老年晚期胃癌及胃黏膜增生性病變患者Survivin、PTEN與cdx2表達(dá)及其預(yù)后價(jià)值

楊世榮

(青海省第五人民醫(yī)院，青海 西寧 810000)

胃癌早期發(fā)病并展開手術(shù)治療預(yù)后良好，5年生存率可達(dá)到90.0%以上，然而當(dāng)疾病確診時(shí)，多已進(jìn)入晚期，治療難度增加〔1〕。晚期胃癌與胃黏膜的增生性病變有緊密聯(lián)系性，如何對(duì)二者進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別已經(jīng)成為近年來胃黏膜病理診斷的一個(gè)重難點(diǎn)問題〔2〕。當(dāng)前，在晚期胃癌、胃黏膜增生性病變的鑒別診斷中免疫組織化學(xué)技術(shù)廣泛被應(yīng)用。存活蛋白(Survivin)、磷酸酯酶抑制基因(PTEN)、腸道特異性轉(zhuǎn)錄因子(cdx2)三個(gè)免疫組織化學(xué)指標(biāo)在晚期胃癌、胃黏膜增生性病變預(yù)后判斷中的價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 2016年7月至2017年8月于青海省第五人民醫(yī)院接受診治的老年晚期胃癌患者中選43例，設(shè)為胃癌組，男23例，女20例，年齡61～72歲，平均(66.2±4.5)歲；于同期在青海省第五億醫(yī)院接受診治的胃黏膜增生性病變患者中選46例，設(shè)為黏膜組，男24例，女22例，年齡61～76歲，平均(67.1±3.7)歲；選擇胃黏膜正常者45名設(shè)為健康組，男23例，女22例，年齡60～73歲，平均(66.1±6.4)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①胃癌組、黏膜組經(jīng)《WHO腫瘤病理學(xué)及遺傳學(xué)分類·消化系統(tǒng)腫瘤》〔3〕中的診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為晚期胃癌、胃黏膜增生性病變，健康組明確胃黏膜無上訴或其他病變；②胃癌組有完整的外科切除標(biāo)本，黏膜組、健康組有完整的胃鏡活檢標(biāo)本；③對(duì)研究知曉并配合對(duì)知情同意書進(jìn)行簽署者；④得到醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理會(huì)知情同意者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①不符合納入標(biāo)準(zhǔn)者；②接受過放化療者；③接受過免疫治療者。3組一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1試劑與設(shè)備 Elivision TM plus試劑盒及枸櫞酸緩沖液均購于邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，枸櫞酸緩沖液編號(hào)為MVS-0100；磷酸緩沖鹽溶液、鹽酸酒精自主配置；乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復(fù)液購于邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，編號(hào)MVS-0075；過氧化氫溶液購于廣東恒健制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H44023919；非免疫性羊血清購于邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，編號(hào)MAB-036；電熱恒溫培養(yǎng)箱購于山東濰坊醫(yī)療器械廠，型號(hào)為420；微波爐購于上海松下微波爐有限公司，型號(hào)NN-Y21WF；冰箱購于河南新飛電器有限公司，型號(hào)BCD-215D；光學(xué)顯微鏡購于OLYMPUS，型號(hào)BX50；石蠟切片機(jī)購于LEIKA，型號(hào)RM2135；高壓鍋、電磁爐均購于美的電器公司。

1.2.2檢測(cè)方法 三組均通過Elivision TM plus法(免疫組織化學(xué)法)展開Survivin、PTEN、cdx2檢測(cè)，依據(jù)各抗體不同需求，對(duì)組織抗原進(jìn)行修復(fù)處理。(1)Survivin、cdx2選擇檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原法展開測(cè)定：①以檸檬酸緩沖液實(shí)施加熱，組織切片以二甲苯脫蠟、梯度酒精進(jìn)行水化處理，在蒸餾水中浸泡，待用。②在高壓鍋中置入1 500 ml檸檬酸緩沖液(pH 6.0)，大火加熱，沸騰后，置入脫蠟水化處理后的組織切片，將鍋蓋蓋上，加熱，噴氣后，計(jì)時(shí)15 min，取下高壓鍋，冷卻到室溫狀態(tài)，將切片取出，以蒸餾水進(jìn)行2次沖洗，再用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2～7.4)進(jìn)行2次沖洗，一次持續(xù)3 min。(2)PTEN應(yīng)用EDTA加熱水浴抗原修復(fù)法展開測(cè)定：①對(duì)組織進(jìn)行脫蠟水化處理，用蒸餾水進(jìn)行2次沖洗，取EDTA抗原修復(fù)液50 ml，依據(jù)1∶5進(jìn)行稀釋，提取500 ml工作液在燒杯(1 000 ml)中置入，得到500 ml工作液，在1 000 ml的燒杯中置入，加熱到沸騰狀態(tài)，緩慢地將組織切片置入其中，使切片被修復(fù)液充分浸泡，繼續(xù)進(jìn)行20 min的加熱，冷卻至室溫狀態(tài)，將切片取出，通過蒸餾水進(jìn)行1次沖洗，再用PBS進(jìn)行2次沖洗。②于每張切片中加入0.3%過氧化氫溶液50 ml，于室溫下進(jìn)行10 min的孵育，以達(dá)到對(duì)過氧化物酶活性進(jìn)行阻斷的目的。③取出切片，通過PBS進(jìn)行3次沖洗，去除PBS，于每張切片上滴加非免疫性羊血清50 μl，于室溫下進(jìn)行10 min的孵育。④將血清去除，于每張切片上滴加第一抗體50 μl，放入濕盒中，在4℃冰箱中保存過夜，取出切片，通過PBS進(jìn)行3次沖洗，甩干。⑤將50 μl對(duì)應(yīng)第一抗體相應(yīng)生物素標(biāo)記的第二抗體滴加在每片切片上，置入37℃溫箱中，進(jìn)行40 min的孵育，用PBS進(jìn)行3次沖洗，去除PBS，每張切片上加過氧化酶溶液50 μl，置入37℃的恒溫箱中進(jìn)行30 min孵育，用PBS實(shí)施3次沖洗。⑥將PBS液去除，每張切片上加二氨基聯(lián)苯胺(DAB) 100 μl，于顯微鏡下觀察3～10 min，依據(jù)陽性、陰性情況及時(shí)將反應(yīng)終止。⑦用自來水沖洗，通過蘇木素進(jìn)行復(fù)染處理，再用鹽酸酒精(1%)實(shí)施分化處理，用自來水沖洗，再以PBS行返藍(lán)處理，采用DAB實(shí)施顯色處理，用梯度酒精展開脫水干燥處理，經(jīng)二甲苯透明，用中性的樹膠封固。

1.3結(jié)果判定方法 Survivin是胞質(zhì)著色，PTEN是胞核、胞質(zhì)都著色，cdx2是胞核著色，若著色處有棕黃色的顆粒狀物質(zhì)，則為陽性結(jié)果〔4〕。其中，弱陽性：5%<且≤25%，中等陽性：25%<且≤75%，強(qiáng)陽性：>75%〔5〕。

1.4數(shù)據(jù)分析 采用SPSS20.0軟件t、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1晚期胃癌、胃黏膜增生性病變、正常胃黏膜組織中Survivin的表達(dá)情況 正常胃黏膜組織中未見陽性細(xì)胞；在不完全大腸型化生胃黏膜組織(15例)中，僅2例患者可見弱陽性表達(dá)，陽性率是13.33%(2/15)；在低級(jí)別上皮瘤變的胃黏膜組織(13例)中，5例患者可見中度陽性表達(dá)，陽性率是38.46%(5/13)，1例為弱陽性表達(dá)；在高級(jí)別的上皮內(nèi)瘤變胃黏膜組織(18例)中，12例可見陽性表達(dá)，陽性率為66.67%(12/18)，2例為弱陽性，8例為中度陽性，2例為強(qiáng)陽性，見圖1；43例晚期胃癌患者29例可見陽性表達(dá)，陽性率是67.44%(29/43)，12例為弱陽性，9例為中度陽性，8例為強(qiáng)陽性，見圖2。

圖1 胃黏膜組織survivin表達(dá)(DAB，×400)

2.2PTEN在晚期胃癌、胃黏膜增生性病變、正常胃黏膜組織中的表達(dá)情況 正常胃黏膜中，PTEN均呈陽性表達(dá)；15例不完全大腸化生中，13例可見陽性表達(dá)(86.67%)，其中，弱陽性有8例，中度陽性有3例，強(qiáng)陽性有2例；13例低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變中，8例(61.54%)可見陽性表達(dá)，其中，弱陽性有4例，中度陽性有3例，強(qiáng)陽性有1例；18例高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變中，9例(50.00%)可見陽性表達(dá)，其中，5例為弱陽性，3例為中度陽性，1例為強(qiáng)陽性；43例晚期胃癌中，13例(30.23%)可見陽性表達(dá)，見圖3。其中，5例為弱陽性表達(dá)，7例為中度陽性表達(dá)，1例為強(qiáng)陽性表達(dá)。

圖3 晚期胃癌中PTEN的陽性表達(dá)(DAB，×400)

2.3cdx2晚期胃癌、胃黏膜增生性病變、正常胃黏膜組織的表達(dá)情況 正常胃黏膜中cdx2未見表達(dá)；15例不完全大腸型化生中，11例(73.33%)可見陽性表達(dá)，2例為弱陽性，8例為中度陽性，1例為強(qiáng)陽性；13例低級(jí)別上皮內(nèi)瘤中，3例(23.08%)可見陽性表達(dá)，均為弱陽性，見圖4；18例高級(jí)別上皮內(nèi)瘤中，10例可見陽性表達(dá)，陽性率為55.56%(10/18)，2例為強(qiáng)陽性，8例為中度陽性，見圖5；43例晚期胃癌中，30例可見陽性表達(dá)，陽性率為69.77%(30/43)4例為弱陽性，23例為中度陽性，3例為強(qiáng)陽性，見圖6。

圖4 低級(jí)別上皮內(nèi)瘤cdx2表達(dá)(DAB，×400)

圖5 高級(jí)別上皮內(nèi)瘤cdx2表達(dá)(DAB，×400)

圖6 晚期胃癌中cdx2表達(dá)(DAB，×400)

2.4三組Survivin、PTEN、cdx2表達(dá)情況對(duì)比 胃癌組Survivin、cdx2陽性率明顯高于黏膜組、健康組，PTEN陽性率明顯低于黏膜組、健康組(均P<0.05)；黏膜組Survivin、cdx2陽性率明顯高于健康組(P<0.05)，兩組PTEN陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。在晚期胃癌患者中，Survivin陽性表達(dá)與cdx2呈正相關(guān)關(guān)系，與PTEN則呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，見表2。

表1 三組Survivin、PTEN、cdx2表達(dá)〔n(%)〕

表2 三個(gè)指標(biāo)在晚期胃癌患者表達(dá)的相關(guān)性(n)

1)胃癌組與黏膜組對(duì)比；2)胃癌組與健康組對(duì)比；3)黏膜組與健康組對(duì)比

3 討 論

胃癌是常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤的一種，對(duì)于此腫瘤，及早確診并及時(shí)展開手術(shù)治療是延長(zhǎng)患者生存期限的關(guān)鍵。晚期胃癌指的是腫瘤發(fā)生于胃黏膜內(nèi)、胃黏膜下，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移尚未出現(xiàn)的胃部腫瘤，一般可分為隆起型、表面型、凹陷型幾種〔6，7〕。但晚期胃癌與胃黏膜增生性病變有一定相似性，聯(lián)系性也較為緊密，如何準(zhǔn)確鑒別二者是晚期胃癌診斷的難點(diǎn)問題之一〔8，9〕。

胃黏膜增生指的是胃黏膜腺體干細(xì)胞發(fā)生的增生性病變的疾病，一般而言，胃黏膜增生性病變主要有以下幾個(gè)類型：(1)無不典型增生。此類型又包括以下幾種：①正常。即黏膜隱窩、固有的腺體、腺頸部、間質(zhì)位置完好，炎性浸潤(rùn)輕度或不可見〔10，11〕。②反應(yīng)性隱窩增生。即單純性增生，一般于消化性潰瘍、胃炎處發(fā)生。③腸化生，主要包括小腸型、不完全型兩種。(2)不確定的不典型增生?？梢姀澢?xì)長(zhǎng)的腺體結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核會(huì)被覆蓋，使黏液分泌減少甚至停止〔12〕。(3)胃黏膜上皮非典型增生。主要有低級(jí)別、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變兩種。(4)黏膜內(nèi)癌。即僅黏膜層受到癌組織的浸潤(rùn)〔13〕。

Survivin是凋亡抑制蛋白的一種，于1997年被發(fā)現(xiàn)，其中含有氨基酸142個(gè)，分子量是16.5 kD，在人類多數(shù)腫瘤細(xì)胞中均可見表達(dá)，在正常人中，一般僅在睪丸、分泌期的子宮內(nèi)膜、胸腺中表達(dá)〔14，15〕。此蛋白可對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生抑制性作用，使腫瘤細(xì)胞增殖。資料顯示〔16〕，Survivin會(huì)對(duì)腫瘤化療藥物的敏感性產(chǎn)生影響。正常胃黏膜-增生性病變-晚期癌細(xì)胞這一轉(zhuǎn)換過程中，Survivin表達(dá)也發(fā)生著進(jìn)行性的改變，低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變中，Survivin陽性細(xì)胞較正常胃黏膜多，且陽性細(xì)胞排列不具連續(xù)性；在高級(jí)別的上皮內(nèi)瘤變、晚期胃癌中，Survivin陽性細(xì)胞可見彌漫性的表達(dá)。此結(jié)果表明，對(duì)于增生性病變的胃黏膜，若可見較高的Survivin陽性率，且陽性細(xì)胞分布有連續(xù)性，則可能發(fā)生了晚期胃癌改變。提示，增生性胃黏膜病變可見高表達(dá)的Survivin，則預(yù)后較差，需進(jìn)一步展開確診是否為晚期胃癌病變，并及時(shí)予以干預(yù)，以使患者預(yù)后得以改善。

PTEN在維持細(xì)胞增殖、分化、凋亡中有重要作用，可使腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡刺激更為敏感，誘導(dǎo)凋亡出現(xiàn)〔17，18〕。本研究提示，對(duì)于Survivin陽性較高、PTEN陽性率較高的增生性胃黏膜病變，預(yù)后較差，需考慮是否已經(jīng)發(fā)生晚期胃癌或癌前病變。

cdx2 是人體腸道中的一種特異性轉(zhuǎn)錄因子，在維護(hù)腸胃細(xì)胞正常形態(tài)中意義重大〔19〕。本研究結(jié)果提示，cdx2是胃黏膜上皮化生的一個(gè)特異性標(biāo)志物，且在腸上皮化生到胃癌的發(fā)展過程中，cdx2均可發(fā)揮一定作用。因此，對(duì)晚期胃癌進(jìn)行鑒別診斷時(shí)，應(yīng)積極展開此指標(biāo)的檢測(cè)，依據(jù)其水平判斷患者預(yù)后情況，以便于施予針對(duì)性干預(yù)。

本研究結(jié)果還提示，在晚期胃癌、胃黏膜增生性病變中，Survivin、PTEN、cdx2表達(dá)有差異性，可將其視作晚期胃癌、胃黏膜增生性病變的鑒別診斷指標(biāo)。另外，在晚期胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，Survivin、PTEN、cdx2發(fā)揮的作用存在差異性，作用機(jī)制不同，但其之間存在相關(guān)性，Survivin、cdx2過度表達(dá)，PTEN低表達(dá)可作為晚期胃癌預(yù)后差的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

綜上，對(duì)晚期胃癌、胃黏膜增生性病變進(jìn)行診斷時(shí)，可積極展開Survivin、PTEN、cdx2檢測(cè)，并以此為依據(jù)判斷預(yù)后，有助于促進(jìn)患者預(yù)后質(zhì)量的改善。