一種通過過表達(dá)畢赤酵母翻譯相關(guān)因子提高重組蛋白胞內(nèi)表達(dá)的策略

林雯煬，廖錫豪，陳南柱，黃大富，陳亮，鐘炳旭，梁書利，林影

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510006）

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）是重組蛋白表達(dá)生產(chǎn)的優(yōu)良宿主，它被美國食品藥物管理局認(rèn)定為GRAS（通常認(rèn)為安全的）級微生物[1]，且具有遺傳操作簡便、培養(yǎng)成本低、有接近高等真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后加工和修飾能力[2,3]、可進(jìn)行高密度發(fā)酵[4,5]等優(yōu)點。此外，畢赤酵母還具有甲醇誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動子PAOX1，在以廉價碳一化合物甲醇為唯一碳源的條件下，由PAOX1啟動的AOX1蛋白可達(dá)到胞內(nèi)總蛋白的30%[6]。大量研究實例證明，除了在分泌表達(dá)方面的優(yōu)越性能，畢赤酵母也被廣泛應(yīng)用于重組蛋白的胞內(nèi)表達(dá)，并且胞內(nèi)表達(dá)的重組蛋白具有良好的活性和生物安全性，如HPV-16的L1-L2蛋白[7]、大豆血紅素C2[8,9]、類胡蘿卜素[10,11]、重組人溶菌酶[12]等。因此，優(yōu)化重組蛋白在畢赤酵母的胞內(nèi)表達(dá)具有重要的意義。

目前，畢赤酵母提高重組蛋白胞內(nèi)蛋白表達(dá)的主要策略有啟動子改造，基因拷貝數(shù)增加，密碼子優(yōu)化和發(fā)酵優(yōu)化[13]等，在蛋白質(zhì)翻譯模塊研究鮮有報道。然而，基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平并不是完全一致的，從mRNA到蛋白質(zhì)需要進(jìn)行翻譯和翻譯后修飾等。翻譯作為將mRNA遺傳信息傳遞到蛋白質(zhì)的橋梁，它不僅決定多肽的合成質(zhì)量與生成速率，還影響蛋白質(zhì)的翻譯后易位，折疊，修飾及分泌等。最初，由于蛋白質(zhì)翻譯存在復(fù)雜性，關(guān)于重組蛋白過量表達(dá)在翻譯水平的研究及調(diào)控的報道較少。而近年本實驗室林小瓊等人[14]通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法（iTRAQLC-MS/MS）測定中過表達(dá)木聚糖酶基因xynA畢赤酵母菌株翻譯蛋白系統(tǒng)中翻譯相關(guān)因子的變化，結(jié)果顯示過表達(dá)重組蛋白時翻譯系統(tǒng)的部分翻譯相關(guān)因子出現(xiàn)上調(diào)（本文中定義翻譯相關(guān)因子為通過互作作用參與輔助，調(diào)節(jié)目的蛋白質(zhì)翻譯，折疊和加工的反式作用因子）。即表明部分翻譯相關(guān)因子與重組蛋白過表達(dá)之間存在正相關(guān)關(guān)系。故本文基于Schutter等人[15]發(fā)布的畢赤酵母基因組注釋，選取了部分核糖體蛋白，翻譯起始因子，翻譯延伸因子，氨酰-tRNA合成酶，核糖體生物合成因子和核糖體相關(guān)分子伴侶5類在翻譯及翻譯后修飾中發(fā)揮重大作用的翻譯相關(guān)因子在畢赤酵母中進(jìn)行過表達(dá)，以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白eGFP作為報告蛋白，初篩選出對翻譯有促進(jìn)作用的因子，并用紅色熒光蛋白mRFP驗證了其促進(jìn)重組蛋白表達(dá)的功能。本研究首次提出了在畢赤酵母中過表達(dá)翻譯相關(guān)因子從而提高外源表達(dá)的策略，為從翻譯層面提高重組蛋白及促進(jìn)外源途徑基因表達(dá)提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

宿主菌Pichia pastorisGS115/eGFP、Pichia pastorisGS115/mRFP，質(zhì)粒pPICZA和Escherichia coliTOP10由本實驗室保存；限制性核酸內(nèi)切酶，質(zhì)粒小提等試劑盒，Seamless Master Mix酶購于廣州美基生物科技有限公司；引物由廣州擎科生物技術(shù)有限公司合成。

主要實驗儀器：DRP-90_52型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司；NBS恒溫?fù)u床，美國NBS公司；NanoDrop 1000紫外可見分光光度計，德國Eppendorf公司，凝膠成像儀Gel DocXR；PCR儀、電轉(zhuǎn)儀、水平電泳槽Mini-Sub Cell GT Cell，美國Bio-rad公司。

1.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)網(wǎng)站（https://bioinformatics.psb.ugent.be/orcae/overview/Picpa）上畢赤酵母基因組注釋得到的基因序列，以畢赤酵母GS115為模板，用上，下游引物1-56，分別擴(kuò)增得到基因片段RPS25、ASC1、Tif5、eIF4A，eIF4G、Tif11、Sui1、Tef4、Nip1、eEF1A、eEF2、eEF3、Ded81、Krs1、Ses1、Gln4、Ils1、Dps1、Sch9、Sfp1、Bcy1、Tpk1、Tpk2、Ssz1、Zuo1、Ssb、Egd1、Egd2。將這些片段回收并分別與pPICZA質(zhì)粒通過Seamless Master Mix酶進(jìn)行同源重組，使得目的基因整合至pPICZA質(zhì)粒中的AOX1啟動子下游，（按照美基公司該產(chǎn)品的使用說明書）構(gòu)建重組質(zhì)粒，用E. coliTOP10擴(kuò)增質(zhì)粒并送至廣州擎科生物技術(shù)有限公司測序驗證無基因突變后用于畢赤酵母的轉(zhuǎn)化。

表1 引物匯總表Table 1 Primer used in this study

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1.3 翻譯相關(guān)因子過表達(dá)菌株的構(gòu)建

構(gòu)建得到的重組質(zhì)粒經(jīng)mss1酶線性化（Bcy1用Sac1酶），并用PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒純化后，取10 μL純化回收產(chǎn)物分別加入100 μL感受態(tài)細(xì)胞畢赤酵母GS115/eGFP和GS115/mRFP中，輕輕吹打混勻，轉(zhuǎn)移至冰浴的電擊杯中，冰浴5 min。使用電穿孔儀進(jìn)行fungi檔電擊。電擊結(jié)東后立即加入1 mL冰浴的1 mol/L的山梨醇，混勻后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，于30 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h。取200 μL孵育后的懸浮液用無菌三角扒涂布于YPD抗性平板中，30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d。挑取重組菌株菌落為模板，以每個翻譯相關(guān)因子對應(yīng)的上游引物和通用引物3'AOX1對其進(jìn)行菌落PCR驗證以篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。

1.4 翻譯相關(guān)因子過表達(dá)菌株的搖瓶發(fā)酵

重組蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)分為兩個階段，即菌體的生長階段和重組蛋白的表達(dá)階段。菌體生長階段以甘油為碳源，將已經(jīng)活化的菌種直接接種到5 mL的初始pH 6.0的BMGY搖瓶生長培養(yǎng)基（0.1 g蛋白胨，0.05 g酵母提取物，0.067 g YNB，10%（m/V）的甘油），在30 ℃，250 r/min的條件下培養(yǎng)22～24 h，使菌體進(jìn)行大量的生長繁殖。

在菌體大量繁殖之后，可將其轉(zhuǎn)接到以甲醇為碳源的BMMY液體培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，使其進(jìn)入重組蛋白表達(dá)階段。為控制起始OD相同，可每瓶取2 mL菌液，6000 r/min離心5min，棄上清液。用1 mL BMMY搖瓶生長培養(yǎng)基重懸菌體?？刂艬MMY搖瓶培養(yǎng)基中菌體的起始OD=1.0，將重懸的菌液轉(zhuǎn)接到20 mL BMMY搖瓶生長培養(yǎng)基（0.4 g蛋白胨，0.2 g酵母提取物，0.268 g YNB，1%（V/V）的甲醇）。在30 ℃，250 r/min條件下恒溫培養(yǎng)120 h進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，每隔24 h±2 h取樣測定OD值和熒光強(qiáng)度，菌液取樣量為200 μL。并向培養(yǎng)基中補加200 μL的100%甲醇（AR）。

1.5 菌體生物量與熒光蛋白表達(dá)總量的測定

每次取樣品菌液40 μL稀釋50倍用紫外分光光度計測量OD600代表菌體生物量，剩余菌液13000 r/min離心1 min后的上清液10 μL，用Refloding Buffer（0.05 mol/L NaH2PO4·2H2O，0.1 mol/L NaCl，0.5 mol/L Zmidazole）稀釋20倍后加到96孔板中，每個樣品做3組平行實驗，用酶標(biāo)儀（PerkinElmer）檢測熒光強(qiáng)度代表熒光蛋白表達(dá)總量（eGFP，激發(fā)波長：488 nm，發(fā)射波長：520 nm；mRFP，激發(fā)波長：584 nm，發(fā)射波長：610 nm），則熒光蛋白單位菌體表達(dá)量（每單位菌體生物量熒光蛋白表達(dá)量）計算公式如下：

1.6 數(shù)據(jù)處理

每個重組酵母菌株重復(fù)發(fā)酵三次，每次反應(yīng)合RA設(shè)置三個平行，數(shù)據(jù)值為平行樣品的平均值，用誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用Microsoft Office 2016分析處理數(shù)據(jù)，采用Graph PadPrism 7繪制圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 翻譯相關(guān)因子的選取

本實驗室研究表明，在表達(dá)重組蛋白時，畢赤酵母翻譯系統(tǒng)相關(guān)基因出現(xiàn)上調(diào)的現(xiàn)象，[14]由此我們篩選了在重組蛋白表達(dá)時出現(xiàn)上調(diào)的翻譯相關(guān)因子（表2），嘗試通過過表達(dá)這些翻譯相關(guān)因子，觀察其對重組蛋白的翻譯能力主動地上調(diào)的變化，力圖促進(jìn)重組蛋白表達(dá)。此外，我們還篩選了對翻譯至關(guān)重要的參與IRES介導(dǎo)翻譯起始的Rps25，組成mRNA帽子結(jié)合復(fù)合物的eIF4G，參與翻譯延伸的eEF2和eEF3篩選潛在的重組蛋白翻譯促進(jìn)因子，并分析翻譯相關(guān)因子對重組畢赤酵母重組蛋白表達(dá)及細(xì)胞生長的影響。

表2 Pichia pastoris GS115翻譯相關(guān)因子的篩選Table 2 Selected translation-related factors of Pichia pastoris GS115

2.2 翻譯促進(jìn)因子的初篩選

為研究各個翻譯相關(guān)因子過表達(dá)對重組蛋白表達(dá)的影響，本文以綠色熒光蛋白為報告蛋白，構(gòu)建畢赤酵母翻譯相關(guān)因子過表達(dá)菌株，在BMNY培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測定且計算其菌體生物量、eGFP表達(dá)總量和eGFP單位菌體表達(dá)量，并與未存在翻譯相關(guān)因子重組表達(dá)的eGFP畢赤酵母表達(dá)菌株比較。通過發(fā)酵測定28個翻譯相關(guān)因子對胞內(nèi)eGFP表達(dá)影響的分析，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)翻譯核糖體相關(guān)分子伴侶Ssb可提高eGFP表達(dá)量21.60%，過表達(dá)翻譯延伸因子eEF1A、eEF3、翻譯起始因子eIF4A和氨酰-tRNA合成酶因子Ded81也有明顯促進(jìn)作用。核糖體生物合成因子Bcy1可提高細(xì)胞生物量，從而提高單位體積eGFP表達(dá)量，如圖1。

圖1 發(fā)酵測定28個翻譯相關(guān)因子過表達(dá)菌株的eGFP表達(dá)總量和菌體生物量Fig.1 eGPF intensity and biomass of 28 translation-relatedfactors overexpressed strains

2.3 翻譯促進(jìn)因子的再驗證

為進(jìn)一步驗證對eGFP表達(dá)有促進(jìn)作用的6個潛在的翻譯促進(jìn)因子對重組蛋白表達(dá)有促進(jìn)作用，本文通過發(fā)酵對上文所提及對重組蛋白表達(dá)有促進(jìn)作用的6個翻譯相關(guān)因子進(jìn)行了胞內(nèi)mRFP表達(dá)分析。實驗結(jié)果表明，紅色熒光蛋白mRFP的表達(dá)與綠色熒光蛋白eGFP的表達(dá)實驗結(jié)果相吻合，成功驗證了翻譯相關(guān)因子eIF4A、eEF1A、eEF3、Ded81、Bcy1、Ssb可顯著促進(jìn)重組蛋白的表達(dá)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 發(fā)酵測定6個翻譯相關(guān)因子過表達(dá)菌株的mRFP表達(dá)總量和菌體生物量Fig.2 mRFP intensity and biomass of 6 translation-related factors overexpressed strains

2.4 比較

目前提高畢赤酵母胞內(nèi)表達(dá)的策略主要集中在對重組蛋白基因進(jìn)行改造，如啟動子優(yōu)化[16]、增加基因拷貝數(shù)[17]、密碼子優(yōu)化[18]發(fā)酵條件優(yōu)化，如通過單因素試驗和正交試驗來優(yōu)化培養(yǎng)基成分和搖瓶發(fā)酵條件[19]、改善前體供應(yīng)[16]優(yōu)化pH、溶氧、甲醇流加速率及攪拌轉(zhuǎn)速通風(fēng)量[18]等。本研究通過過表達(dá)翻譯相關(guān)因子，利用反式因子提高蛋白翻譯效率來提高外源表達(dá)，從而使得eIF4A、eEF1A、eEF3、Ded81、Ssb的eGFP單位菌體表達(dá)量分別增加了18.40%、18.80%、29.50%、28.45%、21.60%，使得eIF4A、eEF1A、eEF3、Ded81、Ssb的mRFP單位菌體表達(dá)量分別增加了20.00%、8.00%、19.00%、5.40%、15.40%。此外還篩選到一個可以提高畢赤酵母菌體生物量從而提高畢赤酵母熒光表達(dá)總量的Bcy1翻譯相關(guān)因子，可以使得eGFP表達(dá)菌株生物量增加20.00%，mRFP表達(dá)菌株生物量增加30.90%。說明過表達(dá)翻譯相關(guān)因子提高重組蛋白表達(dá)具有普適性。本研究通過過表達(dá)翻譯相關(guān)因子提高畢赤酵母重組蛋白表達(dá)的策略，雖然相較于提高了4倍重組蛋白胞內(nèi)表達(dá)的密碼子優(yōu)化[18]等策略提高量較少，但首次通過過表達(dá)單一的翻譯相關(guān)因子提高畢赤酵母胞內(nèi)蛋白表達(dá)，為從翻譯層面提高畢赤酵母外源表達(dá)提供了一種新思路。

3 結(jié)論

畢赤酵母是一種甲醇營養(yǎng)型酵母，由于它可以實現(xiàn)高密度發(fā)酵以及作為目前已廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)的重組蛋白，近期人們開始關(guān)注畢赤酵母在外源代謝途徑表達(dá)及新的代謝產(chǎn)物合成的研究。近年來，關(guān)于提高畢赤酵母外源表達(dá)的策略，較多的研究報道集中在增加基因拷貝數(shù)[20]，優(yōu)化外源基因密碼子[21]以及優(yōu)化菌種培養(yǎng)和發(fā)酵條件[22]等，在翻譯層面報道較為缺失，本文選用畢赤酵母誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動子AOX1，以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白eGFP為報告蛋白對28個可能提高外源表達(dá)的翻譯相關(guān)因子進(jìn)行初篩，并用紅色熒光蛋白mRFP為報告蛋白對其提高外源表達(dá)的作用進(jìn)行了復(fù)篩和再驗證，總共篩選到6個翻譯相關(guān)因子eIF4A、eEF1A、eEF3、Ded81，Bcy1、Ssb可顯著提高重組蛋白表達(dá)，其中翻譯延伸因子eEF3可提高eGFP表達(dá)量達(dá)30.90%，核糖體生物合成因子Bcy1可顯著提高細(xì)胞生物量而有利于重組蛋白生產(chǎn)過程中的積累。為提高畢赤酵母重組蛋白及外源途徑基因的表達(dá)提供了新思路。