超聲響應(yīng)性納米粒子用于超聲/光聲成像引導(dǎo)下聲動(dòng)力/饑餓治療小鼠結(jié)直腸癌

徐 偉，李 洋，顧海濤，張劍波，王志剛，王繼見*

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院胃腸外科，2.超聲科，重慶 400010；3.重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所 重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400010)

聲動(dòng)力治療(sonodynamic therapy， SDT)無創(chuàng)、操作簡(jiǎn)便、超聲穿透范圍深并可定點(diǎn)靶向輻照，廣泛用于治療腫瘤[1]，但腫瘤的異質(zhì)性和復(fù)雜性使單一治療方式無法達(dá)到根治效果[2]。通過阻斷營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)使腫瘤細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)成為抗腫瘤治療的潛在策略[3]。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療理念的提出，可視化治療成為目前研究熱點(diǎn)[4]。多模態(tài)成像可更加全面地獲取腫瘤影像學(xué)信息[5]。本研究將卟啉鋅(zinc porphyrin, TPZ)聲敏劑和葡萄糖氧化酶(glucose oxidase， GOD)裝載于脂質(zhì)體內(nèi)，制備超聲響應(yīng)性納米粒子(nanoparticles， NP)TPZ-GOD NP，以期實(shí)現(xiàn)超聲/光聲雙模態(tài)成像引導(dǎo)下聲動(dòng)力聯(lián)合饑餓治療小鼠結(jié)直腸癌。

1 材料與方法

1.1 主要?jiǎng)游铩⒉牧吓c儀器 37只無特定病原體(specific pathogen free， SPF)級(jí)雌性BALB/c小鼠，4～6周齡，體質(zhì)量18～25 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于室溫37℃、相對(duì)濕度40%～70%環(huán)境下，光照明暗周期12 h，自由采食與飲水。

二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dipalmitoyl phosphatidylcholine， DPPC)，二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇2000(distearoyl phosphoethanolamine-methoxy polyethylene glycol 2000， DSPE-mPEG 2000)及膽固醇(西安瑞禧有限生物科技有限公司)，3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine， TMB)，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase， HRP)，活性氧熒光探針2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH-DA)，GOD、TPZ及全氟戊烷(perfluoropentane， PFP)(Sigma)，三氯甲烷(重慶川東化工有限公司)，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibico)，胰酶(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8， CCK-8)(Dojindo)。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器有限公司)，聲振儀(Sonic)，Malvern Zetasizer Nano ZS90粒徑測(cè)量?jī)x，Hitachi S-3400N透射電鏡儀，BD流式細(xì)胞儀，UV2500-VIS紫外分光光度計(jì)，低強(qiáng)度聚集超聲(重慶醫(yī)科大學(xué)超聲分子影像學(xué)研制)，Esaote診斷超聲儀，Visual Sonics Vevo LASER光聲成像儀。

1.2 制備TPZ-GOD NP 采用薄膜水化法制備TPZ-GOD NP。按12∶4∶4∶5比例將DPPC、DSPE-mPEG 2000、膽固醇及TPZ溶解于三氯甲烷溶劑中，50℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)2 h，待圓底燒瓶?jī)?nèi)形成紫色薄膜時(shí)加入5 ml磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution， PBS)沖洗底部脂質(zhì)膜；于冰浴條件下超聲乳化200 μl(5 mg/ml)GOD和200 μl PFP，功率100 W，時(shí)間2 min(工作5 s間歇5 s)，之后將其加入上述脂質(zhì)膜溶液中繼續(xù)乳化3 min，功率同前，以低溫離心機(jī)離心5 min (5 000 rmp)，收集制備出的TPZ-GOD NP。

1.3 檢測(cè)基本性質(zhì) 以透射電鏡觀察TPZ-GOD NP形態(tài)、結(jié)構(gòu)，以馬爾文激光粒度儀檢測(cè)其粒徑；利用UV-2 500紫外分光光度計(jì)檢測(cè)TPZ與GOD的吸收光譜并繪制相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算TPZ與GOD的包封率與載藥量；檢測(cè)TPZ、GOD與TPZ-GOD NP紫外吸收?qǐng)D譜。采用TMB法驗(yàn)證TPZ-GOD NP中GOD活性，先配制pH 5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液、1 mg/ml的HRP水溶液、10 mmol/L的葡萄糖溶液以及含10 mg/ml的TMB二甲基亞砜溶液，按緩沖液、TPZ NP/GOD/TPZ-GOD NP、HRP、TMB、葡萄糖的順序混合溶液，待顯色后拍照。吸取上述溶液至96孔板，采用酶標(biāo)儀測(cè)定TMB吸光度值。將制備的TPZ-GOD NP置于EP管內(nèi)，以超聲輻照(功率2 W/cm2，頻率1 MHz)，200 kDa透析膜過濾溶液，收集液體后采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其吸光度值，計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)下GOD的累計(jì)釋放量，繪制GOD藥物釋放曲線。

1.4 細(xì)胞吞噬作用 體外培養(yǎng)結(jié)直腸癌CT-26細(xì)胞，胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，并以1×105個(gè)/孔的濃度接種于6孔板內(nèi)。24 h后棄置孔板內(nèi)培養(yǎng)基，加入濃度為1 mg/ml DiI修飾的TPZ-GOD NP無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1、2、3、4、24 h。待胰酶消化收集細(xì)胞，以流式細(xì)胞儀分析。

1.5 體外活性氧檢測(cè) 細(xì)胞接種于6孔板24 h后，將其分為對(duì)照組、超聲組、TPZ-GOD NP組及TPZ-GOD NP+超聲組。分別向后2組中加入TPZ-GOD NP溶液(1 mg/ml)，孵育3.5 h后加入DCFH-DA溶液繼續(xù)孵育0.5 h，以PBS洗去孔板內(nèi)的TPZ-GOD NP和未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，再對(duì)超聲組及TPZ-GOD NP+超聲組施加超聲輻照30 s，以熒光顯微鏡觀察各組熒光強(qiáng)度。

1.6 體外SDT聯(lián)合饑餓治療 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的濃度接種于96孔板內(nèi)，將細(xì)胞分為對(duì)照組、超聲組、SDT組、饑餓治療組及聯(lián)合治療組，每組5個(gè)復(fù)孔。待各孔內(nèi)細(xì)胞密度至80%后，對(duì)SDT組加入TPZ NP，饑餓治療組及聯(lián)合治療組均加入TPZ-GOD NP溶液(1 mg/ml)，孵育4 h；以PBS洗滌孔板3次后，對(duì)超聲組、SDT組及聯(lián)合治療組施加超聲輻照30 s；加入CCK-8溶液，檢測(cè)各組細(xì)胞活性。另將細(xì)胞培養(yǎng)于共聚焦培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%、予相同處理后加入鈣黃綠素/碘化吡啶染料染色，于激光共聚焦下觀察細(xì)胞顏色。

1.7 體外超聲/光聲成像 將不同濃度TPZ-GOD NP(100、200、300、400、500 μg/ml)轉(zhuǎn)入凝膠膜型中，超聲輻照30 s，之后采集超聲造影(contrast enhanced ultrasound， CEUS)圖像。將TPZ-GOD NP溶液(2.5 mg/ml)注入凝膠模型中，行光聲激光儀全波長(zhǎng)(680～970 nm)掃描，獲取最佳激發(fā)波長(zhǎng)。體外配置TPZ-GOD NP(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/ml)溶液，以移液器吸取100 μl至凝膠模型中，以最佳激發(fā)波長(zhǎng)照射，采集相應(yīng)濃度光聲成像圖，定量分析ROI光聲信號(hào)值。

1.8 模型制備及體內(nèi)超聲/光聲成像 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CT-26細(xì)胞，以0.25%胰酶消化后離心重懸。將0.1 ml細(xì)胞懸液(約1×106個(gè))于小鼠背部皮下注射，使之形成皮丘；待腫瘤體積約100 mm3時(shí)，以Esaote超聲診斷儀，頻率7 MHz線陣探頭采集二維超聲聲像圖。對(duì)3只小鼠經(jīng)尾靜脈注射200 μl TPZ-GOD NP溶液(5 mg/ml)，超聲激發(fā)并即刻行腫瘤CEUS。另取3只小鼠行體內(nèi)光聲成像，分別于經(jīng)尾靜脈注射NP前后采集腫瘤光聲成像圖。

1.9 體內(nèi)SDT聯(lián)合饑餓治療 對(duì)6只小鼠尾靜脈注射DIR熒光染料標(biāo)記TPZ-GOD NP溶液(5 mg/ml)，于注射后0.5、1、2、4、6、8、24 h經(jīng)眼球內(nèi)眥靜脈取血，測(cè)量DIR熒光強(qiáng)度，繪制體內(nèi)血液代謝曲線，計(jì)算TPZ-GOD NP半衰期。 8 h后處死小鼠，剖取腫瘤、心、肝、脾、肺、腎組織，測(cè)量其內(nèi)熒光強(qiáng)度。

將其余25只移植瘤小鼠隨機(jī)分為5組(n=5)，同1.6。經(jīng)尾靜脈注射TPZ-GOD NP(5 mg/ml)8 h后，對(duì)超聲組、SDT組及聯(lián)合治療組以超聲輻照小鼠腫瘤區(qū)域10 min，間隔5天重復(fù)，期間監(jiān)測(cè)小鼠重量與腫瘤體積。15天后處死小鼠并剝離腫瘤，稱重、切片后行HE染色。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。以±s表示計(jì)量資料，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TPZ-GOD NP基本性狀 透射電鏡下TPZ-GOD NP呈球形，大小均一(圖1A)，平均粒徑(262.10±62.92)nm；其中TPZ包封率(76.83±6.07)%、載藥量(14.78±1.16)%，GOD包封率(14.67±3.01)%、載藥量(0.56±0.12)%。TPZ-GOD NP紫外吸收光譜可見2個(gè)峰值(257 nm與425 nm處)，即TPZ-GOD NP成功包裹TPZ和GOD(圖1B)。酶活性檢測(cè)見GOD和TPZ-GOD NP溶液呈現(xiàn)明顯藍(lán)色，而TPZ NP溶液顏色未發(fā)生改變(圖1C)；GOD和TPZ-GOD NP的TMB OD值升高(圖1D)。超聲輻照后TPZ-GOD NP釋放 GOD量逐漸增加，隨時(shí)間延長(zhǎng)，藥物濃度增加，于240 s達(dá)到峰值[(78.60±4.62)%]，300 s后逐漸平穩(wěn)[(77.52±2.89)%](圖1E)。

圖1 TPZ-GOD NP基本性狀 A.透射電鏡圖； B.紫外吸收峰圖； C.GOD酶活性反應(yīng)； D.GOD酶活性反應(yīng)后吸光度值； E.超聲激發(fā)后TPZ-GOD NP中GOD藥物釋放曲線

2.2 細(xì)胞吞噬作用 DiI修飾的TPZ-GOD NP與CT-26細(xì)胞共同孵育后細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，4 h后熒光強(qiáng)度值達(dá)到峰值(58.95±6.44)%，24 h后呈下降趨勢(shì)。

2.3 體外活性氧檢測(cè) 熒光顯微鏡下見超聲激發(fā)后TPZ-GOD NP產(chǎn)生大量細(xì)胞毒性活性氧，呈明顯綠色熒光；TPZ-GOD NP組可見微弱熒光，其余2組幾無熒光(圖2)。

圖2 熒光顯微鏡下觀察各組活性氧 A.對(duì)照組； B.超聲組； C.TPZ-GOD NP組； D.TPZ-GOD NP+超聲組

2.4 體外SDT聯(lián)合腫瘤饑餓治療 CCK-8結(jié)果顯示，超聲輻照后，聯(lián)合治療組細(xì)胞存活率明顯低于其余各組(P均<0.05)，見圖3。激光共聚焦顯微鏡下見聯(lián)合治療組細(xì)胞呈紅色熒光，即明顯凋亡/壞死；SDT組與饑餓治療組見較多綠色熒光；對(duì)照組及超聲組細(xì)胞呈綠色熒光(圖4)。

圖3 各組細(xì)胞存活率比較

圖4 體外鈣黃綠素/碘化吡啶雙染色CT-26細(xì)胞圖 A.對(duì)照組； B.超聲組； C.SDT組； D.饑餓治療組； E.聯(lián)合治療組 (紅色為死亡細(xì)胞，綠色為存活細(xì)胞)

2.5 雙模態(tài)成像 體外CEUS顯示，隨著TPZ-GOD NP濃度增加，超聲顯影效果越強(qiáng)(圖5)，超聲信號(hào)逐漸增強(qiáng)。680～970 nm波段激發(fā)下，TPZ-GOD NP產(chǎn)生光聲信號(hào)，強(qiáng)度值在790 nm處最大。體外光聲成像顯示，隨納米酶濃度增加，光聲信號(hào)值逐漸增加，呈明顯線性增強(qiáng)(圖6)。經(jīng)尾靜脈注射TPZ-GOD NP后，二維超聲及CEUS均可見腫瘤區(qū)域超聲信號(hào)值顯著增高(P均<0.05)，見圖7。體內(nèi)光聲成像中，注射TPZ-GOD NP后，腫瘤內(nèi)光聲信號(hào)較注射前明顯增加(P<0.05)，見圖8。

圖5 體外CEUS圖

圖6 體外不同濃度TPZ-GOD NP光聲信號(hào)

圖7 小鼠體內(nèi)超聲圖像

圖8 小鼠體內(nèi)光聲成像圖

2.6 體內(nèi)SDT聯(lián)合腫瘤饑餓治療 小鼠體內(nèi)TPZ-GOD NP半衰期為17.32 h。注射后TPZ-GOD主要分布于肝臟、脾臟，富集于腫瘤內(nèi)。聯(lián)合治療組腫瘤生長(zhǎng)緩慢，平均(0.19±0.04)g，明顯小于其他各組(P均<0.05)，抑瘤率高達(dá)(73.13±5.14)%。各組小鼠體質(zhì)量均無明顯變化(P均>0.05)。病理結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組腫瘤細(xì)胞損傷嚴(yán)重，見大量核固縮、核溶解與核壞死；其余各組內(nèi)仍存在較多腫瘤細(xì)胞(圖9)。

圖9 小鼠移植瘤病理圖(HE，×400) A.對(duì)照組； B.超聲組； C.SDT組； D.饑餓治療組； E.聯(lián)合治療組

3 討論

SDT是在光動(dòng)力治療(photodynamic therapy， PDT)基礎(chǔ)上發(fā)展而來的新型無創(chuàng)治療腫瘤技術(shù)[6]，利用聲敏劑與氧在超聲作用下產(chǎn)生具有生物毒性的活性氧而殺傷腫瘤細(xì)胞[7]，但殺傷效率有限。近年針對(duì)腫瘤微環(huán)境進(jìn)行治療逐漸受到重視。腫瘤較正常組織細(xì)胞需要更多葡萄糖以供生長(zhǎng)[8]；GOD對(duì)β-D-葡萄糖具有高效催化性能及良好的生物安全性[9]。聯(lián)合應(yīng)用聲動(dòng)力治療與GOD消耗葡萄糖產(chǎn)生的饑餓效應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)聲動(dòng)力/饑餓聯(lián)合治療。

卟啉類化合物可增強(qiáng)多種影像學(xué)成像[10]。TPZ結(jié)構(gòu)明確、性質(zhì)穩(wěn)定、活性氧產(chǎn)量高，可較強(qiáng)吸收超聲聲能，且鋅金屬有利于產(chǎn)生單線態(tài)氧[11]，但為脂溶性有機(jī)物，不溶于水，生物利用度較低。本研究將聲敏劑TPZ裝載于脂質(zhì)體殼層，以改善其溶解性能；超聲輻照下可釋放大量活性氧而產(chǎn)生SDT效應(yīng)，同時(shí)可發(fā)生“聲致相變”，即液態(tài)PFP在超聲作用下氣化，使探針由納米級(jí)顆粒變成微氣泡，以增強(qiáng)超聲顯像；此后探針發(fā)生爆炸，釋放GOD，與葡萄糖發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生饑餓效應(yīng)而殺傷腫瘤細(xì)胞。

本研究制備的裝載磷脂的TPZ/GOD納米顆粒形態(tài)均一，在水中的分散性好，可憑借腫瘤血管的高通透性和滯留效應(yīng)透過腫瘤血管內(nèi)皮間隙，經(jīng)超聲輻照實(shí)現(xiàn)SDT；“聲致相變”產(chǎn)生微氣泡增強(qiáng)超聲信號(hào)，局部定點(diǎn)可控釋放GOD而實(shí)現(xiàn)SDT。除本身可作為治療劑外，本研究制備的聲敏納米酶顆粒還可作為光聲/超聲分子造影劑，超聲輻照下殼層內(nèi)PFP發(fā)生液氣相變，增強(qiáng)CEUS效果。體外實(shí)驗(yàn)顯示，激光照射后，光聲信號(hào)值在690 nm處出現(xiàn)峰值；體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)TPZ成功包裹于NP內(nèi)，并可用作光聲成像造影劑。雙模態(tài)成像支持對(duì)比分析2種不同的成像方式，可取長(zhǎng)補(bǔ)短，綜合得出更豐富的影像學(xué)信息[12]。

本研究制備的相變型聲敏納米酶顆粒在體外成功被CT-26細(xì)胞吞噬。TPZ-GOD NP+超聲組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯高于其余各組，提示活性氧產(chǎn)量較大，為SDT提供了理論基礎(chǔ)；體外聯(lián)合治療組細(xì)胞存活率最低，而其余各組細(xì)胞仍有大量存活，初步證實(shí)了聯(lián)合治療的作用；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合治療組可顯著抑制小鼠腫瘤生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)期間小鼠體質(zhì)量未發(fā)生明顯改變。

總之，本研究成功制備的超聲響應(yīng)性TPZ-GOD NP可用于超聲/光聲雙模態(tài)成像引導(dǎo)下聲動(dòng)力聯(lián)合饑餓治療小鼠結(jié)直腸癌，為治療腫瘤提供了新的思路和方法。