、alpha-水芹烯-D、檸檬烯-D、香葉醇、alpha-松油醇-D、香茅醛、1-苯乙醇。品牌3的標(biāo)志揮發(fā)性化合物為松油烯-4-醇、2-乙?；秽?D、丙酮。

3 結(jié)論

本文利用GC-IMS檢測佛手香黃揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)由8種酯類、15種醛類、11種醇類、3種酮類、23種烯萜類、6種酸類、3種呋喃類、1種噻唑類和1種吡嗪類組成。利用GC-IMS結(jié)合ROAV分析確認(rèn)佛手香黃的特征性風(fēng)味成分主要由甲硫基丙醛和烯萜類物質(zhì)組成，呈現(xiàn)果香、花香的風(fēng)味特征。結(jié)合PCA、PLS-DA和單因素方差分析了不同品牌的揮發(fā)性化合物的變化，篩選出15個標(biāo)志揮發(fā)性化合物。標(biāo)志成分既反映佛手香黃風(fēng)味的本質(zhì)特征，又有助于進(jìn)一步建立專屬性、針對性的質(zhì)量評價方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為佛手香黃質(zhì)量控制及質(zhì)量溯源體系及辨別偽劣提供理論基礎(chǔ)。