金槍魚(yú)制品中幾種DNA提取方法的效果比較

許文杰，熊雄，黃曼虹，李壹，操敏，陸利霞，熊曉輝,2

（1.南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇南京 211816）

（2.江蘇省食品安全快速檢測(cè)公共技術(shù)服務(wù)中心，江蘇南京 211816）

金槍魚(yú)（Tuna），又被稱(chēng)為吞拿魚(yú)、鮪魚(yú)，屬于硬骨魚(yú)綱（Osteichthyes）鱸形目（Pereiformes）的鯖科（Scombridae）魚(yú)類(lèi)[1]。肉質(zhì)鮮美柔嫩，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，尤其是其所含的DHA（二十二碳六烯酸）和EPA（二十碳五烯酸）等多不飽和脂肪酸，使得金槍魚(yú)有著“海底黃金”的美稱(chēng)[2]。

金槍魚(yú)制品加工方式多樣，可冰鮮切片、油浸、煎炸、烘烤等。由于加工破壞了外形特征，使得通過(guò)形態(tài)學(xué)的方法對(duì)物種鑒別就變的比較困難。一些不法商販為謀取更大的利潤(rùn)，用低價(jià)值魚(yú)類(lèi)替代高價(jià)值金槍魚(yú)的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。在金槍魚(yú)消費(fèi)市場(chǎng)中，除6種經(jīng)濟(jì)價(jià)值比較高的優(yōu)質(zhì)金槍魚(yú)外，另外一些相似的品種，如巴鰹（Euthynnus affinis）、扁舵鰹（Auxis thazard）、東方狐鰹（Sarda orientalis）等魚(yú)類(lèi)也常常用于生產(chǎn)金槍魚(yú)罐頭、魚(yú)松等產(chǎn)品[3,4]。因此，有效區(qū)分和鑒定金槍魚(yú)品種具有重要意義[5]。

基于DNA技術(shù)的分子生物學(xué)方法具有特異性高、靈敏度強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，在區(qū)分和鑒定魚(yú)源性成分中具有重大意義[6-9]。常見(jiàn)的鑒定方法有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）[10]、DNA條形碼（DNA barcoding）[11-13]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[14-16]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（Real-time PCR）[17-19]。

在檢測(cè)方法建立初期，提取高質(zhì)量、高純度及結(jié)構(gòu)完整的基因組DNA是后續(xù)試驗(yàn)順利進(jìn)行的保障。然而，魚(yú)肉制品在加工過(guò)程中經(jīng)常添加如單寧酸、亞硝酸鹽、脂類(lèi)、酚類(lèi)等大分子化合物，這些物質(zhì)會(huì)影響DNA模板的質(zhì)量，從而導(dǎo)致PCR擴(kuò)增效率降低[20]。Xiong X等[7]從在罐頭制品中提取DNA，發(fā)現(xiàn)DNA質(zhì)量較差，PCR擴(kuò)增成功率只有40%，并發(fā)現(xiàn)罐頭產(chǎn)品中油脂較多抑制了PCR擴(kuò)增效率。Smith等[21]發(fā)現(xiàn)隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，提取的DNA的純度逐漸下降；并且食用油隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，DNA提取產(chǎn)物中的抑制劑也越多。María等[22]比較了4種提取方法對(duì)金槍魚(yú)罐頭的DNA純度的影響，結(jié)果證明不同的提取方法的A260/A280以及A260/A230不同。楊珺茹等[23]從深加工魚(yú)肉制品提取DNA，發(fā)現(xiàn)不同加工方式的魚(yú)肉中DNA含量有所差異，且不同提取方法提取同一種樣品的純度存在差異。

基于以上的研究，本文擬采用SDS法和2種市售試劑盒對(duì)金槍魚(yú)制品基因組DNA進(jìn)行提取，并利用16S rDNA序列引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)比較DNA的質(zhì)量及PCR擴(kuò)增成功率，旨在找到一種較為理想的DNA提取方案，以保障后續(xù)物種鑒定的順利進(jìn)行。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集

2019年11月至12月，從市場(chǎng)共采集18份預(yù)包裝金槍魚(yú)產(chǎn)品（表1），包括9份肉松產(chǎn)品（編號(hào)為XWJ1-XWJ9）和9份罐裝制品（編號(hào)為XWJ20-XWJ28）。所有產(chǎn)品抵達(dá)實(shí)驗(yàn)室后需進(jìn)行拍照和標(biāo)記，并記錄好產(chǎn)品標(biāo)簽上的信息。當(dāng)產(chǎn)品包裝內(nèi)有多個(gè)獨(dú)立小包裝時(shí)，每個(gè)小包裝需單獨(dú)取樣，總計(jì)取樣28份（表1），于-18 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 深加工魚(yú)樣品信息及分子鑒定結(jié)果Table 1 Information and molecular identification of fish samples from deep processing

1.1.2 試劑

細(xì)胞/血液/組織基因組DNA提取試劑盒（Code No.DP304），天根生化科技有限公司；Takara細(xì)胞/血液/組織基因組DNA提取試劑盒（Code No. 9178），寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖凝膠，西班牙Biowest公司；GelRedTM核酸染料，美國(guó)Biotium公司；引物合成，上海生工生物有限公司；SYBR混合液（with low ROX）、2×Taq PCR Master Mix，上海生工生物有限公司；100 bp DNA Ladder，天根生化科技有限公司；6×Loading Buffer，寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

BioPhotometer D30核酸蛋白測(cè)定儀，德國(guó)Eppendorf公司；JY-SPFT電泳槽，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；Tannon-1600凝膠成像儀，上海天能科技有限公司；GWA-UNI-F40純水/超純水器，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；MS-100恒溫混勻儀，杭州奧盛儀器有限公司；LightCycler? 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，瑞士羅氏集團(tuán)；全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)（Code No. Gentier 96），西安天隆科技有限公司；臺(tái)式小型離心機(jī)（1-14k），德國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

SDS法：參照Xiong X等[24]的提取方法進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)。取樣品約100 mg于1.5 mL離心管中，加入100 μL SDS裂解緩沖液[2% (W/V) SDS，0.1 M NaCl，0.1 M EDTA，0.5 M Tris，pH=8.0]、100 μL磷酸緩沖液（0.3 M NaH2PO4，pH=8.0）和20 μL的蛋白酶K（20 mg/μL），并置于恒溫混勻儀中60 ℃溫浴50 min。將混合物在室溫條件下以14000 r/min離心5 min，取上清液至新的1.5 mL離心管，加入1倍體積乙酸鈉溶液（4M CH3COONa，pH=8.2），混勻后14000 r/min離心5 min。取上清至新的離心管中，加入0.6倍體積異丙醇，混勻后靜置10 min，12000 r/min離心10 min棄上清。最后，用70%乙醇和100%無(wú)水乙醇分別清洗DNA兩次和一次，65 ℃烘箱烘干后，加入20 μL滅菌超純水溶解DNA，保存于-20 ℃。

細(xì)胞/血液/組織基因組DNA提取試劑盒（以下簡(jiǎn)稱(chēng)Tiangen試劑盒）：稱(chēng)取100 mg樣品，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA，最后在吸附柱中加入50 μL TE洗脫液洗脫DNA，保存于-20 ℃。

Takara細(xì)胞/血液/組織基因組DNA提取試劑盒（以下簡(jiǎn)稱(chēng)Takara試劑盒）：取樣品約50 mg放入裝有0.5 mL Extraction Solution試劑的Microtube中。蓋緊Microtube蓋，70 ℃水浴處理10 min，在室溫條件下12000 r/min離心10 min，最后用移液槍吸取水層。其中肉松產(chǎn)品吸取200 μL水層體積，罐頭產(chǎn)品吸取100 μL，保存于-20 ℃。

1.2.2 樣品DNA質(zhì)量和濃度測(cè)定

采用BioPhotometer D30核酸蛋白測(cè)定儀分別測(cè)定DNA在230 nm、260 nm和280 nm波長(zhǎng)處的吸光值，計(jì)算A260/A280和A260/A230值，同時(shí)測(cè)定DNA濃度。

1.3 PCR擴(kuò)增

1.3.1 普通PCR

對(duì)3種方法提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由于每種DNA提取方法的取樣量不同，為了在同一水平上比較和評(píng)價(jià)各提取方法，先對(duì)提取的DNA進(jìn)行稀釋。調(diào)整后樣品DNA濃度均為30 ng/μL。PCR反應(yīng)采用25 μL體系：包括12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix，上、下游引物（10 μM）各1 μL（表2），DNA模板1 μL，加無(wú)菌水補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)程序參考文獻(xiàn)[25,26]。反應(yīng)結(jié)束后，以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

表2 通用引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小Table 2 The sequences and products size of universal primers

1.3.2 熒光定量PCR

對(duì)提取的DNA進(jìn)行稀釋?zhuān){(diào)整后樣品DNA濃度均為30 ng/μL。肉松產(chǎn)品采用327 bp的目的片段擴(kuò)增，罐頭產(chǎn)品采用242 bp的目的片段擴(kuò)增。熒光定量PCR采用20 μL反應(yīng)體系：SYBR Mixture(With low ROX)預(yù)混液10 μL，上、下游引物（10 μM）各1 μL，DNA模板1 μL，無(wú)菌水補(bǔ)至20μL。每個(gè)循環(huán)結(jié)束檢測(cè)熒光。擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行溶解曲線分析，設(shè)置72 ℃為起始溫度，升溫至95 ℃，再降溫至65 ℃保持60 s，1 s升溫至97 ℃。反應(yīng)結(jié)束后，分析擴(kuò)增曲線，根據(jù)循環(huán)閾值（cycle threshold，CT值）判定不同樣品處理方式和提取方法對(duì)熒光PCR擴(kuò)增的影響，隨后分析溶解曲線，通過(guò)溶解溫度(Melting Temperature，TM值）的大小區(qū)分不同物種。

1.3.3 物種鑒定

以市售產(chǎn)品為材料，參照1.3.1方法進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，挑選擴(kuò)增成功并且條帶單一的產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序。采用BioEdit軟件對(duì)測(cè)序所得的峰圖進(jìn)行校對(duì)拼接，去除正反向引物和低質(zhì)量的序列后，提交數(shù)據(jù)庫(kù)（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對(duì)分析，根據(jù)序列相似度比較的結(jié)果（相似度≥98%），確認(rèn)各樣品的物種類(lèi)別。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分別對(duì)3種方法提取的DNA得率、A260/A280和A260/A230值進(jìn)行分析，由于樣品方差不齊，根據(jù)Kruskal-Wallis K獨(dú)立參數(shù)求出p值，若p值小于0.05，說(shuō)明兩組間存在顯著性差異，若p值大于0.05說(shuō)明兩組間無(wú)顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 DNA的純度

通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定3種提取方法的純度見(jiàn)表3和圖1。A260/A280比值表示蛋白質(zhì)和酚物質(zhì)的去除情況，純度較好的DNA比值為1.8左右。比值較低說(shuō)明受到蛋白（芳香族）或酚類(lèi)物質(zhì)的污染[27]。對(duì)于肉松樣品（XWJ1-XWJ9），Takara試劑盒的平均比值為1.08±0.14，純度較差，Tiangen試劑盒和SDS法的A260/A280比值都在1.8左右，純度較好。對(duì)于罐頭樣品（XWJ20-XWJ28），Tiangen試劑盒和SDS法的A260/A280比值分別為1.80、1.86。而Takara試劑盒的比值為1.11，顯著低于其他兩種；A260/A230比值表示糖類(lèi)、鹽分等的去除情況，純度較好的DNA溶液比值為2.0左右。若比值小于2.0，說(shuō)明樣品中碳水化合物（糖類(lèi)）、或有機(jī)溶劑含量較高。Tiangen試劑盒平均比值為1.02，SDS法和Takara試劑盒的平均比值分別為0.7、0.25。表明雜質(zhì)殘留較多，可能的原因之一是中金槍魚(yú)產(chǎn)品含有大量的油脂較難去除，與某些鹽離子產(chǎn)生吸附。也可能存在未降解的RNA在260 nm處產(chǎn)生了較高吸收值。

表3 三種方法提取的DNA純度Table 3 DNA purity extracted by three methods

2.2 DNA的得率

3種方法提取的DNA得率見(jiàn)表4和圖1。其中Takara試劑盒所提取出來(lái)的DNA得率遠(yuǎn)高于其他兩種方法，對(duì)比肉松和罐頭制品的DNA得率，肉松品的DNA得率普遍高于罐頭制品。Tagliavia M等[28]發(fā)現(xiàn)在DNA提取過(guò)程中，采用蛋白酶K、洗滌劑、樹(shù)脂和有機(jī)萃取的提取步驟，導(dǎo)致DNA得率降低。SDS法通過(guò)蛋白酶k去除蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)和雜質(zhì)，Tiangen試劑盒采用特異性膜吸附DNA（即膜吸附柱）進(jìn)行純化。兩種方法提取的DNA質(zhì)量較好，但DNA得率偏低。

圖1 三種方法提取的DNA得率和DNA純度Fig.1 DNA yield and DNA purity extracted by three methods

表4 三種方法提取的DNA得率Table 4 DNA yield extracted by three methods

2.3 PCR方法對(duì)于DNA質(zhì)量的驗(yàn)證

PCR擴(kuò)增對(duì)模板DNA的質(zhì)量要求較高，因此，PCR擴(kuò)增成功率成為判定DNA質(zhì)量的重要依據(jù)之一。由于金槍魚(yú)產(chǎn)品在加工過(guò)程中需經(jīng)過(guò)高溫高壓處理，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[29]，DNA片段降解嚴(yán)重。為考察DNA降解程度，并保證獲取足夠數(shù)量和質(zhì)量的DNA模板以適用于后續(xù)分子生物學(xué)研究，以3種方法分別從樣品中提取的DNA作為模板，用表2中3對(duì)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖如圖2、3所示。3種方法的陽(yáng)性對(duì)照均可得到明顯的電泳條帶，空白無(wú)條帶，但不同提取方法間條帶明暗程度差異較大，Tiangen試劑盒，SDS法提取DNA純度較好，擴(kuò)增條帶較亮。而Takara提取的DNA無(wú)清晰條帶。

圖2 三種提取方法所得肉松樣品PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results PCR three extraction methods

圖3 三種提取方法所得罐頭樣品PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification of canned samples PCR three extraction methods

2.4 熒光定量PCR

為了更好的反映不同提取方法之間的PCR擴(kuò)增效率，本研究選擇靈敏度更高的實(shí)時(shí)熒光定量PCR。從表5可以看出，Tiangen試劑盒的平均CT值為22.11，SDS法平均CT值為22.75，Takara試劑盒平均比值為24.01。Tiangen試劑盒和SDS法平均CT值無(wú)顯著差異。從擴(kuò)增曲線看（圖4和圖5），Tiangen試劑盒和SDS法擴(kuò)增效果較好，而Takara試劑盒熒光強(qiáng)度較低，表明該方法雖然在提取時(shí)間上有優(yōu)勢(shì)，但提取的DNA可能存在某些PCR抑制因子，能抑制PCR反應(yīng)。

圖4 三種提取方法所得肉松樣品擴(kuò)增曲線Fig.4 Amplification curves of meat pine samples obtained from three extraction methods

圖5 三種提取方法所得罐頭樣品擴(kuò)增曲線Fig.5 Amplification curves of canned samples obtained from three extraction methods

表5 三種方法提取的CT值和TM值Table 5 CT and TM values extracted by the three methods

2.5 鑒定結(jié)果及分析

市售產(chǎn)品分子鑒定結(jié)果見(jiàn)（表1）。所有市售肉松產(chǎn)品（N=10）其中XWJ2-1可在物種水平鑒定，鑒定結(jié)果為Istiophorus platypterus。剩余的9個(gè)產(chǎn)品被鑒定至屬水平。對(duì)于罐頭產(chǎn)品（N=18），XWJ20-2、XWJ22-1、XWJ22-2、XWJ23-1、XWJ23-2、XWJ24-1、XWJ24-2這些產(chǎn)品被鑒定至屬水平。其他罐頭產(chǎn)品鑒定結(jié)果失敗。線粒體DNA作為核外遺傳物質(zhì)，具有分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、嚴(yán)格的母系遺傳、無(wú)重組、快速進(jìn)化、多拷貝及穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)利用線粒體16S rDNA對(duì)金槍魚(yú)產(chǎn)品的鑒定，但在種水平鑒定成功率較低，可能的原因有：（1）數(shù)據(jù)庫(kù)中現(xiàn)有的序列數(shù)太少，無(wú)法準(zhǔn)確匹配所有物種；（2）挑選的片段較保守，無(wú)法區(qū)分一些親緣關(guān)系較近的物種。

2.6 各種DNA提取方法的比較

根據(jù)上述DNA濃度的測(cè)定結(jié)果，分光光度計(jì)對(duì)A260/A280和A260/A230兩個(gè)比值的測(cè)定結(jié)果，以及PCR擴(kuò)增結(jié)果對(duì)各DNA提取方法進(jìn)行綜合分析，同時(shí)對(duì)提取過(guò)程的簡(jiǎn)易程度等其他因素也進(jìn)行了分析和總結(jié)，各方法的優(yōu)缺點(diǎn)歸納于見(jiàn)（表6）。

表6 三種DNA提取方法優(yōu)缺點(diǎn)比較Table 6 A comparison of advantages and disadvantages of three DNA extraction methods

3 結(jié)論

金槍魚(yú)制品中因含有多糖、多酚和色素等化合物，導(dǎo)致DNA提取相對(duì)困難。本研究通過(guò)DNA的質(zhì)量、得率、PCR擴(kuò)增成功率，比較了2種市售試劑盒和SDS法用于金槍魚(yú)制品的DNA提取。結(jié)果表明，SDS法成本最低，在試驗(yàn)耗時(shí)、DNA純度和濃度、鹽殘留、對(duì)熒光定量PCR的抑制等方面均較好?？稍诙虝r(shí)間裂解細(xì)胞，加快DNA獲取效率。針對(duì)魚(yú)肉產(chǎn)品易腐敗變質(zhì)和DNA降解的特點(diǎn)，加快DNA獲取效率用于物種鑒定有一定應(yīng)用價(jià)值。