1-甲基環(huán)丙烯和自發(fā)氣調(diào)包裝處理誘導鴨梨冷害過程中果肉褐變及水孔蛋白基因表達的變化

何近剛，馮云霄，程玉豆，王珅，付亞雄，關(guān)軍鋒

（1.河北省農(nóng)林科學院遺傳生理研究所，河北石家莊 050051）（2.河北省植物轉(zhuǎn)基因中心，河北石家莊 050051）

鴨梨（Pyrus bretschneideriRehd.）是我國主栽梨品種之一，果型美觀、味甜多汁，深受廣大消費者的喜愛。為了延長鴨梨貯藏期常進行冷藏，但長期冷藏后，易發(fā)生黑皮、果肉褐變現(xiàn)象[1,2]，導致果實商品價值明顯下降，經(jīng)濟效益損失嚴重。

1-甲基環(huán)丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）作為一種新型乙烯受體抑制劑，可顯著延緩躍變型果實成熟，延長貨架期[3]，在生產(chǎn)上具有廣闊的應(yīng)用前景。薄膜形成的自發(fā)氣調(diào)包裝（Modified atmosphere packaging，MAP）可調(diào)節(jié)果實微環(huán)境氣體條件，實現(xiàn)微氣調(diào)，延緩果實衰老，以達到保鮮效果[4,5]。1-MCP與MAP聯(lián)合使用（1-MCP+MAP），具有協(xié)同效應(yīng)，可以實現(xiàn)較好的保鮮效果。在梨果實上，1-MCP+MCP處理可延緩果實硬度的下降，降低呼吸速率和乙烯釋放速率，減少黑皮發(fā)生[6]。但我們在研究中發(fā)現(xiàn)，1-MCP+MAP處理有時會導致果肉褐變，果肉呈水漬狀，可能屬于冷害現(xiàn)象，但其原因尚不清楚。

植物冷害產(chǎn)生的原因之一是在低溫下發(fā)生了水分吸收運輸和散失的不平衡[7]。水孔蛋白（Aquaporins，AQP）在植物水分吸收、根部營養(yǎng)物質(zhì)攝入、組織擴張、蒸騰作用、光合作用以及逆境脅迫等方面都發(fā)揮著重要的作用[8-10]，并且還參與果實發(fā)育。如西洋梨‘La France’幼果發(fā)育時，細胞膨大期液泡膜水孔蛋白基因（TIP）表達量特別高，可能為細胞膨大時的液泡水通道[11]；富士蘋果中MdPIP1;3的兩個表達高峰與果實發(fā)育中兩個細胞膨大期一致[12]；沙梨果實發(fā)育過程中，PpPIP1表達量受乙烯上調(diào)[13]。已有研究證明，當番茄乙烯合成增加并且躍變期提前時，果實加速失水，同時SlPIP12Q、SlPIPQ、SlPIP21Q和SlPIP22表達量上調(diào)[14]。但目前關(guān)于水孔蛋白在低溫和乙烯調(diào)控下參與梨果實采后品質(zhì)變化的研究較少。

本研究主要探討1-MCP及MAP處理下，分析鴨梨長期貯藏過程中果實品質(zhì)及果肉褐變發(fā)生，以及果實水孔蛋白基因的表達情況，進而深入解析1-MCP及MAP對鴨梨貯藏效果的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

鴨梨于2017年9月16日采自河北省趙縣管理良好的果園。采后當天運回實驗室，解去果實紙袋，過夜，散去田間熱。次日，挑選大小均勻（單果重286.76±34.41 g）、成熟度一致的無病蟲害的果實為材料，進行處理。果實在塑料帳篷內(nèi)密封，使用1.0 μL/L 1-MCP（美國陶氏公司生產(chǎn)）熏蒸18 h，之后一部分果實進行自發(fā)氣調(diào)包裝（1-MCP+MAP），一部分果實直接裝入紙箱（1-MCP）；對照果實直接于帳篷內(nèi)密封18 h，同樣一部分果實進行自發(fā)氣調(diào)包裝（MAP），一部分果實直接裝入紙箱（CK）。自發(fā)氣調(diào)包裝保鮮膜（厚度15 μm）為微孔PE膜，由國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心（天津）提供。處理完畢后，果實裝入紙箱。每箱30個果實，進入冷庫貯藏（溫度為0±0.5 ℃，相對濕度85%～95%）。自冷藏60 d時，每隔30 d隨機選取15個果實，取樣測定各項指標，5個果實1組，每個處理測定3個重復。冷藏180 d時將果實取出冷庫，測定其在20 ℃下貨架7 d各項指標。

1.2 方法

1.2.1 品質(zhì)指標

果實硬度：使用GY-4型果實硬度計（浙江托普公司）測定，單位為kg/cm2；可溶性固形物含量（SSC）使用PAL-1型手持數(shù)字糖度計（日本愛拓公司）測定。

1.2.2 果實包裝內(nèi)氣體成分含量測定

包裝及紙箱內(nèi)O2和CO2含量使用99790Ⅱ型便攜式氣體分析儀（德國Witt公司）測定，乙烯含量采用GC-9790Ⅱ型氣相色譜儀測定（浙江福立公司）。乙烯測定的條件為，柱箱溫度：80 ℃；汽化室溫度為：140 ℃；FID（氫火焰離子檢測器）的溫度為：200 ℃。N2為載氣，H2為燃氣，助燃空氣為合成空氣。N2的流量為：40 mL/min（0.04 MPa），H2流量為：40 mL/min，空氣流量為：30 mL/min（0.03 MPa）。每個處理固定3箱進行氣體測定，每箱重復3次取樣。

1.2.3 果肉褐變率測定

果肉褐變率：縱切果實后，計果肉褐變果實數(shù)，計算褐變果實數(shù)占總果實數(shù)量的百分比。

1.2.4 果肉綠原酸含量測定

綠原酸含量采用高效液相色譜（HPLC）法測定[15]。取果皮下1 cm深果肉凍樣，進行綠原酸提取和測定。HPLC色譜條件：日立HITACHI L-2000高效液相色譜儀自帶的反相Lachrom C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測波長280 nm，柱溫30 ℃，洗脫程序為A相5%冰醋酸水溶液、B相為水、C相為乙腈（0 min，

A:B:C=19:76:5；7 min，A:B:C=95:0:5；20 min，A:B:C=85:0:15；25 min，A:B:C=55:0:45；26 min，A:B:C=15:0:85；31 min，A:B:C=15:0:85；32 min，A:B:C=19:76:5），流速為1.0 mL/min，進樣體積為10 μL。

1.2.5 POD和PPO活性測定

POD活性測定：采用愈創(chuàng)木酚法[16]。取果肉凍樣1 g，加入3 mL 0.1 mol/L乙酸鈉提取緩沖液（1 mmol/L PEG、4% PVPP和1% Triton X-100），4 ℃下12000 r/min離心30 min，取上清液用于測定POD活性。將200 μL酶提取液加入到反應(yīng)液中（含25 mmol/L愈創(chuàng)木酚），使終體積為4 mL。在470 nm波長下測定OD變化值，以每分鐘吸光度變化值增加0.01時為1個POD活性單位（U），單位為U/g FW。

PPO活性測定[17]：稱取果肉凍樣1 g，加入3 mL的0.1 mol/L（pH=7.0）磷酸緩沖液（含6% PVP），4 ℃下12000 r/min離心15 min，取上清液用于測定PPO活性。將200 μL酶提取液加入到25 ℃預熱反應(yīng)液中（含25 mmol/L鄰苯二酚的磷酸鹽緩沖液，pH 6.0），使終體積為4 mL。在420 nm波長下測定OD變化值，以每分鐘吸光度變化值增加0.01時為1個PPO活性單位（U），單位為U/g FW。

1.2.6 RNA提取和定量PCR（RT-PCR）分析

采用Gasic等改良CTAB法[18]提取果肉的總RNA?？俁NA經(jīng)DNase清除DNA后，用Primescript TM RT reagent Kit（寶生物工程（大連）有限公司）進行反轉(zhuǎn)錄。

定量 PCR 儀為 ABI 7500型（Applied Biosystems?，美國），反應(yīng)試劑為TB Green? Premix Ex Taq II定量PCR試劑盒（寶生物工程（大連）有限公司）。以PbActin2為內(nèi)參基因[19]，其余基因參照Genbank上登記序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計基因引物，所有引物委托上海生物工程有限公司合成（表1）。通過2-ΔΔCT法計算出待測基因相對表達量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2007和SPSS（18.0）數(shù)據(jù)處理軟件進行統(tǒng)計分析，方差分析采用LSD法，結(jié)果用3次重復的平均值表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 1-MCP及MAP對鴨梨冷藏期包裝內(nèi)氣體含量的影響

經(jīng)測定，不同處理及包裝內(nèi)O2含量在20.43%～21.78%之間，貯藏30 d、45 d、60 d以及180 d時MAP處理內(nèi)O2含量顯著低于CK，其余處理與CK之間無明顯差別（圖1a）；包裝內(nèi)CO2含量在0.71%～1.15%之間，顯著高于CK以及1-MCP處理箱內(nèi)含量（圖1b）。包裝內(nèi)乙烯含量在90 d時達到高峰（圖1c），MAP處理內(nèi)乙烯含量為146.38 μL/L，而1-MCP可有效抑制MAP包裝內(nèi)乙烯含量的升高，1-MCP+MAP處理內(nèi)乙烯含量僅為17.30 μL/L。

圖1 1-MCP及MAP處理后冷藏鴨梨包裝箱/膜內(nèi)O2（a）、CO2（b）以及乙烯含量（c）變化Fig.1 Changes of O2 (a), CO2 (b) and ethylene contents in package box and film (c) of ‘Yali’ pear treated by 1-MCP and MAP during cold storage

1-MCP可通過強烈結(jié)合乙烯受體，因而有效地阻礙了乙烯與其受體的正常結(jié)合，致使乙烯作用信號的傳導和表達受阻[3,20]。本研究中1-MCP處理顯著抑制了冷藏期間鴨梨果實乙烯的生成（圖1c），這是其延緩果實衰老的基礎(chǔ)。1-MCP與MAP聯(lián)合使用（1-MCP+MAP）對自發(fā)氣調(diào)包裝內(nèi)O2的影響不顯著，但在冷藏120 d之前降低袋內(nèi)CO2含量，之后略有升高，尤其是冷藏180 d時CO2升高顯著；但從乙烯含量來看，1-MCP+MAP復合處理顯著降低袋內(nèi)乙烯含量（圖1b、c）。

2.2 1-MCP及MAP對鴨梨冷藏期及貨架期品質(zhì)的影響

硬度在貯藏期間呈下降趨勢，1-MCP與MAP處理可較好地維持硬度（圖2a）；隨著貯藏時間的延長，SSC升高，且CK與1-MCP處理的果實SSC顯著升高（圖2b）。采收時果實硬度和SSC分別為7.51 kg/cm2和11.46%，貯藏180+7 d時MAP包裝處理果實硬度（6.25 kg/cm2）最高，CK、1-MCP以及1-MCP+MAP處理的果實硬度分別為5.72 kg/cm2、5.53 kg/cm2和5.68 kg/cm2，三者之間無明顯差別；貯藏180+7 d時，1-MCP+MAP果實SSC（11.43%）最低，CK、MAP和1-MCP處理果實SSC分別為12.40%、12.24%和12.86%，三者之間無明顯差別。冷藏120 d時果實胴部果肉開始發(fā)生褐變，并且呈水漬狀，屬于典型的冷害癥狀。貯藏180 d時1-MCP+MCP處理果實果肉褐變情況最為嚴重，果肉褐變率達25.78%（圖2c）。

圖2 1-MCP及MAP處理后冷藏和貨架期鴨梨硬度（a）、SSC（b）和果肉褐變率（c）的變化Fig.2 Changes of fruit firmness (a), SSC (b) and flesh browning rate (c) of ‘Yali’ pear treated by 1-MCP and MAP during cold and shelf-life storage

乙烯受體抑制劑1-MCP具有明顯的延緩果實衰老的作用[20]，在梨貯藏保鮮應(yīng)用中已經(jīng)取得長足的進展。MAP包裝通過調(diào)節(jié)果實微環(huán)境，從而達到保鮮的效果[5,21]。本研究中MAP和1-MCP處理均可可有效維持冷藏期鴨梨果實硬度、SSC（圖2a、b），但二者聯(lián)合使用（1-MCP+MAP）加重了果肉組織褐變（圖2c）。

梨果在貯藏過程中產(chǎn)生的組織褐變，有時被認為與貯藏環(huán)境中高濃度的CO2有關(guān)。當包裝內(nèi)CO2濃度大于1%時，黃金梨果肉組織易發(fā)生褐變[21]。冷藏期間包裝內(nèi)CO2濃度為1.3%～3.2%時，鴨梨果肉發(fā)生褐變；而微孔膜包裝內(nèi)CO2濃度將至0.6%以下時，果肉褐變指數(shù)顯著降低[22]。本研究中MAP處理袋內(nèi)CO2濃度在冷藏期間一直保持在0.71%以上（圖1b），推測在一定程度上的CO2積累也是導致MAP處理鴨梨果肉褐變發(fā)生的原因之一。

2.3 1-MCP及MAP對鴨梨冷藏期及貨架期果肉綠原酸含量、POD及PPO活性的影響

綠原酸含量隨著貯藏時間的延長而增加，尤其在褐變較為嚴重的1-MCP+MAP處理果實中（180+7 d）含量達最高值（201.75 μg/g FW）（圖3a）。在貯藏期間POD活性先升高后下降，1-MCP以及1-MCP+MAP處理果實POD活性在整個貯藏期間顯著高于CK及MAP果實，其中1-MCP+MAP處理果實POD活性在貯藏150 d時達最高值37.37 U/g FW（圖3b）。與POD不同，PPO活性隨著貯藏時間延長而升高，其中1-MCP和1-MCP+MAP處理果實在貯藏后期（180 d和180+7 d）其活性顯著高于CK和MAP果實（圖3c），180+7 d時1-MCP+MAP處理果實PPO活性最高，達157.00 U/g FW，而此時CK以及MAP果實中PPO活性僅為89.00 U/g FW和84.00 U/g FW。

綠原酸是鴨梨果肉中含量較高的酚類物質(zhì)[23]。本研究發(fā)現(xiàn)綠原酸含量隨著果肉褐變加重而升高，并且在褐變最為嚴重的1-MCP+MAP處理中最高（圖3a）。POD通過催化酚類物質(zhì)與H2O2反應(yīng)生成醌類來清除果實內(nèi)的H2O2[24]，PPO可催化醌和單寧的合成，是引起酶促褐變的主要酶類[25]。在本研究中，POD活性在冷藏早期呈上升趨勢，并于150 d時達到最高值，隨后活性下降，1-MCP處理果實POD活性下降不明顯，而1-MCP+MAP處理果實POD活性在180+7 d時升高（圖3b）。果肉內(nèi)PPO活性隨著貯藏時間的延長而升高，并且在180+7 d時達到最高值，1-MCP以及1-MCP+MAP處理果實中PPO活性較高（圖3c）。因此，POD和PPO活性的顯著升高是導致果肉組織褐變的生化基礎(chǔ)。

圖3 1-MCP及MAP處理后冷藏和貨架期鴨梨果肉綠原酸含量（a）、POD活性（b）以及PPO活性（c）的變化Fig.3 Changes of flesh chlorogenic acid content (a), POD (b)and PPO activity (c) of ‘Yali’ pear treated by 1-MCP and MAP during cold and shelf-life storage

2.4 1-MCP及MAP對鴨梨冷藏及貨架期及貨架期果肉PbPIPs和PbTIPs表達量的影響

在鴨梨貯藏過程中，CK果實和MAP包裝果實質(zhì)膜水孔蛋白基因PbPIP1;1表達量在冷藏過程中呈下降趨勢，在貨架期略有升高，而1-MCP處理可延緩該基因的下降，整個貯藏期間1-MCP以及1-MCP+MAP處理果實PbPIP1;1表達量顯著高于CK果實（圖4a）；180 d時CK和MAP果實中PbPIP1;1表達量分別為0.07和1.11，1-MCP和1-MAP+MAP處理果實中該基因表達量為0.52和0.16。PbPIP1;4在貯藏過程中表達量先升高后下降，入庫60 d時CK果實中該基因即達到表達高峰4.02，而處理果實中PbPIP1;4表達量相對較低（圖4b）。

圖4 1-MCP及MAP處理后冷藏鴨梨果肉PbPIP1;1（a）、PbPIP1;4（b）、PbPIP2;1（c）、PbPIP2;2（d）以及PbPIP2;5（e）相對表達量的變化Fig.4 Relative expression level of PbPIP1;1 (a), PbPIP1;4, (b),PbPIP2;1 (c), PbPIP2;2 (d) and PbPIP2;5 (e) in the flesh of‘Yali’ pear treated by 1-MCP and MAP during cold and shelf-life storage

CK果實的PbPIP2;1在冷藏60 d時表達量激增，其表達量可達初始值的18000倍左右，隨后表達量下降，MAP和1-MCP處理均可抑制該基因表達量的升高，而1-MCP+MAP對該基因的抑制效果最為明顯（圖4c），該處理PbPIP2;1表達高峰僅為406.08；PbPIP2;5的表達趨勢在CK果實中與PbPIP2;1相似，表達量在貯藏初期（60 d）達高峰（9128.53），之后表達量下調(diào)，MAP以及1-MCP抑制該基因的表達，而1-MCP+MAP聯(lián)合處理的抑制作用更為明顯，并且可以推遲表達高峰（90 d，768.75）（圖4e）。在冷藏初期CK果實、1-MCP以及1-MCP+MAP處理果實中PbPIP2;2基因表達量都呈升高趨勢，貯藏90 d時表達量達到最高值，隨后下降；與另外兩個PIP2基因不同的是，1-MCP處理果實中PbPIP2;2表達量均高于CK果實（圖4d）。

本研究分析了兩個梨TIP基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖5），PbTIP1;1基因的表達量在冷藏60 d時達到表達高峰，隨之逐漸下降，而1-MCP以及1-MCP+MAP處理果實中該基因表達量顯著高于CK果實和MAP處理果實，180+7 d時該基因在1-MCP+MAP處理果實中相對表達量為7.67，為CK和MAP處理果實中的十余倍；PbTIP2;1基因在冷藏后表達量明顯下降，1-MCP在一定程度上可抑制該基因的下調(diào)。而1-MCP+MAP聯(lián)合處理果實中，PbTIP1;1和PbTIP2;1表達量在貯藏后期高于其余處理果實。

一般認為，1-MCP能有效延長梨果實的貯藏時間，抑制果肉褐變[26]。但本研究發(fā)現(xiàn)1-MCP對鴨梨冷藏期間果肉褐變并未有顯著效果，反而1-MCP+MAP處理可加重長期冷藏鴨梨（180 d）果肉褐變的發(fā)生（圖3a）。這種情況可能與MAP處理的前提下，1-MCP加重果實發(fā)生冷害有一定關(guān)系。已有文獻報道1-MCP處理可加劇桃[27]、香蕉[28]、番茄[29]和獼猴桃[30]等果實在冷藏期間冷害的發(fā)生。

低溫下水分吸收、運輸和散失的不平衡是植物冷害發(fā)生的原因之一[7]。研究發(fā)現(xiàn)，低溫導致植物水孔蛋白活性及其基因表達、細胞免疫定位發(fā)生變化[31]。已有研究表明，香蕉中MaPIP1;1、MaPIP1;2、MaPIP2;4和MaPIP2;6參與早期冷響應(yīng)[32]。橡樹質(zhì)膜水孔蛋白基因HbPIP1;1啟動子包含乙烯響應(yīng)元件和多種干旱響應(yīng)元件[33]。在擬南芥中對乙烯調(diào)控水孔蛋白通道活性的機制研究發(fā)現(xiàn)，乙烯可促進AtPIP2;1的磷酸化，進而增強水通道活性[34]。本研究發(fā)現(xiàn)PbPIPs和PbTIPs在低溫下表達量均有不同程度變化，其中CK果實中PbPIP2;1、PbPIP2;5在鴨梨冷藏后表達量顯著升高，推測其表達受低溫的誘導。同時，這兩個基因表達量的升高受MAP以及1-MCP的抑制，尤其1-MCP的抑制作用更為明顯；而1-MCP+MAP聯(lián)合處理對PbPIP2;1和PbPIP2;5表達的抑制作用強于單獨處理，進一步推測它們的表達同時受乙烯的調(diào)控。

鴨梨在長期低溫貯藏下仍產(chǎn)生大量乙烯，而1-MCP處理抑制了乙烯的生成（圖2c），抑制了水孔蛋白基因PbPIP2;1、PbPIP2;5在整個貯藏期的表達（圖4c、e），促進了PbTIP1;1在貯藏早期表達量的升高，延緩了在貯藏后期冷害發(fā)生時PbTIP1;1和PbTIP2;1表達量的下降（圖5），導致細胞水分狀況改變，進而引起果實冷害，發(fā)生果肉褐變?？傊?，1-MCP+MAP聯(lián)合處理除了維持自發(fā)氣調(diào)包裝內(nèi)較大的濕度外，使袋內(nèi)CO2濃度較高，而乙烯含量較低，使果實微環(huán)境變得更為復雜。因此，與前人研究結(jié)果相比[21,22]，本研究認為鴨梨長期冷藏過程中果肉褐變發(fā)生不僅僅是高濃度CO2傷害的結(jié)果，很有可能是高濕度、高濃度CO2和冷害共同作用的結(jié)果，其具體機理還需進一步的研究。

圖5 1-MCP及MAP處理后冷藏和貨架期鴨梨果肉PbTIP1;1（a）、PbTIP2;1（b）相對表達量的變化Fig.5 Changes in the relative expression level of PbTIP1;1 (a)and PbTIP2;1 (b) in the flesh of ‘Yali’ pear treated by 1-MCP and MAP during cold and shelf-life storage

3 結(jié)論

1-MCP與MAP處理都可以較好地維持鴨梨長期貯藏期間硬度、SSC，但易導致果肉褐變發(fā)生，此時，果肉中綠原酸含量升高，POD、PPO活性增加；同時，果肉褐變的發(fā)生可能是高濃度CO2和冷害協(xié)同作用的結(jié)果。PbPIP2;1、PbPIP2;5可能參與了鴨梨果實貯藏過程中冷害發(fā)生，其表達受低溫和乙烯的調(diào)控。