非水相酶促合成不同鏈長(zhǎng)的對(duì)香豆酸酯及其自由基清除能力

尹霞，辛璇，李曉鳳

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

對(duì)香豆酸(PCA)是一種廣泛存在于水果和蔬菜中的植物酚酸，如蘋果、葡萄、柑橘、菠菜和谷類，在一些中藥中也有豐富的含量[1-4]。它具有豐富的生物活性，包括清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、保護(hù)機(jī)體免受氧化性心臟損傷[5]、抗炎活性[6]。然而，據(jù)報(bào)道，對(duì)香豆酸的親水性是一個(gè)嚴(yán)重的缺點(diǎn)，因此限制了它們?cè)谥竞陀椭到y(tǒng)[7]中的抗氧化作用。為了克服這一限制，報(bào)道了通過(guò)酯化向酚酸中添加脂肪族側(cè)鏈基團(tuán)，驗(yàn)證了酚酸的改性后抗氧化活性增強(qiáng)，從而產(chǎn)生有價(jià)值的具有潛在乳化作用的酚類脂類，提高抗氧化性能。

迄今為止，已有報(bào)道稱酚酸的?；蠖嗍峭ㄟ^(guò)化學(xué)催化或生物催化實(shí)現(xiàn)的，但傳統(tǒng)的化學(xué)催化存在選擇性差、試劑毒性大、條件苛刻等明顯缺點(diǎn)。眾所周知，酶催化可以克服化學(xué)催化的缺點(diǎn)，具有環(huán)境友好、副作用少、選擇性高等明顯優(yōu)勢(shì)[8,9]。盡管對(duì)香豆酸的酯化化學(xué)合成反應(yīng)有報(bào)道，但催化效率低，且合成產(chǎn)物的抗氧化活性幾乎沒(méi)有研究[10]。

酚酸的抗氧化能力在總體上已經(jīng)得到了充分的證明，特別是在親脂體系中，對(duì)香豆酸具有顯著的抗氧化能力，可與BHA/BHT[11]相媲美。與此同時(shí)，許多報(bào)道表明，酚酸作為抗氧化劑的效果是通過(guò)酯化而增強(qiáng)的[12]。固定化脂肪酶是合成各種酚類酯的最常用酶之一。在這種背景下，通過(guò)酶催化不同鏈長(zhǎng)對(duì)香豆酸，可以充分增加改性后化合物的穩(wěn)定性和抗氧化活性，特別是油脂系統(tǒng)的抗氧化活性，然而，直接與不同的酚酸的酯化脂肪酸醇非常低效，通過(guò)與對(duì)香豆酸甲酯與醇進(jìn)行酯交換可以達(dá)到更高的轉(zhuǎn)化率[13]。

因此，通過(guò)固定化脂肪酶，以對(duì)香豆酸甲酯和不同的脂肪醇為原料合成了一系列對(duì)香豆酸酯衍生物，為對(duì)香豆酸的改性提供了一種簡(jiǎn)便有效的途徑?？疾炝酥久阜N類、溶劑、含水量、底物摩爾比、溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)催化性能的影響。在最佳條件下，合成了不同鏈長(zhǎng)PCA酯類衍生物。在清除自由基實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的抗氧化能力，有望在不同的食品、藥物和化妝品體系中得到應(yīng)用，也為酯類衍生物的合成提供了有益的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲基反式對(duì)香豆酸酯(純度＞98%)和1-辛醇均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Novozym 435、Lipozyme 40086、Lipozyme TLIM、Lipase PSIM均購(gòu)自丹麥諾維信公司；Lipase AY 30、Lipex Evity 100 t、AMANO Lipase PS均購(gòu)自日本天野酶公司。

1.2 主要儀器

KH-2000型薄層色譜掃描儀，上?？瀑R生化科技有限公司；高效液相色譜-質(zhì)量光譜儀（LC-MS），（Bruker Co.，德國(guó)）等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 脂肪酶催化對(duì)香豆酸甲酯的酯交換反應(yīng)

將甲基反式對(duì)香豆酸酯（20 mM）、脂肪醇（1000 mM）和固定化脂肪酶（40 mg/mL）分別置于吡啶/環(huán)己烷（4:6）（V/V）中，在活化分子篩（4?，10%W/W）的存在下進(jìn)行。隨后，將反應(yīng)混合物在50 ℃下180 r/min的攪拌器上孵育4 d。在規(guī)定的時(shí)間間隔從反應(yīng)混合液中提取20 μL，用甲醇稀釋50倍，高效液相色譜（HPLC）分析，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)三次。為獲得高純度的產(chǎn)品，反應(yīng)液體與甲醇通過(guò)減壓蒸餾純化，然后分成不同的組件通過(guò)薄層色譜洗脫液己烷/EA（85:15，V/V）0.3 mm層硅膠通過(guò)紫外燈（254 nm）觀察產(chǎn)物及其條帶，如果需要，炭化后噴灑30%（V/V）硫酸加熱（200 ℃）緊隨其后。在真空干燥條件下，所有產(chǎn)品均為黃色粉末，通過(guò)高效液相色譜分析，其純度超過(guò)95%。

1.3.2 高效液相色譜分析

反應(yīng)混合物在4.6 mm A 250 mm Zorbax bs-c18柱（Agilent Technologies Co.，Massachusetts）上使用Waters 600E泵和Waters 2996 UV/光電二極管陣列檢測(cè)器（Waters Corp.，Massachusetts）在308 nm處進(jìn)行分析。流動(dòng)相采用甲醇和水的混合物（85:15，V/V）流速為0.9 mL/min。對(duì)香豆酸1、反式對(duì)香豆酸甲酯2、丁基酯3a、己基酯3b、辛酯3c、癸酯3d、月桂酯3e的保留時(shí)間分別為2.65、3.33、5.06、7.46、12.30、22.12、42.08 min。轉(zhuǎn)化率和初始速率分別由方程式1和方程式2計(jì)算，其中A0和At分別為反應(yīng)前和反應(yīng)后對(duì)-香豆酸甲酯的峰面積；C0和Ct分別為反應(yīng)前后對(duì)-香豆酸甲酯的濃度（mmol/L）；t是反應(yīng)時(shí)間（h）。

1.3.3 不同鏈長(zhǎng)對(duì)香豆酸酯抗氧化能力測(cè)定

為了評(píng)價(jià)p-CA酯類衍生物[14]清除DPPH自由基的能力，對(duì)Blois方法進(jìn)行了輕微修改。以乙醇為溶劑，制備濃度為2×10-4mol/L的DPPH自由基溶液。溶液保存在4 ℃的冰箱中供以后使用。將0.5 mL p-CA酯衍生物加入4 mL 2×10-4mol/L DPPH自由基溶液中搖勻，室溫靜置30 min。然后測(cè)量517 nm處的吸收值A(chǔ)i。同時(shí)測(cè)定4 mL 2×10-4mo1/L DPPH自由基溶解在0.5 mL 60%乙醇混合物中的吸光度A0。清除DPPH的百分率計(jì)算公式如下:

式中，A0為控制反應(yīng)的吸光度，A1為p-CA或其他清除劑存在時(shí)的吸光度。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有檢驗(yàn)均為3個(gè)平行，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用杜基多重比較檢驗(yàn)來(lái)確定參數(shù)平均值之間的顯著差異。使用SPSS 17.0軟件（SPSS, Inc., Chicago,IL）分析數(shù)據(jù)。p＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)產(chǎn)物分析

圖3 脂肪酶Novozym435催化轉(zhuǎn)化合成對(duì)香豆酸己酯液相色譜圖Fig.3 HPLC diagram of catalytic conversion of Novozym435 to p-coumarate hexyl ester

圖4 脂肪酶Novozym435催化轉(zhuǎn)化合成對(duì)香豆酸辛酯液相色譜圖Fig.4 Diagram of catalytic conversion of Novozym435 to octyl coumarate

圖5 脂肪酶Novozym435催化轉(zhuǎn)化合成對(duì)香豆酸癸酯液相色譜圖Fig.5 HPLC diagram of catalytic conversion of Novozym435 to decyl p-coumarate

圖6 脂肪酶Novozym435催化轉(zhuǎn)化合成對(duì)香豆酸月桂酯液相色譜圖Fig.6 HPLC diagram of catalytic conversion of Novozym435 tolauryl p-coumarate

將脂肪酶Novozym 435對(duì)對(duì)香豆酸甲酯催化轉(zhuǎn)酯后的反應(yīng)液進(jìn)行高效液相色譜分析，其液相色譜圖如圖1～6所示。

圖1 對(duì)香豆酸甲酯的標(biāo)液液相色譜圖Fig.1 Standard liquid chromatography of methyl coumarate

對(duì)照?qǐng)D1與圖2～6可知，對(duì)香豆酸甲酯發(fā)生轉(zhuǎn)酯反應(yīng)之后的生成的對(duì)香豆酸丁酯、對(duì)香豆酸己酯、對(duì)香豆酸辛酯、對(duì)香豆酸癸酯、對(duì)香豆酸月桂酯的保留時(shí)間分別為5.08、7.46、12.30、22.12、42.08 min。

圖2 脂肪酶Novozym435催化轉(zhuǎn)化合成對(duì)香豆酸丁酯液相色譜圖Fig.2 HPLC diagram of catalyzed conversion of Novozym435 to butyl p-coumarate

2.2 非水相體系催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)

2.2.1 脂肪酶對(duì)反應(yīng)體系的影響

以脂肪酶PSIM、Lipozyme 40086、脂肪酶AY 30、Lipex Evity 100T、脂肪酶PS AMANO、Lipozyme TLIM、Novozyme 435等7種固定化脂肪酶對(duì)香豆酸甲酯酯交換反應(yīng)進(jìn)行篩選，結(jié)果見(jiàn)表1。在7種脂肪酶中，Novozym 435在有機(jī)溶劑中反應(yīng)12 h后底物轉(zhuǎn)化率（45.20%）和初反應(yīng)速率[2.46 mmol/(L·h)]最好，而其他脂肪酶幾乎不能催化反式對(duì)香豆酸甲酯的酯交換反應(yīng)。因此，本研究選擇Novozym 435作為合成對(duì)香豆酸酯衍生物的生物催化劑。

表1 脂肪酶對(duì)對(duì)香豆酸甲酯酯交換反應(yīng)的影響Table 1 Effect of lipase on transesterification of methyl p-coumarate

2.2.2 有機(jī)溶劑對(duì)反應(yīng)體系的影響

對(duì)于對(duì)香豆酸甲酯的酯交換反應(yīng)，溶劑在反應(yīng)體系中的作用非常重要，有機(jī)溶劑的組成對(duì)脂肪酶的活性和固體底物的溶解有很大的影響。雖然對(duì)香豆酸甲酯在大多數(shù)有機(jī)溶劑中都能溶解，但本實(shí)驗(yàn)表明，疏水體系反應(yīng)中酯交換反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率更高，尤其是環(huán)己烷（如圖7）。

圖7 有機(jī)溶劑對(duì)Novozym 435催化合成對(duì)香豆酸辛酯的影響Fig.7 Effect of organic solvents on octyl coumarate catalyzed by Novozym 435

可以認(rèn)為，疏水溶劑的加入降低了反應(yīng)體系的極性，從而通過(guò)阻止水剝離來(lái)減弱極性溶劑對(duì)脂肪酶的失活作用。這與“疏水溶劑有利于脂肪酶活性的維持”的理論是一致的。結(jié)果表明，由環(huán)己烷和吡啶組成的二元溶劑是最適合該反應(yīng)的反應(yīng)介質(zhì)，提供了期望的酯衍生物，在24 h轉(zhuǎn)化率為63.62%。此外，為了進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化率，還研究了吡啶與環(huán)己烷的配比對(duì)酯交換反應(yīng)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了它在疏水體系中具有較高的轉(zhuǎn)化率，當(dāng)吡啶與環(huán)己烷的比例為1:9時(shí)，反應(yīng)速率和轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到98%（如圖8）。

圖8 不同溶劑配比對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.8 Influence of different solvent ratio on conversion rate

2.2.3 反應(yīng)體系條件對(duì)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響

為了進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)條件，我們依次考察了一些關(guān)鍵變量對(duì)脂肪酶催化的香豆酸甲酯酯交換反應(yīng)的影響，見(jiàn)圖9～12。

圖9 溫度對(duì)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響Fig.9 Influence of temperature on transesterification reaction

圖9 溫度、圖10酶的用量、圖11底物摩爾比和圖12分子篩用量對(duì)香豆酸酯交換反應(yīng)的影響。除非另有說(shuō)明，否則采用以下反應(yīng)條件：20 mM反式對(duì)香豆酸甲酯、80 mM 1-辛醇、40 mg/mL Novozym 435、2 mL 90%環(huán)己烷-吡啶二元溶劑、50 ℃、180 r/min、反應(yīng)時(shí)間24 h。

圖10 酶的用量對(duì)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響Fig.10 Influence of enzyme dosage on transesterification reaction

圖11 底物摩爾比對(duì)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響Fig.11 Effect of substrate molar ratio on transester reaction

圖12 分子篩用量對(duì)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響Fig.12 Influence of molecular sieve dosage on transesterification reaction

圖9 顯示了20～70 ℃不同溫度下反應(yīng)溫度對(duì)酯交換反應(yīng)的影響。Novozym 435是一種耐熱酶，溫度范圍很廣（20～110 ℃）。較高的溫度可能會(huì)增加其催化活性。轉(zhuǎn)化率越高，引發(fā)速率越高，溫度越高。較高的溫度增加了底物和酶之間有效碰撞的頻率。50 ℃的反應(yīng)溫度足以在48 h內(nèi)使轉(zhuǎn)化率高達(dá)99%。圖10顯示了脂肪酶用量對(duì)反式對(duì)香豆酸甲酯酯交換反應(yīng)的影響。事實(shí)上，較高的脂肪酶含量為?；钢虚g體的形成提供了更多的活性位點(diǎn)，從而縮短了反應(yīng)平衡時(shí)間?？紤]到脂肪酶的成本和效率，40 mg/mL的Novozym 435在經(jīng)濟(jì)上更有吸引力，對(duì)反應(yīng)沒(méi)有不良影響。在優(yōu)化的反應(yīng)條件下，快速合成了對(duì)香豆酸辛酯，24 h內(nèi)轉(zhuǎn)化率達(dá)99%。圖11顯示的摩爾比的增加辛醇/對(duì)香豆酸甲酯從1到20（mol/mol）帶來(lái)顯著增加反應(yīng)速率和轉(zhuǎn)換，而進(jìn)一步增加疏水性，辛醇過(guò)量導(dǎo)致反應(yīng)效率的下降歸因于它們之間的交互?；w/對(duì)香豆酸甲酯摩爾比率和其他因素影響的酰化反應(yīng)。由于形成酯的量受反應(yīng)平衡控制，因此要促進(jìn)對(duì)香豆酸酯的合成，就需要稍過(guò)量的醇給體。因此，本研究選用的摩爾比為1:8。圖12顯示了分子篩用量的影響，由于水解反應(yīng)是由甲酯和辛酯發(fā)生的，因此控制含水率尤為重要。加入4A分子篩可以看出，隨著分子篩質(zhì)量的提高，水解反應(yīng)立即被抑制，反應(yīng)和轉(zhuǎn)化率顯著提高。限制反應(yīng)介質(zhì)的含水量，使反應(yīng)平衡朝著酯交換反應(yīng)的方向發(fā)展，使水解作用降到最低。但在反應(yīng)介質(zhì)中有少量的水是必需的，以溶解酶并保持其活性;但如果含水量過(guò)高，則會(huì)降低反應(yīng)的產(chǎn)率。

2.3 對(duì)香豆酸酯衍生物對(duì)自由基清除作用

在DPPH測(cè)定中，抗氧化劑能將穩(wěn)定的自由基DPPH還原為黃色的二苯基-苦基肼。這種方法是基于乙醇中DPPH的減少，在存在供氫抗氧化劑的情況下，由于反應(yīng)中形成了非自由基形式DPPH-h。DPPH常作為評(píng)價(jià)抗氧化劑清除自由基活性的試劑。20 uM時(shí)對(duì)香豆酸的DPPH自由基清除活性為56.34%。在相同濃度下，對(duì)香豆酸月桂酯、對(duì)香豆酸癸酯、對(duì)香豆酸辛酯、對(duì)香豆酸己酯、對(duì)香豆酸丁酯和TBHQ的DPPH自由基清除活性分別為73.91%、70.32%、68.90%、60.62%、43.65%和67.51%。結(jié)果表明，對(duì)香豆酸月桂酯清除DPPH自由基的活性高于對(duì)香豆酸和TBHQ，但低于Trolox（圖13）。這些數(shù)據(jù)清楚地表明，對(duì)香豆酸是DPPH的有效電子或氫原子供體，長(zhǎng)鏈醇的引入大大提高了其抗氧化能力。與同類的酚酸衍生物作對(duì)比[15]，非水相酶促合成的長(zhǎng)鏈酯的自由基清除能力與同類型酚酸比較有顯著提高，同時(shí)該研究表明酚類物質(zhì)與抗氧化活性上存在相應(yīng)的量效關(guān)系。將對(duì)香豆酸月桂酯與果肉中的總有機(jī)酸的抗氧化能力作對(duì)比[16]，發(fā)現(xiàn)其清除率73.91%明顯高于總有機(jī)酸56.21%，證明其良好的清除自由基能力。

圖13 對(duì)香豆酸衍生物和參比抗氧化劑對(duì)DPPH自由基的清除活性Fig.13 DPPH radical scavenging activity of coumaric acid derivatives and reference antioxidants

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了Novozym 435脂肪酶在非水相體系中催化對(duì)香豆酸甲酯與幾種脂肪醇的酯交換反應(yīng)，結(jié)果顯示：在非水相中轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率可達(dá)98%并得到該反應(yīng)最佳條件為，脂肪酶Nov.435 40 mg/mL，溶劑為吡啶：環(huán)己烷=1:9，底物摩爾比=1:10，溫度50 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min。通過(guò)DPPH自由基清除能力的測(cè)定，合成的對(duì)香豆酸月桂酯、對(duì)香豆酸癸酯的清除率為73.91%、70.32%均高于原化合物56.34%，表明對(duì)香豆酸酯衍生物表現(xiàn)出較好的抗氧化活性。因此，合成的具有不同抗氧化活性的酯類衍生物有望應(yīng)用于不同的食品、藥物和化妝品體系中，為其衍生物在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供了有益的指導(dǎo)。